Caspase 4 活性检测试剂盒(比色法)
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Caspase 4活性检测试剂盒(比色法)
简介：
Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)家族在介导细胞凋亡过程的起着极其重要的作用，其成员包括Caspase1～11等，均属于蛋白酶家族。
Caspase 4又称Caspase-4，可以和Apaf-1、Caspase 14相互作用，并可和细胞细胞色素C 一起激活Caspase 3。
Leagene Caspase 4活性检测试剂盒(比色法) (Caspase 4 Colorimetric Assay Kit) 的检测原理是利用Caspase 4催化底物acetyl-Leu-Glu-Val-Asp p -nitroanilide (Ac-LEVD
-p NA)产生黄色的游离硝基苯胺p NA(p -nitroaniline)，通过测定分光光度比色法测定p NA 吸光值，从而间接获得caspase 4的活性。
组成：
自备材料：
1、 水浴锅或恒温箱
2、 96孔板
3、 酶标仪或分光光度计
操作步骤(仅供参考)：
1、 制备标准曲线：
① C aspase Lysis buffer ：Assay buffer 按照一定的比例配制适量的标准品稀释液。
② 用标准品稀释液稀释p NA(10mM)，使p NA 分别达到200μM 、100μM 、50μM 、
25μM 、12.5μM 、6.25μM ，另外设置一管不加p NA 仅含标准品稀释液作为零管，把以上系列浓度物质作为标准品。
③ 取p NA 浓度分别为200μM 、100μM 、50μM 、25μM 、12.5μM 、6.25μM 、0
的标准品各100 μl 加入至孔板或取适量体积加入至容量不超过100μl 的比色杯，
编号 名称
CT0116 50T CT0116 100T Storage
试剂(A): Caspase Lysis buffer 10ml 20ml 4℃ 试剂(B): Assay buffer
10ml 20ml 4℃ 试剂(C): Ac-LEVD-p NA(2mM) 0.25ml ×2 0.25ml ×4 -20℃ 避光 试剂(D): p NA(10mM) 0.25ml ×2
0.25ml ×4
-20℃ 避光
使用说明书
1份
测定405nm处吸光值即A405。
④用每一个标准品的A405减去不含p NA的空白对照的A405，计算出实际的吸光值。
以每个浓度的标准品A405为x轴，以对应的p NA浓度为y轴，用Excel制作p NA 浓度对A405值的标准曲线。
2、样品裂解：
①悬浮细胞：取实验样品和对照样品，离心收集细胞，小心吸除上清，同时确保尽量
没有细胞被吸除，PBS洗涤一次，再次小心吸除上清。
按每2~10×106细胞加入Caspase Lysis buffer的比例加入Caspase Lysis buffer，重悬细胞沉淀，冰浴裂解。
②贴壁细胞：弃细胞培养液，用胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集至细胞培养液，1000g
离心，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次，再次小心吸除上清。
按照每2~10×106细胞加入Caspase Lysis buffer的比例加入Caspase Lysis buffer，重悬细胞沉淀，冰浴裂解。
③组织样品：按每组织加入Caspase Lysis buffer的比例加入Caspase Lysis buffer，
冰浴上用玻璃匀浆器匀浆并转移至离心管中，冰浴裂解。
④离心，取上清至新的离心管。
立即测定Caspase 4的酶活性或-70℃保存样品。
⑤蛋白定量：由于Caspase Lysis buffer含还原剂不宜采用BCA法，可采用Bradford
法测定蛋白浓度。
以蛋白浓度达到1～3mg/ml为佳，否则应增加细胞或组织的量。
3、样品检测：
①按照下表设置96孔板反应体系，溶液应按照顺序依次加入，即Assay buffer→待
测样品→Ac-LEVD-p NA(2mM)。
同时应设置不加待测样品的反应孔作为空白对照。
酶活性过低或过高，可增加或减少待测样品的用量，大多数情况下，每个反应体系加入10～15μl待测样品即可，并注意避免产生气泡。
空白对照高酶活性样品低酶活性样品Assay buffer 90μl 85μl 65μl
待测样品0μl 5μl 25μl
Ac-LEVD-p NA(2mM) 10μl 10μl 10μl
总体积100μl 100μl 100μl
②孵育：盖紧96孔板，37℃孵育6。
肉眼可见颜色发生变化时，即可进行A405检测；
如果颜色变化不明显，可适当延长孵育时间甚至过夜。
③待测样品A405分别减去空白对照A405即为样品Caspase 4水解底物产生的p NA
吸光值，根据标准曲线即可获得酶的含量。
④用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT，不
适合采用BCA法进行蛋白浓度测定)，进而计算出一个样品单位重量蛋白中所含的
caspase 4的酶活力单位即Caspase 4酶活力单位/mg protein。
计算结果：
①Caspase 4酶活力单位的定义：One unit is the amount of enzyme that will
cleave 1.0 nmol of the colorimetric substrate Ac-LEVD-p NA per hour at 37℃under saturated substrate concentrations，即当底物饱和时，在37℃一个小时内可以剪切1nmol Ac-YVAD-p NA产生1nmol p NA的caspase 4的酶量。
根据p NA标准曲线和样品A405值，可计算出Caspase 4酶活力单位。
说明：底物的起始浓度为0.2mM，此时底物是饱和的，对于许多样品而言在37℃孵育2个小时以内底物都是饱和的；对于样品中Caspase 4酶活力特别高的情况，须用Caspase Lysis buffer适当稀释样品后再进行测定。
②Caspase 4酶活性的另外一种表示方法是Caspase活性增加的百分比即实验处理
组A405/实验对照组A405×100%，简单而可靠，可粗略的反应酶活性情况。
注意事项：
1、建议每次测定时都做标准曲线，以使标准更准确，另外标准品需避免反复冻融。
2、如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检
测体积，尽量采用100μl体积以内的比色杯。
3、所测样本的值高于标准曲线的上限，应用裂解液稀释样品后重新测定。
4、样品蛋白有效含量过低或Caspase激活水平过低都会导致实际测得的A405过低，应注
意使蛋白浓度尽量达到1～3μg/ml，调整诱导凋亡的时间和条件。
5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
有效期：12个月有效。
相关：
编号名称
CC0007 磷酸缓冲盐溶液(10×PBS,无钙镁)
DC0032 Masson三色染色液
DF0135 多聚甲醛溶液(4% PFA)
DG0005 糖原PAS染色液
PW0040 Western blot一抗稀释液。
