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Caspase 3 活性检测试剂盒(比色法)

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Caspase 3活性检测试剂盒(比色法)
简介：
Caspase 3又称CPP32、Yama 、apopain 、Caspase-3，属于CED-3亚家族，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。

Caspase 3活性检测试剂盒(比色法) (Caspase 3 Colorimetric Assay Kit)的检测原理是利用Caspase 3催化底物p -nitroanilide (Ac-DEVD-p NA)产生黄色的游离硝基苯胺p NA(p -nitroaniline)，通过分光光度比色法测定p NA 在400～410nm 处吸光值，从而间接获得caspase 3的活性。

组成：
操作步骤(仅供参考)：
1、 制备标准曲线：
①_x0001_
按照Caspase Lysis buffer ：Assay buffer=1:9的比例配制适量的标准品稀释液。

②_x0001_ 用标准品稀释液稀释p NA(10mM)，另外设置一管不加p NA 仅含标准品稀释液作为零管，把以上系列浓度物质作为标准品。

③_x0001_
取p NA 浓度分别为200μM 、100μM 、50μM 、25μM 、12.5μM 、6.25
μM 、0的标准品各100 μl 加入至96孔板或取适量体积加入至容量不超过100μl 的比色杯，测定405nm 处吸光值即A 405。

④_x0001_
用每一个标准品的A 405减去不含p NA 的空白对照的A 405，计算出实际
的吸光值。

以每个浓度的标准品A 405为x 轴，以对应的p NA 浓度为y 轴，用Excel 制作p NA 浓度对A 405值的标准曲线。

2、 样品裂解：
①_x0001_
悬浮细胞：取实验样品和对照样品，离心收集细胞，小心吸除上清，同
时确保尽量没有细胞被吸除，PBS 洗涤一次，再次小心吸除上清。

按每2~10×106细胞加入Caspase Lysis buffer 的比例加入Caspase Lysis buffer ，重悬细胞沉淀冰浴裂解。

②_x0001_
贴壁细胞：弃细胞培养液，用胰蛋白酶消化贴壁细胞，收集至细胞培养
编号 名称
CT0111 50T CT0111 100T Storage
试剂(A): Caspase Lysis buffer 10ml 20ml 4℃ 试剂(B): Assay buffer
10ml 20ml 4℃ 试剂(C): Ac-DEVD-p NA(2mM) 0.25ml ×2 0.25ml ×4 -20℃ 避光 试剂(D): p NA(10mM) 0.25ml ×2
0.25ml ×4
-20℃ 避光
使用说明书
1份
液，离心，小心吸除上清，同时确保尽量没有细胞被吸除，PBS洗涤一次，再次小心吸除上清。

按照每2~10×106细胞加入Caspase Lysis buffer的比例加入Caspase Lysis buffer，重悬细胞沉淀冰浴裂解。

③_x0001_组织样品：按每3～10mg组织加入Caspase Lysis buffer的比例加入
Caspase Lysis buffer，冰浴上用玻璃匀浆器匀浆并转移至1.5ml离心管中冰浴裂解。

④_x0001_离心取上清至新的1.5ml离心管。

立即测定Caspase 3的酶活性或-70℃
保存样品。

⑤_x0001_蛋白定量：由于Caspase Lysis buffer含还原剂不宜采用BCA法，可采
用Bradford法测定蛋白浓度。

以蛋白浓度达到1～3mg/ml为佳，否则应增加细胞或组织的量。

3、样品检测：
①按照下表设置96孔板反应体系，溶液应按照顺序依次加入，即Assay buffer→待
测样品→Ac-DEVD-p NA(2mM)，大多数情况下，每个反应体系加入10～15μl待测样品即可，并注意避免产生气泡。

空白对照高酶活性样品低酶活性样品Assay buffer 90μl 85μl 65μl
待测样品0μl 5μl 25μl
Ac-DEVD-p NA(2mM) 10μl 10μl 10μl
总体积100μl 100μl 100μl
②孵育：盖紧96孔板孵育。

肉眼可见颜色发生变化时，即可进行A405检测；如果颜
色变化不明显，可适当延长孵育时间甚至过夜。

③待测样品A405分别减去空白对照A405即为样品Caspase 3水解底物产生的p NA
吸光值，根据标准曲线即可获得酶的含量。

④用Bradford法检测待测样品中的蛋白浓度(由于裂解液中含有较高浓度的DTT，不
适合采用BCA法进行蛋白浓度测定)，进而计算出一个样品单位重量蛋白中所含的caspase 3的酶活力单位即Caspase 3酶活力单位/mg protein。

计算结果：
①Caspase 3酶活力单位的定义：即当底物饱和时，在37℃一个小时内可以剪切
1nmol Ac-DEVD-p NA产生1nmol p NA的caspase 3的酶量。

根据p NA标准曲线和样品A405值，可计算出Caspase 3酶活力单位。

②Caspase 3酶活性的另外一种表示方法是Caspase活性增加的百分比即实验处理
组A405/实验对照组A405×100%，简单而可靠，可粗略的反应酶活性情况。

注意事项：
1、建议每次测定时都做标准曲线，以使标准更准确，另外标准品需避免反复冻融。

2、如果没有酶标仪，也可以使用普通的分光光度计测定，但应考虑根据比色杯的最小检
测体积，尽量采用100μl体积以内的比色杯。

3、所测样本的值高于标准曲线的上限，应用裂解液稀释样品后重新测定。

4、样品蛋白有效含量过低或Caspase激活水平过低都会导致实际测得的A405过低，应注
意使蛋白浓度尽量达到1～3μg/ml，调整诱导凋亡的时间和条件。

5、为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。

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Caspase活性检测说明书

Caspase活性检测说明书

Caspase活性检测（基于p NA标记底物的比色法）在caspase 的底物多肽上标记发色团如：p NA，可用于检测凋亡细胞中的caspase活性及筛选caspases的激活剂或抑制剂。

本操作步骤主要针对使用酶标仪进行读数而设计。

其中使用的细胞抽提物、底物、抑制剂及p NA的用量为每个样本140ul。

若您希望设计针对分光光度计读数的实验，建议对每种溶液体积进行进一步优化。

所需溶液、试剂及设备• Caspase底物• Caspase抑制剂• 细胞裂解缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 1mM DTT, 100uM EDTA • 检测缓冲液：50mM HEPES, pH7.4, 100mM NaCl, 0.1%CHAPS, 10mM DTT, 100uM EDTA, 10%Glycerol• PBS：将8g NaCl、200mg KCl和1.44g Na2HPO4溶于800ml蒸馏水；用HCl调至pH7.4；定容至1L• 酶标板和酶标仪其它试剂(推荐)• 纯化的Caspase（阳性对照）• p NA细胞抽提物的制备以适合的凋亡诱导剂对细胞进行诱导（参考前述操作方法），同时做阴性对照，包括未处理细胞、用诱导剂的无诱导活性类似物处理细胞（若可得到），或一个凋亡诱导处理“零时间”样品。

应保证有足够细胞进行重复实验，包含或不含抑制剂的对照以检测蛋白浓度。

一般来说，我们下面推荐的裂解前细胞数量可以产生足够蛋白浓度供酶标仪检测；然而不同大小、体积的细胞及蛋白浓度可能需要增加铺板密度。

当裂解2×107/ml细胞是，产生的蛋白浓度约为1-3mg/ml，体积10ul，含约10-30ug蛋白。

依据其细胞系，最少应有106个细胞，体积50ul的裂解缓冲液进行处理。

• 细胞计数，离心收集细胞。

以PBS缓冲液洗涤一次。

若细胞已被caspase抑制剂处理过，建议多洗几次以防止后继实验中可能造成的不利影响。

NucView488 caspase-3活性检测双功能试剂盒

NucView488 caspase-3活性检测双功能试剂盒

NucView TM488 CASPASE-3主要特点：在活细胞中检测Caspase-3并染色细胞核DNA直接加入细胞培液,孵育15-30分钟后即可检测，无需清洗残余染料兼容使用荧光素滤光片的流式细胞仪和荧光显微镜可固定染色NucView TM488 CASPASE-3底物是一种新型的细胞膜渗透性用于检测活细胞内caspase-3的实时活动的荧光蛋白酶底物。

细胞凋亡率从细胞到细胞会有典型的变化，即使在相同的细胞数。

结果导致各种凋亡事件或凋亡标志物，伴随着细胞凋亡过程会出现在不同的细胞中。

因此，关键是要能够探测到在单个细胞基础上的这些凋亡事件。

传统上，caspase活性使用防渗膜荧光酶底物DEVD-R110，或荧光标记抑制物如FLICA试剂等检测。

在前一种情况下，细胞需裂解，从而排除在活细胞caspase活性的检测。

此外，这种蛋白酶检测方法只能在特定时间段的高度异质性细胞群中检测平均caspase活性。

在后一种情况下，虽然FLICA试剂可以进入活细胞检测caspase的活性，但只有最初的荧光信号，可以真实地反映酶的活性或细胞凋亡的状态，因为初始“快照”后的任何检测到的信号都需要考虑酶和细胞凋亡本身抑制剂的潜在干扰。

与传统的caspase检测不同，NucViewTM 488 Caspase-3底物以互不影响的方式检测完整单个细胞内caspase-3活性。

基底由一个荧光的DNA染料和caspase-3特异性的DEVD底物组成。

基底，一种无荧光及功能的DNA染料，可以迅速穿过细胞膜进入细胞质中，经过caspase-3酶的裂解作用，形成一个高亲和力的DNA染料。

释放的DNA染料迁移到细胞核染色细胞核成明亮的绿色。

这样的NucViewTM 488 caspase-3的基板是双向功能，能够在检测细胞内的caspase-3的同时染色细胞核，即可以观察细胞凋亡中细胞核的形态学变化。

caspase-3活性荧光染色是通过标准的固定方法（在3.75％，甲醛PBS用于固定，0.5％的Triton X-100PBS用于细胞通透性），从而促进后续的染色研究。

斑马鱼(Zebrafish)半胱氨酸蛋白酶3(Casp-3)ELISA试剂盒说明书

斑马鱼(Zebrafish)半胱氨酸蛋白酶3(Casp-3)ELISA试剂盒说明书

本试剂盒只能用于科学研究，不得用于医学诊断斑马鱼（Zebrafish）半胱氨酸蛋白酶3（Casp-3）ELISA检测试剂盒使用说明书检测原理试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。

往预先包被半胱氨酸蛋白酶3（Casp-3）抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。

用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。

颜色的深浅和样品中的半胱氨酸蛋白酶3（Casp-3）呈正相关。

用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

样品收集、处理及保存方法1.血清：使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，收集血液后，3000转离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。

2.血浆：EDTA、柠檬酸盐或肝素抗凝。

3000转离心30分钟取上清。

3.细胞上清液：3000转离心10分钟去除颗粒和聚合物。

4.组织匀浆：将组织加入适量生理盐水捣碎。

3000转离心10分钟取上清。

5.保存：如果样本收集后不及时检测，请按一次用量分装，冻存于-20℃，避免反复冻融，在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。

自备物品1.酶标仪（450nm）2.高精度加样器及枪头：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL3.37℃恒温箱操作注意事项1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。

从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。

4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.所有液体组分使用前充分摇匀。

试剂盒组成名称96孔配置48孔配置备注微孔酶标板12孔×8条12孔×4条无标准品0.3mL*6管0.3mL*6管无样本稀释液6mL3mL无检测抗体-HRP10mL5mL无20×洗涤缓冲液25mL15mL按说明书进行稀释底物A6mL3mL无底物B6mL3mL无终止液6mL3mL无封板膜2张2张无说明书1份1份无自封袋1个1个无注：标准品（S0-S5）浓度依次为：0、3、6、12、24、48pmol/L试剂的准备20×洗涤缓冲液的稀释：蒸馏水按1：20稀释，即1份的20×洗涤缓冲液加19份的蒸馏水。

细胞凋亡中Caspase-3活性的检测

细胞凋亡中Caspase-3活性的检测

细胞凋亡中Caspase-3活性的检测关键词：细胞凋亡活性检测执行分子 2012-09-27 18:04 来源：互联网点击次数：5249Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用，其中caspase-3为关键的执行分子，它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。

Caspase-3正常以酶原（32KD）的形式存在于胞浆中，在凋亡的早期阶段，它被激活，活化的Caspase-3由两个大亚基（17KD）和两个小亚基（12KD）组成，裂解相应的胞浆胞核底物，最终导致细胞凋亡。

但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞，caspase-3的活性明显下降。

1 Western blot 分析Procaspase-3的活化，以及活化的Caspase-3及对底物多聚（ADP-核糖）聚合酶[poly（ADP-ribose）polymerase，PARP]等的裂解。

方法：收集细胞→PBS洗涤→抽提细胞裂解液→蛋白定量→SDS-PAGE电泳→硝酸纤维素膜或PVDF膜转移→5%脱脂奶粉封闭，室温1.5~2h或4°C过夜→Caspase-3多抗或单抗室温反应1~2h或4°C过夜→TBS-T（含0.05% Tween 20的TBS）洗3次，5~10min/次→H RP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1~2h→ TBS-T洗3次， 5~10min/次?→ECL显影或NBT/BCIP显色。

结果如下图2 荧光分光光度计分析原理：活化的Caspase-3能够特异切割D1E2V3D4-X底物，水解D4-X肽键。

根据这一特点，设计出荧光物质偶联的短肽Ac-DEVD-AMC。

在共价偶联时，AMC不能被激发荧光，短肽被水解后释放出AMC，自由的AMC才能被激发发射荧光。

根据释放的AMC荧光强度的大小，可以测定caspase-3的活性，从而反映Caspase-3被活化的程度。

方法：收获细胞正常或凋亡细胞?PBS洗涤?制备细胞裂解液?加Ac-DEVD-AMC （caspase-3四肽荧光底物）?37°C反应1h?荧光分光光度计（Polarstar）分析荧光强度（激发光波长380nm，发射光波长为430-460nm）。