RUNX3基因真核表达载体的构建及其在乳腺癌T47D细胞中的表达

人内皮抑素基因腺病毒表达载体的构建及其在乳腺癌细胞中的表达活性【关键词】内皮抑素腺病毒基因治疗抗血管治疗乳腺癌0 引言近年来，阻止肿瘤血管生成，控制肿瘤的生长和转移，成为肿瘤治疗的一项新策略［1，2］，其中采用转染血管生成抑制剂拮抗血管的生成，以内皮抑素最为理想［3］。

本文通过构建人内皮抑素基因的腺病毒表达载体，研究内皮抑素在乳腺癌细胞中的表达，为进一步研究乳腺癌的抗血管基因治疗做好准备。

1 材料与方法1.1 材料携带人内皮抑素基因（human endostatin,hE）的质粒pBlast hEndostatin购于美国InvitroGen公司；腺病毒载体pCA13、pBGHE3及293细胞株购于Microbix Biosystems公司；人乳腺癌细胞株MBD 231和MCF7、人脐静脉内皮细胞株ECV304购于美国ATCC 细胞库；LipofectAMINE2000转染试剂盒购自GibcoBRL公司；各种限制性内切酶和DNA连接酶购自NEB公司；QIAprep spin miniprepkit、QIAamp DNA Blood Mini Kit购自QIAGEN公司；MPER Mammalian Protein Extraction Reagent购自PIERCE公司；Western显色液LumiGLO chemiluminescent reagent and peroxide为Cell Signaling Technology公司产品；鼠抗人hE单克隆抗体、FITC标记的羊抗鼠IgG抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG抗体购自武汉博士德公司；携带报告基因LacZ的增殖缺陷型腺病毒Ad LacZ由东方肝胆外科医院病毒与基因治疗研究室保存。

1.2 腺病毒载体质粒pAd hE的构建根据GenBank AF184060基因序列（555bp），在hE基因上下游分别设计引物，上游引物P1: 5’CGGAATTCACCATGCACAGCCACCGC3’, 下游引物P2: 5’GCTCTAGATTACTACTTGGAGGCAGT3’。

ClC—3荧光真核表达载体的构建及表达目的构建表达ClC-3的荧光真核表达载体，为研究其在肿瘤细胞中的作用提供分子工具。

方法将ClC-3的编码序列亚克隆到pEGFP-N1质粒，构建荧光真核表达载体pEGFP-N1/ClC-3，利用脂质体介导将ClC-3基因导入人乳腺癌细胞MCF-7内，通过绿色荧光观察检测基因的表达。

结果成功构建荧光真核表达载体pEGFP-N1/ClC-3，该载体转染MCF-7细胞后，可观察到绿色荧光。

结论表达ClC-3的荧光真核表达载体构建成功，并在乳腺癌细胞中得到正确表达，为进一步研究ClC-3在乳腺癌中的作用奠定了基础。

标签：ClC-3；MCF-7细胞；荧光真核表达载体；转染ClC-3是ClC氯离子通道家族成员之一，对维持细胞容积平衡、调节细胞电活动等多种生理功能发挥重要作用，是正常细胞生长和增殖必不可少的元件。

近年有文献报道，在宫颈癌、乳腺癌和恶性胶质瘤中ClC-3的表达都远高于正常组织[1]，ClC-3可以通过参与细胞体积减小即凋亡性容积减小（apoptotic volume decrease，A VD）的过程来参与肿瘤细胞的凋亡调控[2]，而且还可能参与了肿瘤细胞周期依赖性的细胞迁移过程[3]。

因此，ClC-3可能是与肿瘤的发生发展、转移和凋亡过程密切相关的关键分子之一。

本研究采用基因重组技术构建ClC-3与增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）的融合蛋白ClC-3-EGFP，并检测其在人乳腺癌细胞MCF-7中的表达，为进一步探讨ClC-3在乳腺癌中的作用提供分子工具。

1 材料与方法1.1 主要试剂携带ClC-3全长cDNA的质粒pcDNA3.1/ClC-3由芝加哥大学Deborah J.Nelson教授惠赠；真核表达质粒pEGFP-N1、大肠埃希菌DH5α、乳腺癌细胞株MCF-7为本实验室保存；内切酶BamHⅠ、SacⅠ，T4 DNA连接酶均购自NEB 公司；LA Taq酶购自大连宝生物公司；质粒提取试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒购自Omega公司；Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。

TRAIL真核表达质粒的构建及其在膀胱癌细胞中的表达林海群;王绍勇;李宝生;翟利民【期刊名称】《山东医药》【年(卷),期】2008(48)45【摘要】目的构建TRAIL真核表达质粒并初步研究其在膀胱癌细胞中的表达.方法提取Jurkat淋巴瘤细胞总RNA,进行RT-PCR反应,产物测序证实后插入经同样酶切的质粒PcDNA3.1中,构建成真核表达质粒PcD-NA3.1-TRAIL.Western blot 法鉴定其能否在膀胱癌细胞中表达.结果 Jurkat淋巴瘤细胞的RT-PCR产物经测序证实为TRAIL基因的全长序列;经酶切、测序证实成功构建PcDNA3.1-TRIAL质粒;Western blot结果显示,转染上述质粒的膀胱癌细胞中有TRAIL的表达.结论成功构建了表达全长TRAIL的真核表达载体,并通过Westernblot验证其可在膀胱癌细胞中表达.【总页数】3页(P13-15)【作者】林海群;王绍勇;李宝生;翟利民【作者单位】山东省肿瘤医院,山东济南,250117;山东大学第二医院;山东省肿瘤医院,山东济南,250117;山东省肿瘤医院,山东济南,250117【正文语种】中文【中图分类】R737.14【相关文献】1.鼠源TRAIL真核表达质粒的构建及其抑瘤效应的初步观察 [J], 薛胜利;冯作化;张桂梅;黎培员;王洪涛;肖徽2.PcDNA3.1(+)/CYP11B2真核表达质粒的构建及其在NCI-H295R细胞中的表达[J], 蔡辉; 黄文利; 孙朝辉3.SV2A基因真核表达质粒构建及其在HEK293T细胞中的表达 [J], 张晓敏; 王培昌; 刘静4.TRAIL真核表达质粒的构建及抑制肝癌生长的实验研究 [J], 王正兵;贾筱琴;陈兵;李厚达5.山羊IL-2基因真核表达质粒构建及在MDBK细胞中的表达 [J], 杨倩;李婷;鲜思美因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

不同乳腺癌分子亚型中RUNX3蛋白表达和启动子甲
基化的研究的开题报告
背景：
乳腺癌是女性患癌症的主要类型之一。

根据基因表达谱分析结果，可将乳腺癌分为不同的分子亚型，包括激素受体阳性乳腺癌（HR+）、HER2过表达乳腺癌、三阴性乳腺癌等。

不同分子亚型具有不同的临床特征和治疗反应，因此研究不同分子亚型的特征具有重要的临床价值。

RUNX3是一个转录因子，其在多种癌症中有着不同的表达和功能。

近年来的研究发现，RUNX3的表达和启动子甲基化在不同乳腺癌分子亚型中存在差异，因此运用RUNX3在不同乳腺癌分子亚型中的表达及甲基化状态来区分不同分子亚型和进行个体化治疗有一定的潜力。

研究目的：
本研究旨在探究RUNX3在不同乳腺癌分子亚型中的表达及启动子甲基化状态，并分析其与临床特征的关系。

研究内容：
（1）回顾分析公开数据库中RUNX3基因在不同乳腺癌分子亚型中的表达差异；
（2）利用实时荧光定量PCR和免疫组化等方法检测RUNX3蛋白在不同分子亚型乳腺癌组织中的表达水平，并结合临床病理特征进行统计分析；
（3）采用生物信息学方法分析RUNX3启动子区域甲基化的差异，探讨其对RUNX3表达的影响，同时与临床病理数据进行统计学分析；
（4）通过构建RUNX3甲基化谱和表达谱的相互作用网络，探索其在不同乳腺癌分子亚型中的作用和作用机制。

研究意义：
本研究将进一步明确不同乳腺癌分子亚型中RUNX3的表达和甲基化状态，并深入探究其在不同乳腺癌分子亚型中的临床意义和作用机制，为乳腺癌的预防、诊断和治疗提供新的指导性思路和理论基础。

同时，本研究还将为开发个体化、分子靶向治疗提供新的方向。

RUNX3抑癌基因真核表达载体的构建以及在膀胱癌T24细胞中的表达温机灵;周祥福;温机智【期刊名称】《中山大学学报（医学科学版）》【年(卷),期】2009(030)0z1【摘要】[目的]构建真核表达载体pIRES2-EGFP-RUNX3,并在膀胱癌T24细胞株中表达.[方法]RT-PCR从人正常膀胱组织中获取RUNX3基因并测序,将RUNX3基因克隆进pIRES2-EGFP载体,构建真核表达载体pIRES2-EGFP-RUNX3,并进行EcoR Ⅰ和Xho Ⅰ酶切验证.脂质体介导下转染人膀胱癌T24细胞,荧光显微镜检测细胞中增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的表达.[结果]成功构建了真核表达载体pIRES2-EGFP-RUNX3,用脂质体转染人膀胱癌T24细胞后,在荧光显微镜下观察到带绿色荧光的人膀胱癌T24细胞.[结论]成功构建RUNX3基因的真核表达载体pIRES2-EGFP-RUNX3并在膀胱癌T24细胞中表达,为进一步研究RUNX3与膀胱癌的关系奠定基础.【总页数】4页(P64-67)【作者】温机灵;周祥福;温机智【作者单位】同济大学附属东方医院泌尿外科,上海,200120;中山大学附属第三医院泌尿外科,广东,广州,510630;中山大学附属第三医院中心实验室,广东,广州,510630【正文语种】中文【中图分类】R737.14【相关文献】1.抑癌基因PTEN真核表达载体的构建及其在人舌鳞癌SCC-4细胞系中的表达 [J], 董肖婷;张斌;刘硕硕;郭婷婷;潘良朋;贾妮2.成熟型Smac真核表达载体的构建及其在膀胱癌T24细胞中的表达 [J], 汪良;曾甫清;陈方敏3.EZH2的小干扰RNA真核表达载体的构建及其在膀胱癌T24细胞系稳定表达的研究 [J], 王海峰;杨宏;胡礼炳;雷永虹;秦扬;李俊;毕城伟;霍倩4.抑癌基因RUNX3在膀胱癌T24细胞株中的表达以及对凋亡的影响 [J], 温机灵;周祥福;温机智;周琦;王林5.RUNX3抑癌基因真核表达载体的构建以及在膀胱癌T24细胞中的表达 [J], 温机灵;周祥福;温机智因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

不同乳腺癌分子亚型中RUNX3蛋白表达和启动子的甲基化闫战涛;聂艳红;吴永平;刘慧【摘要】目的检测RUNX3在腺腔A(luminal A,LA)、腺腔B(luminal B,LB)、基底细胞样(basal-like,BL)和HER-2过表达(HER2-overexpressing,HER-2+)4种不同分子亚型乳腺癌中的蛋白表达和启动子甲基化状态及其与临床病理参数的关系.方法分别采用免疫组化SP法和甲基化特异性PCR(MSP)法检测88例乳腺癌组织中RUNX3基因蛋白表达和启动子甲基化水平,并分析其与临床病理参数的关系.结果 (1)LA、LB、HER-2+、BL型乳腺癌RUNX3蛋白阳性率分别为26.1%、45.0%、76.2%、75.0%;甲基化率分别为69.6%、85.0%、47.6%、29.2%.BL型的蛋白表达和甲基化率均与LA型、LB型差异均有显著性(P<0.05);HER-2+型蛋白表达与LA和LB差异有显著性(P<0.05),甲基化率与LB型差异有显著性(P<0.05).(2)RUNX3蛋白阳性表达和阴性表达的乳腺癌患者中,RUNX3基因启动子甲基化率分别为36.7%、82.1%,差异有显著性(P<0.05).(3)49例RUNX3阳性病例均见胞质表达,其细胞内定位在各亚型之间差异无显著性.(4)RUNX3基因启动子甲基化与组织学分级、临床分期相关(P<0.05),与淋巴结转移、肿块大小、患者年龄无关.结论 RUNX3蛋白表达缺失和启动子甲基化主要见于ER阳性乳腺癌,其蛋白胞质定位在乳腺癌中是普遍现象,可能与其功能异常相关,其启动子甲基化与乳腺癌传统预后因素相关.RUNX3基因蛋白表达缺失和启动子甲基化在BL型乳腺癌的发生、发展中可能不起主要作用.【期刊名称】《临床与实验病理学杂志》【年(卷),期】2014(030)001【总页数】5页(P10-14)【关键词】乳腺肿瘤;RUNX3基因;启动子甲基化;免疫组织化学;PCR【作者】闫战涛;聂艳红;吴永平;刘慧【作者单位】徐州医学院病理学教研室,徐州,221002;徐州医学院病理学教研室,徐州,221002;徐州医学院病理学教研室,徐州,221002;徐州医学院病理学教研室,徐州,221002;徐州医学院附属医院病理科,徐州,221002【正文语种】中文【中图分类】R737.9RUNX3作为新近发现的抑癌基因在乳腺癌分型中的研究较少，目前多认为RUNX3失活的主要机制是胞质内定位、启动子甲基化等［1，2］。

RunX2的真核表达载体的构建及其对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响赵明;范楚玲;郭强;汪思应;李菲菲【摘要】Objective To investigate the biology effect of RunX2 gene after constructing the eukaryotic expression vector of human RunX2 in breast cancer cells.Methods By the recombinant techniques such as PCR amplifica-tion,digestion,ligation,the human RunX2 gene was inserted into the eukaryotic expression vector of pcDNA3.1, and then it was identifiedby restriction enzyme digestion,RT-PCR,sequencing.Eukaryotic expression vector of human RunX2 gene was transiently transfected into MCF-7 cells.Western blot analysis was applied to detect the expression of RunX2 protein in breast cancer cells MCF-7;MTT assay and wound healing assay were used to detect the cells proliferation and invasion of MCF-7.Results Our result showed that the eukaryotic expression vector of RunX2 was highly expressed RunX2 protein in MCF-7 cells,the cell proliferation and migration abilities were en-hanced in MCF-7 cells with high expression of RunX2 protein.Conclusion RunX2 constructs eukaryotic expres-sion vector and promotes malignant behavior of breast cancer cells.%目的：构建人RunX2真核表达载体，观察 RunX2对乳腺癌细胞增殖和迁移的影响。

西北农业学报2008 ,17 (1) :11214 ,19A ct a A g ri c u l t u r a eB o r e a l i2occi dent a l i s S i ni c a人溶菌酶基因真核表达载体构建及其在牛乳腺上皮细胞中的表达涌3张勃伟,权富生,赛务加浦,孙达权,马会明,张( 西北农林科技大学生物工程研究所,陕西杨凌712100)摘要: 构建真核表达载体p E G F P2C12hL YZ ,并从基因水平研究人溶菌酶基因在体外培养的牛乳腺上皮细胞中的表达,为核移植提供转基因供体细胞。

采用P CR 的方法从人溶菌酶质粒中扩增854 bp 人溶菌酶基因(包括完整的编码框446 bp ) 。

并克隆到p MD182T 载体上,用限制性内切酶Hind Ⅲ和Ba m H Ⅰ双酶切。

将人溶菌酶基因的酶切片段(883 bp )定向克隆到p E G F P2C1 的多克隆位点中,构建重组表达质粒p E GF P2hL YZ , 并进行Hind Ⅲ和Bam H I双酶切鉴定。

转染体外培养的牛乳腺上皮细胞,48 h 后观察其表达情况。

PCR 检测溶菌酶基因的表达。

成功构建了人溶菌酶真核表达载体,观察到表达绿色荧光蛋白的牛乳腺上皮细胞,并检测到溶菌酶基因。

关键词: 绿色荧光蛋白; 基因表达; 多聚酶联反应; 人溶菌酶中图分类号: Q786 文献标识码: A 文章编号:100421389 (2008) 0120011204Construct ion of t he Euk aryot ic Expression V ector of H uman Lysozyme an d Expression in Bovine Ma m m ary G land Epit h el i al C ell sZ H A N G Bo2wei , Q U A N Fu2she n g , SA I Wu2jia2p u ,S U N Da2qua n , M A H ui2mi n g a nd Z H A N G Yo ng 3( In stit ut e of Bioengi n eeri ng ,No rt hwest A & F U ni ver s it y , Y a ngli ng Shaa nxi 712100 ,Chi na)Abstract : We co n s t r u ct e d t h e e u ka r y o t ic e xp re s sio n vecto r p E GF P2C12hL YZ a n d det e ct e d e x p r e s sio n of h u ma n l ysozy me i n bo vi ne ma mma r y gla nd epit helial cell s i n v i t ro c ult r ue i n o r der to do a re s ea r c h of t ra n s ge n ic do no r cell fo r nuclea r t ra n sf er i n ge ne level . 854 bp h uma n ly sozy me ge ne (co nt a i n i n g t h e op e n rea di n g f ra me of 446 bp ) wa s o bt ai ned by PCR a mp lif icatio n f ro m h uma n l ysozyme p la s m i d. The PCR p r o d uct s we r e subclo n ed i n to p M D182T vecto r.The f ra g me n t s of reco mbi n a n t s were di g e s t e d by Hi n d Ⅲ/ Ba m H I a n d clo n e d i n to t h e e u ka r y o t ic e xp re s sio n vecto r p E GF P2C1 , t h e n t r a n s fo r med i n to Esc he ri c hi a coli D H5α. A reco mbi na nt P E GF P2C12hL YZ wa s co n st r uct ed a nd co nfi r med by Hi n d Ⅲ/ Ba m H I di g e s tio n. It s e x p r e s sio n wa s o b s e r v ed i n 48 ho u r s af t e r it wa s t r a n s f e ct e d i n to bo v i n e ma mma2 r y gla nd epit h elial cell s. The e uka r yo tic e xp re ssio n vecto r p E GF P2hL YZ wa s s ucce s sf u ll y co n s t r u ct e d a nd gree n f l uo re s ce nce p ro t ei n s ho wi ng gree n f l uo re sce n ce co ul d be o b s er ved i n ma mm a r y gla n d epi2 t h elial cell s unde r f l u o r e s ce n t micro s cop e . H u ma n l y sozy me ge n e wa s det e ct e d by PCR .K ey w ords : G r ee n f l u o re s ce n t p r o t e i n ; H u ma n l y sozy me ; Ma m ma r y gla n d epit h elial cell 奶牛乳腺炎是对奶牛场危害最大,最常见的疾病之一。

真核细胞高效表达载体的构建及尿激酶原基因在哺乳动物细胞
中的高效表达
李风知;李军;俞炜源
【期刊名称】《北京大学学报：医学版》
【年(卷),期】1994(000)0S1
【摘要】真核细胞高效表达载体的构建及尿激酶原基因在哺乳动物细胞中的高效表达北京军事医学科学院生物工程研究所１００８５０）李风知，李军，俞炜源真核表达载体的元件组成及结构是哺乳动物细胞高效表达外源基因的关键因素之一。

我们以基因表达调控理论为指导，采用多种表达载...
【总页数】1页(P258-258)
【作者】李风知;李军;俞炜源
【作者单位】北京军事医学科学院生物工程研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q782
【相关文献】
1.重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的高效表达[J], 李征;毕跃东;曾献武;刘知微
2.重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的高效表达[J], 李征;毕跃东;曾献武;刘知微
3.密码子优化的人H5N1流感病毒HA基因在哺乳动物细胞中获得高效表达 [J],
李魁彪;张晓光;马晶;贾晓俊;王敏;董婕;张晓梅;徐红;舒跃龙
4.腺病毒载体介导密码子优化型HPV 16 L1基因在哺乳动物细胞中的高效表达及病毒样颗粒的装配 [J], 周玉柏;周玲;吴小兵;曾毅
5.乙型肝炎病毒表面抗原基因在人参细胞中的高效表达 [J], 高正伦;盛军;刘丹;刘晓宇;李娟;郝淑美;吉海滨;刘建华
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乳腺癌细胞株的基因表达谱基因表达谱是指在特定条件下，一个细胞或组织中所有基因的表达水平。

乳腺癌是一种复杂的疾病，其发生和发展涉及多个基因的异常表达。

通过研究乳腺癌细胞株的基因表达谱，我们可以深入了解乳腺癌的生物学特性，为诊断、治疗和预防乳腺癌提供重要的信息。

近年来，随着高通量测序技术的发展，越来越多的乳腺癌细胞株的基因表达谱被揭示出来。

这些数据为研究乳腺癌的分子机制提供了宝贵的资源。

在本文中，我们将综述一些乳腺癌细胞株的基因表达谱研究进展，并探讨其对乳腺癌诊断和治疗的影响。

一、MCF7细胞株MCF7细胞株是最常用的乳腺癌细胞株之一，它来源于人乳腺癌组织。

研究发现，MCF7细胞株的基因表达谱具有较高的异质性，其中包括多种信号通路和基因表达的异常。

例如，PI3K/AKT信号通路在MCF7细胞株中过活化，导致细胞增殖、存活和迁移能力的增强。

MCF7细胞株中还表达了多种激素受体，如雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR），使得它们对激素治疗具有敏感性。

二、MDAMB231细胞株MDAMB231细胞株是另一种广泛使用的乳腺癌细胞株，来源于人乳腺癌组织。

与MCF7细胞株相比，MDAMB231细胞株具有更强的转移和侵袭能力。

研究发现，MDAMB231细胞株的基因表达谱中，多种与转移和侵袭相关的基因表达异常，如matrix metalloproteinases (MMPs)和clusterin等。

MDAMB231细胞株中ER和PR阴性，使得它们对激素治疗具有抵抗性。

三、T47D细胞株T47D细胞株是另一种人乳腺癌细胞株，来源于乳腺癌组织。

T47D细胞株的基因表达谱具有独特的特征，如高表达ofertheclinicalresponse (OCR)和低表达breastcancerassociated gene 1 (BCAS1)。

研究发现，OCR的高表达与T47D细胞株对化疗药物的敏感性有关，而BCAS1的低表达则与细胞存活和增殖能力的降低有关。