粗壮脉纹胞菌复合多菌种发酵茶粕产纤维素酶的研究

基金项目：四川省教育厅自然科学科研项目（２００５Ａ０３０）＊通讯作者纤维素酶是一类能够降解纤维素，使之生成纤维二糖和葡萄糖等一系列酶的总称，按各酶功能的不同可以分为内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β－葡萄糖苷酶三大类（谢占玲和吴润，２００４），在协同作用下它们可以将纤维素物质彻底水解成葡萄糖，进而发酵产生乙醇，解决能源再生以及环境污染等问题。

目前，纤维素酶成本高及酶活力低严重制约其在生产中的广泛应用。

为解决这个问题，一方面需要筛选高产量和高酶活力的纤维素酶产生菌，另一方面就是通过现代的基因工程手段，构建高效表达的基因工程菌，或通过对已知的纤维素酶进行分子改造以提高其比活力。

由于筛选原始菌株工作量大，且产量一般情况下较基因工程菌低，所以构建高效表达的基因工程菌是降低纤维素酶成本、提高产量的有效手段。

目前，国内外鲜见在巨大芽孢杆菌中表达内切葡聚糖酶的报道。

本试验以工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ为研究对象，对其产酶条件进行优化，通过优化培养条件以进一步提高表达量，为实现基因工程菌产业化奠定基础。

１材料与方法１．１菌种来源四川农业大学生命科学与理学院生物化学与分子生物学实验室自行构建保存的基因工程菌ｐＨＢＭ－Ｅｎｄ。

１．２培养基ＬＢ培养基：１％胰蛋白胨，１％Ｎａ－Ｃｌ，０．５％酵母浸出粉，ｐＨ７．０～７．５；配制固体培养基时需加入１．５％～２．０％的琼脂粉；配制抗生素培养基时需加入四环素（终浓度为１０μｇ／ｍＬ）。

ＬＢ－ＣＭＣ培养基：在ＬＢ培养基中加入０．５％的羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）。

１．３生物量测定将培养液稀释２５倍，用７２１－型分光光度计在６００ｎｍ下测定光密度，以未接种的培养基等量稀释液作对照。

１．４酶活力测定参照郑淑霞等（２００４）方法。

以１ｍＬ１％（ｍ／Ｖ）羧甲基纤维素钠（ＣＭＣ－Ｎａ）溶液为底物，加入０．１ｍＬ适当稀释的酶液并混匀，置水浴锅中５０℃静置保温３０ｍｉｎ，然后加入２．５ｍＬ二硝基水杨酸钠（ＤＮＳ）溶液，混匀后置１００℃煮沸５ｍｉｎ，取出后用流水冷却至室温，定容至５ｍＬ，最后在５３０ｎｍ波长处测得各管溶液的吸光值并计算酶活力。

一株纤维素酶高产菌的筛选、鉴定与产酶研究田云;曹林友;周赓;邓成刚;陈帅;卢向阳;周海燕【摘要】A high cellulase-producing strain was screened from the mushroom cultivation matrix, and named as SAISA10. It was identified as Hypocreales sp. by morphological observation and DNA sequence identification. Results showed that,the optimum fermentation conditions for strain SAISA10 were as follows:fermentation time of 3 d,fermenta-tion temperature of 40 ℃,pH value of 4. 0,the mass ratio of sodium carboxymethyl cellulose and bran of 1 ∶ 1(g ∶ g), (NH4)2SO4 content of 0.8 g·(100 mL)-1. The preliminary research results of enzymatic properties showed that,the optimum enzymatic hydrolysis conditions were as follows:temperature of 45~55 ℃,pH value of 4. 0,and the optimum stable conditions were as fol lows:temperature of 40 ℃,pH value of 4. 5. The strain SAISA10 is a high cellulase-produ-cing strain with high activity and stability at high temperature or low pH value,which has high exploration potential.%从蘑菇培养基质中筛选到一株纤维素酶高产菌株,将其命名为SAISA10,经形态学及分子生物学鉴定,确认该菌为真菌Hypocreales sp.。

生物技术进展 2024 年 第 14 卷 第 2 期 263 ~ 270Current Biotechnology ISSN 2095‑2341研究论文Articles产纤维素酶工程菌株的构建及其在醇化烟叶中的应用孔蒙蒙1 ， 卢鹏1 ， 陈千思1 ， 乔学义1 ， 陈善义2 ， 金静静1 ， 郑雪坳1 ， 曹培健1 ， 陶界锰1*1.中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州 450001；2.福建中烟工业有限责任公司技术中心，福建 厦门 361021摘 要：烟叶中过高的纤维素含量使烟叶组织容易破碎，影响加工过程中烟叶的可塑性，使烟叶杂气变重等。

为了获得产纤维素酶的优良菌株，实现醇化烟叶纤维素的有效降解，利用同源重组法成功构建了10株纤维素降解的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis ）工程菌株。

通过刚果红平板筛选、羧甲基纤维素钠酶活、滤纸酶活及滤纸崩解率等检测，共筛选出C36、CM 、KF 和GH5 4株产纤维素酶能力较强的重组菌株。

将醇化烟叶作为底物进行纤维素降解，发现重组菌株CM 的产纤维酶效率最高，其羧甲基纤维素钠酶活和滤纸酶活分别为39.55和23.52 U ·mL -1。

结果表明，构建的重组菌株能够利用醇化烟叶中的纤维素产生纤维素酶，可为工业生产中醇化烟叶纤维素降解提供理论支撑。

关键词：工程菌株；醇化烟叶；纤维素降解；枯草芽孢杆菌DOI ：10.19586/j.2095­2341.2023.0159中图分类号：Q814， S572 文献标志码：AConstruction of Cellulase Producing Engineering Strains and the Application in Aged Tobacco LeavesKONG Mengmeng 1 ， LU Peng 1 ， CHEN Qiansi 1 ， QIAO Xueyi 1 ， CHEN Shanyi 2 ， JIN Jingjing 1 ，ZHENG Xueao 1 ， CAO Peijian 1 ， TAO Jiemeng 1*1.Zhengzhou Tobacco Research Institute ， China National Tobacco Corporation ， Zhengzhou 450001， China ；2.Technology Center ， China Tobacco Fujian Industrial Co.， Ltd.， Fujian Xiamen 361021， ChinaAbstract ：High cellulose content make the tissue of tobacco leaves broken easily ， affect the plasticity of tobacco leaves during processing ， and make the heavy impurity of tobacco leaves. In order to obtain excellent cellulase producing strains and achieve effective degradation of cellulose in aged tobacco leaves ， ten Bacillus subtilis engineering strains of cellulose -degrading were suc‐cessfully constructed by homologous recombination method. Four recombinant strains C36， CM ， KF and GH5 with strong cellu‐lase production capacity were screened by the Congo red plate method ， carboxymethyl cellulose sodium enzyme activity assay ， filter paper enzyme activity assay and filter paper disintegration rate detection. When aged tobacco leaves were used as substa‐rate ， the recombinant strain CM showed the highest cellulase production efficiency ， and its carboxymethyl cellulose sodium en‐zyme activity was 39.55 U ·mL -1 and filter paper enzyme activity was 23.52 U ·mL -1， respectively. The results indicated that the recombinant strains could utilize cellulose in aged tobacco leaves to produce cellulase ， which could provide theoretical support for cellulose degradation of aged tobacco leaves in industrial production.Key words ：engineered strains ； aged tobacco leaves ； cellulose degradation ； Bacillus subtilis纤维素是一种具有重复单位的多糖聚合物，可看作是植物聚合网络的刚性支架，广泛存在于收稿日期：2023‐12‐12； 接受日期：2024‐01‐05基金项目：烟草行业烟草工艺重点实验室引领计划专项项目(202022AWHZ08)；中国烟草总公司重点研发项目(110202102017；110202201004)。

一株产纤维素酶细菌的分离鉴定及其酶学特性研究邓先余;邹谋勇;黄志坚;易俗【摘要】Using CMC plat screening and Congo red dying methods, a strain of cellulase-producing bacterium named CXB001 was isolated from the soil around rotten root of Hibiscus mutabili on the campus of Hunan University of Science and Technology. Physical and chemical test and molecular phylogenetic a-nalysis based on 16S rDNA sequences showed that the strain was Bacillus velezensis. Biological charateris-tics revealed that the optimal growth temperature is 37℃ , and the gr owth temperature ranges from 10℃ to 50℃ , while the growth pH ranges from 5.0 to 11.0. The culture conditions at pH 6.0-9.0, 34 ~ 40 ℃ and 1.5% ~3. 5% NaCl are the most suitable for enzyme production. The optimal temperature for CXB001 to produce cellulase is 50℃ , while the optimal reaction pH is 5. 0, and the strain has nice enzyme stability in 20℃, pH 5. 0 ~7.0. Further experiments revealed that Co2+ could stimulate the cellulase, while Mg2+ and Fe2+ inhibit the enzyme reaction.%采用CMC平板筛选和刚果红染色等方法,从湖南科技大学校园腐烂木芙蓉根部土壤中分离1株产纤维素酶菌株CXB001,经生理生化测试、16SrDNA分子进化树分析,鉴定菌株为Bacillus velezensis.对该菌株的生物特性研究表明,其最适生长温度为37℃,在10～50 ℃,pH5.0 ～11.0中能生长,在pH 6.0～9.0,34～40℃,1.5％～3.5％ NaC1的培养条件下,最适产酶.CXB001所产纤维素酶最适反应温度为50℃,最适反应pH为5.0；在20℃、pH 5.0～7.0具有较好的稳定性.Co2+对纤维素酶具有激活作用,Mg2+,Fe2+对纤维素酶具有抑制作用.【期刊名称】《中山大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(051)005【总页数】7页(P93-99)【关键词】纤维素酶;Bacillus velezensis;16S rDNA;酶学特性【作者】邓先余;邹谋勇;黄志坚;易俗【作者单位】湖南科技大学生命科学学院,湖南湘潭411201;湖南科技大学生命科学学院,湖南湘潭411201;中山大学生命科学学院,广东广州510275;湖南科技大学生命科学学院,湖南湘潭411201;中山大学生命科学学院,广东广州510275【正文语种】中文【中图分类】Q936纤维素是地球上光合作用产量最高的多糖，它是由葡萄糖以β-1,4糖苷键连接而成的线状大分子物质[1-2]。

纤维素酶生产方法的研究进展李永莲;林凯城【摘要】为解决化石燃料和环境污染等问题,研究生产高效、酶性质优良、耐热的纤维素酶菌株具有非常重要的现实意义.通过讨论改良纤维素酶菌株遗传的主要方法,包括传统的筛选方法及生物技术选育方法,理化诱变育种技术、基因工程、细胞融合技术、蛋白质工程和发酵工艺,并对纤维素酶的研究热点和难点进行了展望.【期刊名称】《济南职业学院学报》【年(卷),期】2016(000)002【总页数】3页(P99-101)【关键词】纤维素酶;生产方法;筛选;生物技术【作者】李永莲;林凯城【作者单位】广东轻工职业技术学院,广东广州510300;揭阳职业技术学院,广东揭阳522000【正文语种】中文【中图分类】Q55化石燃料不断消耗以及环境污染日益严重，世界能源问题越来越突出，为了缓解化石燃料短缺、环境恶化的问题，人们都把注意力放在寻找可再生能源上。

纤维素类物质是成本最廉价的可再生资源，是地球上蕴藏最丰富的生物质，每年地球上植物的生成量高达1500亿吨干物质，其中约有850亿吨为纤维素及半纤维素。

如果能把纤维素类物质经济有效地转化成生产生物柴油的原料油脂、燃料乙醇和氢气等，这将有利于缓解目前能源危机和环境污染危机等，有利于人类社会实现可持续发展。

纤维素酶的本质是主要由三种酶：内切型β-葡聚糖酶、外切型β-葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶组成的多组分酶系，三种酶之间协同作用，内切型β-葡聚糖酶、外切型β-葡聚糖酶先将纤维素降解为寡糖和纤维二糖，最后β -葡萄糖苷酶把寡糖和纤维二糖水解为葡萄糖。

纤维素酶大量存在自然界，其特异性高、反应条件温和、环境污染小，但是由于产酶效率低、周期长、耐热性差、寿命短、成本高等，所以限制了纤维素酶的工业化生产。

另外，纤维素酶的生产成本约占纤维燃料乙醇的50%～60%，所以直接影响了纤维燃料乙醇的工业化生产。

因此研究高效、产量高、耐热耐碱性强的纤维素酶的生产方法具有重要的现实意义。

课程论文课题名称纤维素酶产生菌的研究进展专业名称2013级生物工程学生姓名付燕指导教师高健2016年4月10日内容摘要 (2)目录1.纤维素酶的研究概况 (2)1.1纤维素酶的来源 (2)1.2纤维素酶的种类 (2)2纤维素酶产生菌选育的研究进展 (2)3培养体系的优化 (3)3.1碳源的作用 (3)3.2氮源的作用 (4)3.3表面活性剂 (4)4培养条件的优化 (4)4.1温度的影响 (4)4.2 pH的影响 (5)4.3溶氧量的影响 (5)5.菌种改造 (5)5.1物理诱变 (6)5.2化学诱变 (6)5.3基因工程法 (6)6.结语 (7)摘要纤维素酶能够将纤维素分解为葡萄糖。

该酶在解决当前世界面临的能源、粮食、环境污染等危机方面具有重要意义。

然而，迄今为止纤维素酶活和产率均较低、生产周期长、成本高，都严重地阻碍其工业化的应用。

纤维素的降解有赖于纤维素酶。

自然界中很多微生·物可以产生纤维素酶。

因此，如何提高纤维素产生菌产酶能力是近年来研究的热点。

近年来，国内外对细菌、真菌等产纤维素酶的微生物进行了大量的研究，利用化学、物理以及紫外诱变等方法获得了大量纤维素酶高产菌株。

本文对国内外选育纤维素酶高产菌的研究以及利用木霉等菌产纤维素酶、产纤维素酶菌种选育、混合菌产纤维素酶等方面的研究进展进行了综述。

关键词纤维素酶；纤维素；微生物；培养体系；培养条件；菌种改造纤维素（cellulose）作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源，据估计，纤维素生成量每年高达1 000亿吨。

我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。

纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。

但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限，目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。

本科开放项目题目：产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定学生姓名：指导教师：学院：专业班级：2016年3月产纤维素酶菌株的筛选及其酶活的测定摘要纤维素作为植物光合作用的主要多糖类产物，是高等植物细胞壁的主要成分，是公认的自然界数量最丰富、最廉价的可再生有机物质资源。

据估计，纤维素生成量每年高达1000亿吨。

我国每年农作物秸秆总产量为7亿吨左右，仅农业生产中形成的农作物残渣（如稻草、玉米秸、麦秸等），每年就有5亿吨之多。

纤维素的降解是自然界碳素循环的中心环节。

但由于纤维素的结构特点，对纤维素的利用仍然非常有限。

目前仅有20%的纤维素物质被开发利用，大量的纤维素物质因无法分解利用而废弃，不仅造成资源浪费，而且污染环境。

随着人口数量的不断增长和人民生活水平的不断提高，能源危机、食物短缺、环境污染等问题日益严重，寻找利用可再生资源、节省粮食、减少环境污染的有效途径显得日趋重要。

采用微生物技术处理秸秆是当前研究最多的一种秸秆处理方法,纤维素酶能将天然纤维素降解,生成纤维素分子链、纤维二糖和葡萄糖,然而目前制约纤维素材料转化为乙醇并实现产业化的关键因素之一是纤维素酶效率低下,从而造成生产成本过高。

因此,筛选具有高活性纤维素酶的秸秆降解微生物菌株以及相关研究是当前研究的热点和难点。

关键词：纤维素降解高活性纤维素酶微生物菌株目录第1章绪论 (1)1.1 实验原理 (1)1.2 实验仪器及试剂 (2)1.2.1 实验材料 (2)1.2.2 实验仪器 (2)1.2.3 培养基 (2)第2章实验步骤 (3)2.1 采样培养 (3)2.2 初筛 (4)2.3 复筛 (4)2.4 酶活的测定 (4)2.4.1原理 (4)2.4.2溶液配制 (4)2.4.3实验步骤 (5)第3章实验结果 (7)3.1 标准曲线的绘制 (7)3.2 菌株复筛结果 (8)3.3 测定纤维素酶活力结果 (9)结束语 (10)参考文献 (11)第1章绪论1.1 实验原理自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。