载体系统

智能药物载体的设计与应用研究在当今的医学领域，智能药物载体的出现为药物传递和治疗效果带来了革命性的变化。

智能药物载体是一种能够对体内特定的生理环境或外部刺激做出响应，从而实现药物的精准释放和有效治疗的新型载体系统。

智能药物载体的设计理念主要基于对药物释放的精准控制。

传统的药物传递系统往往存在药物分布不均匀、药物释放速度难以控制以及对正常组织产生毒副作用等问题。

而智能药物载体通过巧妙的设计，可以有效地解决这些难题。

从材料的选择上，智能药物载体通常采用生物相容性良好的材料，如脂质体、聚合物纳米粒、胶束等。

脂质体是由磷脂双分子层组成的封闭囊泡，具有良好的生物相容性和膜通透性，能够有效地包裹水溶性和脂溶性药物。

聚合物纳米粒则可以通过调整聚合物的种类和分子量，控制药物的释放速度和释放量。

胶束是由两亲性分子在水溶液中自组装形成的纳米结构，能够增溶难溶性药物，并在特定条件下实现药物的释放。

智能药物载体的一个关键特性是对环境刺激的响应能力。

常见的刺激因素包括 pH 值、温度、酶、氧化还原电位等。

例如，在肿瘤组织中，由于细胞代谢旺盛，会产生酸性环境。

基于此特点设计的 pH 响应型智能药物载体，能够在正常生理 pH 值（约 74）下保持稳定，而在肿瘤酸性环境（约 65 68）中迅速释放药物，提高药物在肿瘤部位的浓度，增强治疗效果。

温度响应型智能药物载体也是研究的热点之一。

这种载体通常由具有温敏性的聚合物组成，当温度升高到特定值时，载体的结构会发生变化，从而释放药物。

例如，在肿瘤的热疗过程中，通过局部加热使温度达到载体的响应温度，实现药物的精准释放，协同热疗和化疗，提高治疗效率。

酶响应型智能药物载体则是利用肿瘤组织中过度表达的特定酶来触发药物释放。

例如，某些蛋白酶在肿瘤组织中的活性显著高于正常组织，设计相应的酶敏感型载体可以实现药物在肿瘤部位的特异性释放，减少对正常组织的损伤。

氧化还原电位响应型智能药物载体主要基于肿瘤细胞内较高的谷胱甘肽浓度。

纳米药物载体技术用纳米粒子作为药物载体可实现靶向输送、缓释给药的目的, 这是由于小粒子可以进入很多大粒子难以进入的人体器官组织, 如小于50nm 的粒子就能穿过肝脏内皮或通过淋巴传送到脾和骨髓, 也可能到达肿瘤组织。

另外纳米粒子能越过许多生物屏障到达病灶部位, 如透过血脑屏障( BBB) 把药物送到脑部, 通过口服给药可使药物在淋巴结中富集等。

具有生物活性的大分子药物( 如多肽、蛋白类药物) 很难越过生物屏障, 用纳米粒子作为载体可克服这一困难, 并提高其在体内输送过程中的稳定性。

用纳米粒子实现基因非病毒转染, 是输送基因药物的有效途径。

药物既可以通过物理包埋也可以通过化学键合的方式结合到聚合物纳米粒子中。

载有药物的聚合物纳米粒子通常以胶体分散体的形式通过口服、经皮、皮下及肌肉注射、动脉注射、静脉点滴和体腔黏膜吸附等给药方式进入人体。

制备聚合物纳米粒子的方法主要有以下几种: ( 1) 单体聚合形成聚合物纳米粒子; ( 2) 聚合物后分散形成纳米粒子; ( 3) 结构规整的两亲性聚合物在水介质中自组装形成纳米粒子。

1 单体聚合制备的聚合物纳米粒子聚氰基丙烯酸烷基酯( PACA) 在人体内极易生物降解, 且对许多组织具有生物相容性。

制备聚氰基丙烯酸烷基酯纳米粒子采用的是阴离子引发的乳液聚合方法, 通常以OH-为引发剂, 反应一般在酸性水介质中进行, 常用的乳化剂有葡聚糖、乙二醇与丙二醇的嵌段共聚物和聚山梨酸酯等, 具体制备过程见图1。

当反应介质pH 值偏高时, OH-浓度大, 反应速度快, 形成的PACA 分子量低, 以此作为给药载体材料进入人体后, 降解速度太快, 不利于药物缓释。

因此聚合反应介质的pH 值通常控制在1.0~ 3.5 范围内。

图1 聚氰基丙烯酸烷基酯纳米粒子的制备过程PACA 纳米粒子载药的方式有两种: 一是药物与单体一起加入, 药物在聚合反应过程中被包埋在粒子内; 二是聚合反应完成后, 药物通过吸附进入粒子内部。

病毒载体概述引言基因导入系统（gene delivery system）是基因治疗的核心技术，可分为病毒载体系统和非病毒载体系统。

本章主要论述用于人类基因治疗的病毒载体系统。

用于基因治疗的病毒载体应具备以下基本条件：1、携带外源基因并能包装成病毒颗粒；2、介导外源基因的转移和表达；3、对机体不致病。

然而，大多数野生型病毒对机体都具有致病性。

因此需要对其进行改造后才能用于人体。

原则上，各种类型的病毒都能被改造成病毒载体。

但是由于病毒的多样性及与机体复杂的依存关系，人们至今对许多病毒的生活周期、分子生物学、与疾病发生及发展的关系等的认识还很不全面,从而限制了许多病毒发展成为具有实用性的载体。

近20年来，只有少数几种病毒如反转录病毒（包括HIV病毒）、腺病毒、腺病毒伴随病毒、疱疹病毒（包括单纯疱疹病毒、痘苗病毒及EB病毒）、甲病毒等被成功地改造成为基因转移载体并开展了不同程度的应用。

第一节病毒载体产生的原理病毒载体的产生建立在对病毒的生活周期和分子生物学认识的基础之上。

研究病毒载体首先要对病毒的基因组结构和功能有充分的了解，最好能获得病毒基因组全序列信息。

病毒基因组可分为编码区和非编码区。

编码区基因产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白；根据其对病毒感染性复制的影响，又可分为必需基因和非必需基因。

非编码区中含有病毒进行复制和包装等功能所必需的顺式作用元件。

各种野生型病毒颗粒都具有一定的包装容量，即对所包装的病毒基因组的长度有一定的限制。

一般来说，病毒包装容量不超过自身基因组大小的105～110％。

基因重组技术的发展使病毒载体的产生成为可能。

最简单的做法是，将适当长度的外源DNA插入病毒基因组的非必需区，包装成重组病毒颗粒。

比如，本实验室曾将4.5kb的lacZ基因表达盒（CMV-lacZ-polyA）插入HSV1病毒的UL44（糖蛋白C）基因的XbaI位点中，病毒基因组的其余部分不改变，构建成重组病毒HSV1-lacZ100（吴小兵等，1998）。

双元表达载体系统双元表达载体系统主要包括两个部分：一部分为卸甲Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供Vir基因编码表达Vir蛋白的功能，VIR基因编码的virD2蛋白相当于反式作用元件，能够识别农杆菌转运DNA（T-DNA）两端24bp序列,进而将T-DNA以单链的形式切割下来，同时，VIR基因编码的virE2能够与单链T-DNA结合，形成T-复合物，在核定位序列的作用下，经过宿主细胞T4SS转运体系进入宿主细胞质。

之后便是宿主细胞的转运过程，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。

另一部份是微型Ti质粒(Mini-Ti plasmid)，它在T－DNA左右边界序列之间提供植株选择标记如NPTII基因以及Lac Z基因等。

双元载体系统的构建的原理是Ti质粒上的Vir基因可以反式激活T－DNA 的转移。

与共整合载体所不同的是，它不依赖两个质粒之间的同源序列，不需要共整合过程就能在农杆菌内独立复制。

原理1.一般植物表达载体是成套使用的，一套中有两个，一个是带有可以供插入外源表达基因的MCS和筛选标签的融合蛋白（通常是GFP或Gus）的普通载体。

另一个载体就是双元载体（binary-vector）了。

通常我们是先将外源基因插入带有筛选标记的载体，然后将此载体上的35S promoter-expression gene-gfp这段全部切下，然后构建亚克隆，其过程就是将上述的片断插入双元载体的LB和RB之间，其插入方向是可以任意的。

然后将带有35S promoter-expression gene-gfp的双元载体转化农杆菌，在通过农杆菌转染植物，最后可以通过农杆菌特有的ti-DNA转染机制，将双元载体的LB和RB之间的片段融合进宿主的基因组上。

我以前用的是pCAMBIA3101+pUC-35S-GFP以及pZPZ211和pAA等2.双元表达载体系统主要包括两个部分3.一部分为辅助Ti质粒，这类Ti质粒由于缺失了T－DNA 区域，完全丧失了致瘤作用，主要是提供ir基因功能，激活处于反式位置上的T－DNA的转移。

11有机热载体锅炉及系统有机热载体最高允许使用温度和产品型式试验有机热载体产品的最高允许使用温度应当根据其热稳定性确定，其热稳定性应当按照GB/T23800《有机热载体热稳定性测定法》规定的方法测定。

有机热载体产品质量应当符合GB23971《有机热载体》的规定，并且通过产品型式试验，型式试验按照《锅炉水（介）质处理监督管理规则》（TSGG5001）的要求进行。

选择和使用条件有机热载体产品的选择和使用应当符合GB24747《有机热载体安全技术条件》的规定，未采取有效和可靠的防泄漏安全措施时，有机热载体不应当直接用于加热或者冷却具有氧化作用的化学品。

在用有机热载体每年至少取样检验一次。

不同有机热载体的混合使用不同化学组成的气相有机热载体不应当混合使用，气相有机热载体不应当与液相有机热载体混合使用，合成型液相有机热载体不宜与矿物型有机热载体混合使用。

最高工作温度有机热载体的最高工作温度不应当高于其自然点温度，并且至少低于其最高允许使用温度100C,燃煤锅炉或者炉膛辐射受热面平均热流密度大于0.05MW/m2的锅炉，有机热载体的最高工作温度应当低于其最高允许使用温度200C.最高允许液膜温度有机热载体的最高允许使用温度小于或者等于3200C时，其最高允许液膜温度应当不高于最高允许使用温度加200C。

有机热载体的最高允许使用温度高于3200C时，其最高允许液膜温度应当不高于最高允许使用温度加300C。

锅炉锅炉及其附属容器的设计压力（1）锅炉的设计计算压力取锅炉的额定工作压力加0.3Mpa，并且对于火焰加热的锅炉，其设计计算压力应当不低于1.0Mpa；对于电加热及余（废）热锅炉，其设计计算压力应当不低于0.6Mpa；（2）有机热载体系统中的非承压容器的最小设计计算压力应当为0.2Mpa，承压容器的设计计算压力至少为其额定工作压力加0.2Mpa；使用气相有机热载体的强制循环液相锅炉工作压力强制循环液相锅炉使用气相有机热载体时，其工作压力应当高于其最高工作温度加200C条件下对应的有机热载体饱和压力。

2．植物遗传转化的载体系统。

作为植物遗传转化的载体必须是能进入宿主细胞内进行复制和表达的核酸分子。

目前的载体系统有病毒的载体系统和质位的载体系统两大类。

（1）病毒载体系统：植物病毒作为植物遗传转化的载体系统是由植物病毒的侵染特性所决定的。

以病毒作载体的表达系统为瞬时表达系统，其一般不能把外源基因整合到植物细胞基因组中。

植物病毒的感染率很高，在较短时间内可获得较大的表达量。

但因以病毒为载体的表达系统每个宿主材料都要接种病毒载体，故瞬时表达系统不易起始。

作为病毒载体的病毒最好是双链DNA植物病毒。

目前已有十几种植物病毒被改造成不同类型的外源蛋白表达载体中；包括椰菜叶病毒（CaMV）、烟草花叶病毒（TMV）、豇豆花叶病毒（CPMV）和马铃薯X病毒（PVX）等。

其中在TMV载体中成功表达的外源病毒至少有150种以上。

（2）农杆菌质粒载体系统：质粒载体系统中最常用的质粒有：Ti质粒和Ri质粒。

Ti 质粒存在于根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）中，Ri质粒存在于发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenis）中。

Ti质粒和Ri质粒在结构和功能上有许多相似之处，具有基本一致的特性。

但实际工作中，绝大部分采用Ti质粒。

农杆菌质粒是一种能实现DNA转移和整合的天然系统。

Ti质粒有两个区域：T-DNA区（是质粒上能够转移整合入植物受体基因组并能在植物细胞中表达从而导致冠瘿瘤的发生，且可通过减数分裂传递给子代的区域）和Vir区（编码能够实现T-DNA转移的蛋白）。

T-DNA长度为12-24kb之间，两端各有一个含25hp重复序列的边界序列，在整合过程中左右边界序列之间的T-DNA可以转移并整合到宿主细胞基因组中，研究发现只有边界序列对DNA的转移是必需的，而边界序列之间的T-DNA并不参与转化过程，因而可以用外源基因将其替换。

Vir区位于T-DNA以外的一个35kb内，其产物对T-DNA的转移及整合必不可少。