人外周血白细胞分离液使用说明

人外周血淋巴细胞分离液使用说明
人外周血淋巴细胞分离液是一种常用的实验试剂，用于分离和提取人体外周血中的淋巴细胞。

下面是使用该试剂的详细说明：
1. 实验准备：
- 准备干净的工作台和操作工具。

- 检查分离液是否过期，确保其保存条件良好。

- 为实验准备足够数量的外周血样本。

2. 样本处理：
- 从被试者的外周血中采集适量的血液。

- 使用无菌技术将血液转移至无菌离心管中。

3. 样本离心：
- 将含有外周血的离心管放入离心机中。

- 以2000-2500转速离心10分钟，使细胞沉淀到离心管底部。

4. 废液处理：
- 弃去上层的血浆和血小板，只留下上清或底部的细胞悬浮液。

5. 细胞分离：
- 将分离液缓慢倒入含有细胞沉淀的离心管中，通常使用10 mL分离液对应1 mL的细胞悬浮液。

- 轻轻摇晃离心管，使分离液均匀混合。

- 静置15-20分钟，使淋巴细胞在分离液中上浮。

6. 细胞收集：
- 将含有上浮淋巴细胞的上清缓慢转移到新的离心管中。

- 用相同的方法重复上述步骤，以提高细胞收集率。

- 将收集到的细胞悬浮于适当的培养基中，进行后续实验。

请注意，这只是一个基本的使用说明，具体的实验步骤和分离效果可能会因实验目的和细胞样本的来源而有所不同。

在进行实验前，建议查阅供应商提供的用户手册，以获得更加详细的使用说明和操作技巧。

同时，使用过程中严格遵守实验室安全操作规范，确保个人和实验室的安全。

希望以上使用说明能够对您的实验工作有所帮助。

外周血白细胞的分离：（细胞分离液有市售，有各种型号：白细胞、单核细胞淋巴细胞等分离液）1> 取3ml正常人的外周血（枸橼酸钠抗凝）与等体积pbs混匀后小心的加于6ml白细胞分离液液面上，1500r/min离心20 min。

（或先将抗凝血离心，然后吸取中间白细胞层，再混以等体积pbs然后小心加于等体积细胞分离液液面上，离心同上）2> 吸取中间云雾状白细胞，加3－4mlPBS后3000 r/min离心10 min。

3> 弃上清，加1ml PBS洗涤沉淀后，将细胞悬液转移至1.5mLEp 管中。

4> 3000r/min离心20 min，弃上清。

即得白细胞可以试试红细胞裂解液提供我的配方：氯化铵82.9克；重碳酸钾10.0克；EDTA0.37克；用三蒸水配成1升所有的细胞培养都应该坚守无菌操作原则2.分层后的确有3层，准确说来是4层，最下面是红细胞，上面的一层不应该是稍微混浊的白色，应该也比较透明，这一层上面就是我们需要的薄细胞层，最上面是血清3.细节：a.淋巴细胞分离液要避光保存b.就您的试验看来，淋巴细胞分离液的问题可能是最主要的c.首先再离心管中加入淋巴细胞分离液，然后把标本缓慢加在淋巴细胞分离液表面上，一定要缓慢小心操作，切不可混匀d.所有操作都应在无菌环境进行e.把离心管放入离心机是也应小心，不要太大幅度的摇幌离心管，当然离心后拿出来也要小心就这么多了吧，这个操作是不是很难的，比较基本祝您好运了！.参考方法：人外周血, 肝素抗凝(100U öm l) , 等量无血清培养液（或者PBS等缓冲液）稀释。

按1∶2 的体积比缓置于比重1. 077 g/m l 的淋巴细胞分离液, 1000 ×g 离心30 m in, 收集培养液2分离液界面上的单个核细胞。

于无血清培养液, 400×g 离心10 m in, 洗涤2次。

用培养液重新悬浮细胞并计数我也是最近要做所以查了一下，仅供分享，呵呵！一外周血白细胞的分离1> 取3ml正常人的外周血（枸橼酸钠抗凝）与等体积pbs混匀后小心的加于6ml白细胞分离液（（33.9%泛影葡胺和9%Ficoll液按1：2.4体积比混合））液面上，1500r/min离心20 min。

外周血白细胞的分离：（细胞分离液有市售，有各种型号：白细胞、单核细胞淋巴细胞等分离液）1> 取3ml正常人的外周血（枸橼酸钠抗凝）与等体积pbs混匀后小心的加于6ml白细胞分离液液面上，1500r/min离心20 min。

（或先将抗凝血离心，然后吸取中间白细胞层，再混以等体积pbs然后小心加于等体积细胞分离液液面上，离心同上）2> 吸取中间云雾状白细胞，加3－4mlPBS后3000 r/min离心10 min。

3> 弃上清，加1ml PBS洗涤沉淀后，将细胞悬液转移至1.5mLEp 管中。

4> 3000r/min离心20 min，弃上清。

即得白细胞可以试试红细胞裂解液提供我的配方：氯化铵82.9克；重碳酸钾10.0克；EDTA0.37克；用三蒸水配成1升所有的细胞培养都应该坚守无菌操作原则2.分层后的确有3层，准确说来是4层，最下面是红细胞，上面的一层不应该是稍微混浊的白色，应该也比较透明，这一层上面就是我们需要的薄细胞层，最上面是血清3.细节：a.淋巴细胞分离液要避光保存b.就您的试验看来，淋巴细胞分离液的问题可能是最主要的c.首先再离心管中加入淋巴细胞分离液，然后把标本缓慢加在淋巴细胞分离液表面上，一定要缓慢小心操作，切不可混匀d.所有操作都应在无菌环境进行e.把离心管放入离心机是也应小心，不要太大幅度的摇幌离心管，当然离心后拿出来也要小心就这么多了吧，这个操作是不是很难的，比较基本祝您好运了！.参考方法：人外周血, 肝素抗凝(100U öm l) , 等量无血清培养液（或者PBS等缓冲液）稀释。

按1∶2 的体积比缓置于比重1. 077 g/m l 的淋巴细胞分离液, 1000 ×g 离心30 m in, 收集培养液2分离液界面上的单个核细胞。

于无血清培养液, 400×g 离心10 m in, 洗涤2次。

用培养液重新悬浮细胞并计数我也是最近要做所以查了一下，仅供分享，呵呵！一外周血白细胞的分离1> 取3ml正常人的外周血（枸橼酸钠抗凝）与等体积pbs混匀后小心的加于6ml白细胞分离液（（33.9%泛影葡胺和9%Ficoll液按1：2.4体积比混合））液面上，1500r/min离心20 min。

ficoll分离液分离外周血单个核细胞操作原理一、前言外周血单个核细胞是指没有细胞核的血细胞，如红细胞、血小板等。

分离外周血单个核细胞是许多实验室和临床诊断中常用的一项操作。

而ficoll分离液则是分离外周血单个核细胞时常用的一种试剂。

本文将详细介绍ficoll分离液的原理及其在分离外周血单个核细胞中的应用。

二、ficoll分离液1. 概述ficoll分离液是由Ficoll（Ficoll-400）和盐水（PBS或Hanks平衡盐溶液）组成的一种密度梯度试剂。

它主要用于体外培养、淋巴细胞和其他白细胞的分离。

2. 原理ficoll分离液利用了不同密度的细胞在密度梯度中沉降速度不同的原理。

在密度梯度中，密度大的物质沉降速度快，而密度小的物质沉降速度慢。

当样品加入到ficoll分离液中时，样品中含有不同密度的各种成分，如红细胞、白细胞、淋巴细胞等。

这些成分会在密度梯度中沉降，最终形成一个由不同密度的层次组成的梯度。

在ficoll分离液中，Ficoll-400的密度大于外周血单个核细胞，但小于红细胞和粒细胞。

当样品经过离心后，外周血单个核细胞会沉降到ficoll分离液中的某一层次中，并被分离出来。

而其他成分则会沉降到不同的层次中。

3. 优点ficoll分离液具有以下优点：（1）样品处理方便：只需要将样品加入到ficoll分离液中进行离心即可。

（2）操作简单：只需要进行一次离心即可将外周血单个核细胞从其他成分中分离出来。

（3）高效：能够快速、高效地将外周血单个核细胞分离出来。

三、操作原理1. 实验材料（1）ficoll分离液；（2）外周血样本；（3）PBS或Hanks平衡盐溶液；（4）15ml或50ml的锥形试管；（5）离心机。

2. 操作步骤（1）将外周血样本加入到15ml或50ml的锥形试管中；（2）加入等体积的PBS或Hanks平衡盐溶液，轻轻混合；（3）将ficoll分离液缓慢加入到试管中，使其与样品充分混合；（4）将试管放入离心机中，以800~1000g的速度离心30分钟；（5）离心后，可以看到样品被分成了不同层次。

外周血中PBMC分离
原理
外周血各种血细胞的密度不尽相同，利用淋巴细胞分层液（Ficoll）作密度梯度离心，使一定比重的细胞群按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。

实验步骤：
1.采血，稀释（外周血：稀释液=1：2）
2.在离心管中加入Ficoll，沿倾斜的管壁缓缓加入稀释的外周血（Ficoll：稀释血=1：2）
3.18℃，1500r/min，离心30min
4.轻轻吸取PBMC层移入另一试管中
5.加足量稀释液充分洗涤，1800 r/min离心5min ，弃上清。

分离全血中的PBMC注意事项：
1 每毫升外周血液大约可获1×106单个核细胞
2 Ficoll应适量，外周血应充分稀释，温度直接影响到Ficoll的比重和分离效果
3 在Ficoll上加入稀释外周血时，应缓慢加，以免冲散界面
4 吸取单个核细胞层时，应避免吸出过多的上清液或分层液而导致血小板污染。

人外周血白细胞分离液使用说明一、试剂的制备1.将人外周血样品采集入采血管中，并将其与抗凝剂轻轻混匀。

2. 采用无菌条件下，将采集的外周血放入离心管中，以2000 rpm的转速离心10分钟。

3.弃去上清液，保留沉淀，注意不要干扰底部白细胞沉积。

4. 向离心管中加入合适体积的分离液，通常建议将1 ml分离液加入约2 ml外周血样品中。

5. 使用离心机以2000 rpm的速度离心10分钟。

6.弃去上清液，并将其中的底泥转移到新离心管中。

7.向新的离心管中加入平衡液，与底泥充分混匀。

8. 使用离心机以2000 rpm的速度离心5分钟。

9.弃去上清液，并将底泥转移到合适的容器中。

10.向底泥中加入适量的培养基，细胞培养基通常是最常用的培养基。

二、试剂的存储1.试剂储存温度通常在2-8摄氏度之间。

2.开封后的试剂，建议在使用之前将其置于室温下适当回温。

3.试剂一旦开封，应避免重复的冻融循环，以防止对试剂活性造成损害。

4.尽量避免接触光线，以防止试剂活性的降低。

三、使用注意事项1.使用前，请确认试剂是否过期，过期试剂不得使用。

3.使用前，应先将分离液均匀搅拌，以保证其活性。

4.在试剂使用过程中，尽量避免受到湿气和阳光的影响。

5.将待提取的外周血样品严格根据提取方法进行操作，以获得高质量的白细胞。

6.在离心过程中，注意离心管的盖子要盖好，防止离心时离心液的外溢。

7.实验过程中，尽量避免反复提取，以避免对白细胞活性造成损害。

8.在培养细胞的过程中，注意细胞培养基的选择和培养条件的控制，以保证白细胞的健康生长。

四、注意事项1.本试剂仅供科研使用，禁止用于临床诊断等用途。

3.请按照相关实验室安全操作规范进行操作，做好个人防护措施。

4.请勿将试剂倒入下水道或垃圾箱中，应根据相关规定进行处理。

总结：通过以上的使用说明，我们可以了解到人外周血白细胞分离液的使用方法以及使用注意事项。

正确和规范使用试剂可以帮助我们获得高质量的分离液和细胞，进一步推动科学研究的进展。

外周血单个核细胞的分离
概述
外周血单个核细胞是一种白细胞。

通过分离单个核细胞，可以进行多种分子生物学实验和临床应用。

本文将介绍两种分离外周血单个核细胞的方法。

方法
密度梯度离心
1.将外周血收集到 EDTA 管中。

2.将 3 毫升 Ficoll-Paque™ PLUS 加入到 15 毫升离心管中。

3.轻轻加入同等体积的外周血到离心管，保持液面平整。

4.以 400g 的速度离心 40 分钟。

在离心温度达到室温前离心室门不得
打开。

5.用温和的力度将上清液吸出到新的离心管中，并在 1200g 的速度下
洗涤 2-3 次。

6.已经分离的单个核细胞可以在非抗凝血样上重悬。

此过程中加入生长
培养基以维持细胞质稳定。

磁性负选择法
1.将外周血收集到 EDTA 管中。

2.加入红细胞淋巴细胞分离液，根据厂家指南染色。

3.加入磁性微珠混合液，使单个核细胞与微珠组合。

4.放入磁场中过滤掉未与微珠组合的细胞及其他血细胞。

5.经过多次洗涤和离心，单个核细胞可以在非抗凝血样上重悬。

此过程
中加入生长培养基以维持细胞质稳定。

密度梯度离心法和磁性负选择法是分离外周血单个核细胞的两种有效方法。

这些方法对于多种分子生物学实验和临床应用都非常有用。

人外周血淋巴细胞分离液使用说明使用人外周血淋巴细胞分离液的步骤如下：1.样本准备：准备外周血样本，并将其采集到一个干净的试管中。

确保样本是新鲜的，并在使用前充分混合。

2.离心：将样本离心，以去除血浆或血浆和血小板，通常以低速（300×g）离心5-10分钟。

将离心管中的血浆小心吸除。

3.阻止红细胞溶解：加入足够的红细胞阻断缓冲盐溶液到血细胞沉淀中，使其与样本体积相等。

这将阻止红细胞的溶解和污染淋巴细胞。

4.包裹淋巴细胞：将滤质或管中的混合物转移到一个滤筒或离心管中，并加入合适的分离液。

分离液的添加量通常是样本体积的2-3倍。

5.混合和离心：彻底混合分离细胞和分离液，然后以适当的速度和时间进行高速离心（500×g，5-10分钟）。

此步骤将导致淋巴细胞在分离液的底部形成一个沉淀。

6.转移沉淀：使用无菌吸管或移液器小心地将沉淀转移到干净的离心管中，以避免污染。

7.洗涤：向沉淀中加入足够的平衡缓冲盐溶液，如磷酸缓冲盐溶液，轻轻混合后进行低速离心。

再吸去上清液，保留沉淀。

8.储存：沉淀可在冷藏条件下暂时储存，或冷冻保存以备将来使用。

需要注意的是，在使用人外周血淋巴细胞分离液时，一些步骤可能因其具体的类型和制造商而有所不同。

因此，建议在使用前仔细查阅并遵守产品说明书和使用手册。

此外，使用前要确保实验室操作是在严格的无菌条件下进行的，以避免污染和细胞的损伤。

总而言之，人外周血淋巴细胞分离液是一种用于从人类外周血样本中分离和富集淋巴细胞的试剂。

准确遵循产品说明和使用手册中的步骤和建议，能够帮助实验者在研究和临床应用中有效地使用该分离液。

人外周血中性粒细胞分离液试剂盒使用说明货号：P9040规格：2×200mL/kit保存：18℃-25℃保存，有效期两年。

人外周血中性粒细胞分离液试剂盒易感染细菌，需无菌条件下操作。

无菌条件下操作，启封后常温保存。

如4℃保存，本分离液易出现白色结晶，影响分离效果。

试剂盒内容：试剂A200mL试剂C200mL清洗液（赠品）200mL红细胞裂解液（赠品）100mL说明书1份操作步骤：情况A:血液样本小于5mL时，实验方法如下：1.取一支15mL离心管，先加入3mL试剂A后加入2mL试剂C，制成梯度界面。

2.用吸管小心吸取血液样本加于分离液之液面之上，400-500g，离心20-30min（注：如改变血液样本及分离液用量，需相应调整离心力及离心时间，具体离心条件需客户自行摸索，以达到最佳分离效果。

）3.离心后，离心管中将出现两层环状乳白色细胞层，上层为单个核细胞，下层细胞为中性粒细胞。

4.用吸管小心吸取分离液中的中性粒细胞层，如有红细胞混杂则加入适量的红细胞裂解液，将红细胞裂解，即得目的细胞。

5.将获得的细胞层移至另一15mL离心管中，向所得离心管中加入10mL清洗液，混匀细胞。

6.250g，离心10min。

7.弃上清。

8.用5mL清洗液重悬所得细胞。

9.250g，离心10min。

10.重复7、8、9，弃上清后以0.5mL后续实验所需相应液体重悬细胞。

情况B:血液样本大于等于5mL时，实验方法如下：1.取一支适当的离心管，依次小心加入试剂A、试剂C（试剂A与试剂C体积比为3:2，试剂总量与稀释后的样本量相等），制成梯度界面。

2.将血液样本小心加于分离液之液面上，450-650g（最大离心力可至1000g），离心20-30min。

（注：根据血液样本量确定离心条件，血液量越大，离心力越大，离心时间越长，具体离心条件需要客户自己摸索，以达到最佳分离效果。

加入血液样本后，样本及分离液总体积不得超过离心管总体积的三分之二）。

第1篇一、产品概述本产品为一种生物医学试剂，主要用于从人血液中分离纯化淋巴细胞。

淋巴细胞是人体免疫系统的重要组成部分，广泛用于免疫学研究和临床诊断。

本产品采用特殊的分离技术，能够高效、快速地从人外周血中分离出高纯度的淋巴细胞，为后续的免疫学研究提供高质量的实验材料。

二、产品规格| 产品规格 | 批号 | 有效期 || :-------: | :---: | :----: || 100ml/瓶 | ABC123 | 2025年12月 |三、产品特性1. 高效分离：本产品采用独特的分离介质，能够高效地将淋巴细胞与其他血细胞分离，分离效率高，纯度好。

2. 操作简便：本产品使用方法简单，无需特殊设备，适合实验室常规操作。

3. 稳定性好：本产品在规定的储存条件下，稳定性良好，保质期内质量稳定。

4. 无污染：本产品在生产过程中严格遵循无菌操作规程，产品无细菌、病毒等生物污染。

四、产品用途1. 免疫学研究：用于分离淋巴细胞，进行细胞因子检测、细胞培养、细胞因子基因表达等研究。

2. 临床诊断：用于检测血液中的淋巴细胞，辅助诊断某些疾病，如自身免疫性疾病、肿瘤等。

3. 药物研发：用于药物筛选、药效评价等。

五、使用方法1. 准备工作：- 将分离液室温下平衡至室温。

- 准备无菌试管、移液器、吸头等实验器材。

- 准备适量抗凝剂（如EDTA-K2）。

2. 操作步骤：- 将抗凝全血加入分离管中，轻轻混匀。

- 将分离液加入另一支无菌试管中，加入量约为全血量的2倍。

- 将全血和分离液轻轻混合，避免产生气泡。

- 将混合后的样品垂直静置1-2小时，直至形成清晰的三层界面。

- 小心吸取淋巴细胞层，避免混入其他细胞层。

- 将淋巴细胞转移至新的无菌试管中，加入适量磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤，重复洗涤2-3次，以去除残留的分离液和杂质。

- 最后，将洗涤后的淋巴细胞悬浮于适量的PBS中，即可进行后续实验。

六、注意事项1. 操作过程中应严格遵守无菌操作规程，防止污染。

人外周血淋巴细胞分离液使用说明人外周血淋巴细胞分离液（Peripheral Blood Lymphocyte Separation Medium）是一种广泛应用于分离人外周血中淋巴细胞的试剂，被广泛应用于免疫学和生物医学研究领域。

该试剂通过层析技术，可快速、高效地分离出外周血中的淋巴细胞，供后续的分析和实验使用。

一、试剂组成人外周血淋巴细胞分离液的主要成分包括离心管分层缓冲液、细胞分离密度悬液、所需的辅助试剂和脏器灭菌液等。

离心管分层缓冲液的成分通常包含氯化钠、氯化无水亚铁、酵母精、酵母根、胰蛋白水解物、洋葱提取物、N-酰胺毛细管蓝等。

细胞分离密度悬液则通常包含氯化钠、氯化无水亚铁、葡萄糖、胰蛋白水解物等，以及一些辅助试剂如生理盐水、浓度为2%的纯度高粘度明胶等。

辅助试剂方面，常用的有人凝血酶、去细菌酶、维生素C和青霉素等。

脏器灭菌液则是为了确保细胞分离过程中试剂和设备的无菌。

二、试剂使用方法1.准备工作在开始实验前，应准备好所需的实验试剂和设备，并确保所用的所有物品和材料都是无菌的。

同时，应将离心管分层缓冲液和细胞分离密度悬液放在常温下静置30分钟以上。

2.外周血分离取相应容量的外周血标本，在无菌条件下加入带有抗凝剂的离心管中，并轻轻倾转混合均匀，避免凝块形成。

置于无菌离心管架中，以1000-1500r/min离心5-10分钟，离心后分血浆、白细胞层和红细胞层。

3.分离淋巴细胞将离心后的中间白细胞层完全转移至新的离心管中，加入适量的生理盐水进行洗涤，离心1500r/min 5分钟。

倒掉上清液，留下沉淀。

重复该步骤2-3次。

洗涤后，加入等量的细胞分离密度悬液轻轻混合，再次离心。

离心1000r/min 20分钟。

此步骤可以使淋巴细胞充分分离。

4.收集淋巴细胞将分离好的淋巴细胞沉淀取出，加入等量的生理盐水或适宜的培养基中进行悬浮，使淋巴细胞悬浮液浓度适宜。

然后可以根据实验需要进行后续分析和实验操作。

人全外周血血浆与PBMC分离
前期准备：离心机降温；
冻存液配制：血清：DMEM:DMSO按5：4：1的比例配制
1.拿到血，配平，500g x4℃离心5分钟，升6降5(加速度);
2. 上清为血浆，取上清分装至冻存管保存至-80℃冰箱；
3.往剩余的血中加入3-4ml PBS稀释血液，取50ml离心管加入15-20ml人外周血淋巴细胞分离液(Ficoll) ，用胶吸管将血缓慢加入装ficoll的离心管中。

4．400g x20℃离心25分钟，升5降0(加速度);
5.离心完后轻轻吸掉上清，取中间飘浮的一层细胞，加4-5ml PBS，400G离5分钟，升6降5(加速度),
6. （方法同冻细胞）加入3-5ml冻存液，分装至冻存管冻存3-5管，转到程序降温盒，放入-80℃冰箱冻存。

人外周血白细胞DNA提取标准操作规程(SOP)（血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)）1实验原理本法采用血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)，从全血中分离白膜层，去除其中的红细胞及蛋白质，裂解白细胞释放DNA，再通过去除DNA中的杂质使其纯化，得到高纯度的DNA原液，最后使用微量紫外可见分光光度计对DNA的浓度及纯度进行定量检测。

22.12.22.32.42.52.62.72.82.933.13.23.3373.43.5缓冲液GB（裂解白细胞，释放DNA），若溶液产生沉淀，使用前应在37℃水浴中预热10min,以溶解沉淀。

3.6无水乙醇（沉淀DNA，去除杂质）3.7缓冲液GD（去除蛋白质），使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇。

3.8缓冲液PW（去除盐），使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇。

3.9洗脱缓冲液TE（保存DNA）4实验步骤4.1样品的采集与保存：用装有EDTA的塑料管采集2mL静脉血，2000rpm离心5min，可见分层，分别为血浆层、白膜层、红细胞，将血浆吸出弃去，再通过点吸的方式将白膜层全部吸出，置于干净的1.5mL EP管备用。

如无法及时提取DNA，则应置于-80℃进行保存。

4.2样品预处理：4.2.1裂解红细胞：通过低速涡旋15s混匀样品，取150μL样品置于干净的1.5mL EP管，加入750μL红细胞裂解液，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀5min，然后10000rpm离心2min，吸去上清，留下白细胞沉淀。

4.2.2重悬白细胞：加入200μL缓冲液GA，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀3~5min，使白细4.2.34.2.410min，704.2.515s，简4.2.64.2.7吸附柱4.2.81min，4.2.9CB3洗脱50μL 洗脱缓冲液TE，室温放置5min，12000rpm离心2min，将溶液收集到1.5mL EP管中，如无法及时测定，应置于-80℃进行保存。

PBMC的分离物品准备：外周血来源的白细胞浓缩液、生理盐水、50ml注射器×1、20ml注射器×3、10ml注射器×2、50ml离心管×7、15ml离心管×4、淋巴细胞分离液分离步骤：1、将外周血来源的白细胞浓缩液用生理盐水1：1稀释，从离心管边缘轻轻加于淋巴细胞分离液上面（淋巴细胞分离液与外周血来源的白细胞浓缩液等体积），离心（2000r/min，20min，22℃），分离白膜层细胞即外周血单个核细胞（PBMC）。

2、用培养液洗涤5-6次（离心速度1500r 15min-1500r 15min-1000r10min-800r 10min-800r 5min），用含10%的胎牛血清的RPMI 1640液调整细胞浓度为2×106 /ml，加入6孔板，于37℃，5% CO2孵育箱培养2h，吸去悬浮的细胞，用温热的RPMI 1640培养液洗涤2遍，所得的贴壁细胞即DC前体细胞。

3、所吸去的悬浮细胞为淋巴细胞，用含10％的胎牛血清的RPMI 1640（含终浓度为800U/L的rhIL-2）重悬，计数并调整细胞密度为1×106/ml，置于75cm2培养瓶内，37℃，5% CO2孵育箱培养，隔天换含新鲜IL-2的RPMI 1640培养液维持细胞活力，待用。

注意事项：1、密度梯度离心时，加速度宜慢2、密度梯度离心时间不宜过长，对细胞损伤较大3、如分离后的细胞悬液中有较多红细胞，可使用红细胞裂解液，37℃裂解5min，注意裂解时间不宜过长，以免一项单核细胞活性4、稀释血和分离液的比例可以是1：1或2：1，最好达离心管的1/2-2/3，1/2最好，分层明显，即50ml的离心管只装到30ml5、吸取白膜层时，注意不要吸到分离液，可以先吸去血浆层6、注意淋巴细胞分离液和细胞培养液使用前都应水浴至室温7、离心后离心管中液体分为5层：血浆层、PBMC层、分离液层、粒细胞层、红细胞层。

人外周血淋巴细胞分离液使用说明货号：P8610规格：200ml保存：室温避光储存，有效期至少2年。

产品简介：外周血中单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞等细胞，其体积、形态和密度与其他细胞不同，红细胞和粒细胞密度较大，为1.090g/ml左右，而淋巴细胞和单核细胞密度为1.075～1.090g/ml，血小板为1.030～1.035g/ml。

为此，将葡聚糖(右旋糖酐)和泛影酸葡甲胺按一定比例混合，调整比重、pH值和渗透压，经过澄清及过滤除菌后制成一种密度在1.077g/ml并且近于等渗的溶液（分层液），经过密度梯度离心使一定密度的细胞按相应密度梯度分布，从而将各种血细胞加以分离。

人外周血淋巴细胞分离液为带有乳光或微乳光的注射水溶液，主要组成成份是葡聚糖（右旋糖酐）与泛影酸葡甲胺。

适用于从人抗凝血液中分离单个核细胞（主要为淋巴细胞），无菌条件下所分离的细胞可用于免疫学检测。

分离液法说明及图例：取新鲜抗凝血1ml，与生理盐水1:1混匀后，小心加于2ml细胞分离液之液面上；以400g（约1500转/分，半径15cm水平转子）离心20分钟，此时离心管中由上至下细胞分四层。

第一层：为血浆层。

第二层：为环状乳白色淋巴细胞层。

第三层：为透明分离液层。

第四层：为红细胞层。

收集第二层细胞放入含生理盐水4-5ml的试管中，充分混匀后，以400g （约1500转/分）离心20分钟。

沉淀经2次洗涤后即得所需淋巴细胞。

注：提取率约为80%。

注意事项：A．本分离液要求血液为新鲜抗凝血，避免冷冻和冷藏；在收集血液和分离过程中，应注意无菌操作，避免微生物污染。

B．本实验要求，在正常大气压下，分离液、分离样本以及分离环境温度为20℃±2℃。

分离液在低温时呈较高密度，在高温时呈较低密度。

细胞分离液从冰箱取出后，不可立即使用，操作前可将样本和分离液置于20℃水浴中复温20分钟以保证分离温度。

C．由于各品牌离心机的性能不同，国内南北地区温度环境和四季的差异，可能影响分离效果，用户可以调节离心转数和离心时间，摸索最佳的分离条件（具体分离条件各实验室自定）。

人外周血白细胞DNA提取标准操作规程(SOP) （血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)）1实验原理本法采用血液/组织/细胞基因组提取试剂盒(DP304)，从全血中分离白膜层，去除其中的红细胞及蛋白质，裂解白细胞释放DNA，再通过去除DNA中的杂质使其纯化，得到高纯度的DNA原液，最后使用微量紫外可见分光光度计对DNA 的浓度及纯度进行定量检测。

2实验仪器2.1 1.5ml EP管2.2微量移液器，10μL、50μL、200μL、1000μL2.3涡旋振荡器2.4数显恒温搅拌循环水箱2.5吸附柱CB32.6收集管2.7离心机2.8涡旋振荡器2.9微量紫外可见分光光度计（Thermo NanoDrop1000）3实验试剂3.1正常人混合血液，应避免反复冻融，否则会导致提取的DNA片段较小且提取量下降。

3.2红细胞裂解液（裂解红细胞）3.3缓冲液GA（轻微裂解作用，为蛋白激酶K提供反应环境），若溶液产生沉淀，使用前应在37℃水浴中预热10min,以溶解沉淀。

3.4蛋白激酶K（裂解蛋白质）3.5缓冲液GB（裂解白细胞，释放DNA），若溶液产生沉淀，使用前应在37℃水浴中预热10min,以溶解沉淀。

3.6无水乙醇（沉淀DNA，去除杂质）3.7缓冲液GD（去除蛋白质），使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇。

3.8缓冲液PW（去除盐），使用前应按照试剂瓶标签的说明加入无水乙醇。

3.9洗脱缓冲液TE（保存DNA）4实验步骤4.1样品的采集与保存：用装有EDTA的塑料管采集2mL静脉血，2000rpm离心5min，可见分层，分别为血浆层、白膜层、红细胞，将血浆吸出弃去，再通过点吸的方式将白膜层全部吸出，置于干净的1.5mL EP管备用。

如无法及时提取DNA，则应置于-80℃进行保存。

4.2样品预处理：4.2.1裂解红细胞：通过低速涡旋15s混匀样品，取150μL样品置于干净的1.5mL EP管，加入750μL红细胞裂解液，通过手摇振荡的方式进行颠倒混匀5min，然后10000rpm离心2min，吸去上清，留下白细胞沉淀。

人外周血B、T淋巴细胞的分离方法介绍
1.在短中管中加入适量淋巴细胞分离液。

2.取肝素抗凝静脉血与等量Hank's液或RPMI1640充分混匀，用滴管沿管壁缓慢叠加于分层液面上，注意保持清楚的界面。

水平离心2000rpm×20分钟。

3.离心后管内分为三层，上层为血浆和Hank's液，下层主要为红细胞和粒细胞。

中层为淋巴细胞分离液，在上、中层界面处有一以单个核细胞为主的白色云雾层狭窄带，单个核细胞包括淋巴细胞和单核细胞。

此外，还含有血小板。

4.用毛细血管插到云雾层，吸取单个核细胞。

置入另一短中管中，加入5倍以上体积的Hank's液或RPMI1640，1500rpm×10分钟，洗涤细胞两次。

5.末次离心后，弃上清，加入含有10％小牛血清的RPMI1640，重悬细胞。

取一滴细胞悬液与一滴0.2％台盼兰染液混合，于血球计数板上，计数四个大方格内的细胞总数。

6.细胞活力检测：死的细胞可被染成兰色，活细胞不着色。

计数200个淋巴细胞。

计算出活细胞百分率。

人外周血白细胞DNA提取标准操作规程SOP1. 目的本操作规程旨在提供人外周血白细胞DNA提取的标准化操作流程，以确保提取的DNA质量和纯度满足研究和分析的需求。

2. 适用范围本操作规程适用于实验室中进行人外周血白细胞DNA提取的操作。

3. 材料和试剂3.1 废弃针头、注射器、离心管等；3.2 PBS缓冲液；3.3 红细胞裂解缓冲液；3.4 DNA提取试剂盒（根据实验室情况自行选择或可商用）；3.5 无菌去离子水；3.6 乙醇（95%和75%）；3.7 氯仿。

4. 设备4.1 基础实验室设备，例如离心机、恒温摇床、移液器等；4.2 电子天平；4.3 水浴加热器；4.4 倒置显微镜。

5. 操作步骤5.1 准备工作5.1.1 将离心管标记为样品编号，记录于实验记录表中；5.1.2 准备所需材料和试剂。

5.2 样本处理5.2.1 用注射器将2 ml新鲜外周血加入1 ml的PBS缓冲液中；5.2.2 缓慢加入红细胞裂解缓冲液，使比例为1:9，充分混匀；5.2.3 静置5分钟，离心3000 rpm，室温5分钟；5.2.4 倒出上清液，不移动沉淀。

5.3 DNA提取5.3.1 加入适量去离子水彻底悬浮沉淀，充分混匀；5.3.2 加入适量DNA提取试剂，按厂家说明书操作；5.3.3 用水浴加热器进行DNA裂解，按厂家说明书操作；5.3.4 离心，去除上清液；5.3.5 加入乙醇进行洗涤，按厂家说明书操作；5.3.6 离心，去除上清液；5.3.7 加入75%乙醇进行二次洗涤，按厂家说明书操作；5.3.8 用水浴加热器或空气干燥仪将离心管干燥。

6. 质量控制6.1 使用电子天平将提取的DNA称重，记录于实验记录表中；6.2 使用比色计或其他适当的方法检测DNA浓度和纯度，记录于实验记录表中；6.3 使用凝胶电泳方法检测DNA的完整性。

7. 结果记录将实验记录、样本编号、DNA提取量、浓度和纯度等结果记录在实验记录表中，确保准确性和可追溯性。

人外周血白细胞分离液试剂盒规格：200mL/kit保存：本产品对光敏感，应该室温避光储存，保质期2年。

无菌开封后，保存于室温。

试剂盒组成：各种动物外周血白细胞分离液200mL 细胞洗涤液200mL 红细胞裂解液100mL操作步骤：1.取新鲜抗凝全血（EDTA 、枸橼酸钠或肝素抗凝均可）或者去纤维蛋白血液。

2.在离心管中加入适量分离液（血液体积小于5mL 时，加入5mL 分离液；大于等于5mL ，加入等体积分离液。

但二者的总体积不能超过离心管的三分之二，否则会影响分离效果），将血液平铺到分离液液面上方，注意保持两液面界面清晰。

（可以使用巴氏德吸管吸取血液，然后将血液小心的平铺于分离液上，因为两者的密度差异，将形成明显的分层界面。

如果样品较多，加样的时间较长，在离心之前出现红细胞成团下沉属正常现象。

）3.室温，水平转子500~1000g ，离心20~30min （血液的体积越大所需的离心力越大，离心时间越长，最佳的分离条件需摸索，离心转速最大不超过1200g ）。

4.离心后将出现明显的分层：最上层是稀释的血浆层；血浆与分离液之间是淋巴细胞层；分离液中为粒细胞层（个体差异或者是分离条件不同，粒细胞层可能分离不明显）；最下层为红细胞层。

5.小心的吸取淋巴细胞层及分离液层细胞到15mL 洁净的离心管中，10mL PBS 或细胞洗涤液洗涤细胞。

250g ，离心10min （如有红细胞混杂则加入适量红细胞裂解液）6.弃上清，5mL 的PBS 或细胞清洗液重悬细胞，250g ，离心10min 。

7.重复步骤68.弃上清，细胞重悬备用。

注意事项：A.开封前颠倒混匀，本分离液为无菌产品，为延长分离液保存时间，请在无菌条件下启封，避免微生物污染。

B.分离液使用时应始终保持室温（18℃~25℃），如室内温度较低，可将分离液预热。

4℃或者是温度较低的条件下离心，可能会导致白膜层中红细胞污染加重。

C.血液样本最好为新鲜抗凝血（采血2h 以内），为保持淋巴细胞的活性，应避免冷冻和冷藏。