小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告

实验 18 外周血淋巴细胞分离方法目的了解密度梯度离心法分离淋巴细胞的原理及其操作过程。

原理淋巴细胞分离掖是由60%的聚蔗糖2份和34%的泛影葡胺1份混合制成。

它具有分子量大、无化学活性、20℃时比重为1.077士0.001的特性。

血液中各种细胞的比重不同，淋巴细胞与单核细胞的比重约为1.070，而粒细胞和红细胞的比重为1.092左右。

将血液加至分离液上，通过离心，可使一定比重的细胞按相应密度梯度进行分布，从而将淋巴细胞与其它血细胞分离开。

材料1. 淋巴细胞分离液(比重1.077土0.001)。

2. 肝素。

3. 无Ca2+、Mg2+的Hanks溶液，pH7.2～7.6。

4. RPMI-1640培养液(含10%小牛血清)。

5. 其它:注射器、吸管、滴管（均为无菌）,血球计数板，水平离心机，显微镜等。

方法1. 无菌抽取静脉血2ml，去掉针头注人含有肝素的无菌试管中摇匀，加入2ml Hanks溶液进行对倍稀释，混匀。

2. 用吸管吸取稀释血液沿试管壁缓缓加到含有2ml淋巴细胞分离液的试管中（血液:Hanks液:淋巴细胞分离液的比例为1:1:1），沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面。

3. 经水平式离心2000r/min×20min，小心取出试管。

4. 用平口吸管小心吸取中层呈白色雾状的淋巴细胞层，用Hanks溶液洗涤两次，每次离心1500r/min ×10min。

5. 弃上清，加RPMI-1640培养液1ml混匀，取少许进行细胞计数及活力测定。

（1）细胞计数: 取1滴细胞悬液置血球计数板上，静置片刻，显微镜下计数四角四个大方格内的细胞数（见图15），按下列公式计算出细胞总数。

四个大方格细胞总数×稀释倍数×细胞悬液毫升数×104细胞总数= 4（2）台盼蓝拒染法测定细胞活力: 取4份0.2%台盼蓝与1份4.25%生理盐水混合，将台盼蓝生理盐水溶液与细胞悬液等量混合，在3分钟之内压片，在光学显微镜下计数未染色的细胞（为活细胞）与染色细胞（染成兰色,为死细胞），计算活细胞占细胞总数的百分数。

小鼠外周血单个核细胞分离、纯化徐太哲;李丽;王长山【摘要】目的:探讨小鼠外周血单个核细胞(PBMC)最佳分离条件,提高细胞获得率与纯度,以便后续分子生物学实验.方法:小鼠摘除眼球取血,设置离心力、离心时间、实验环境温度等梯度优化,分别采用EDTA-K2、肝素、枸橼酸钠抗凝,Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞,直接进行贴壁培养和分析获得率、纯度,计数存活率.结果:Ficoll密度梯度离心法经条件优化后分离的PBMC纯度可达85％,细胞获得率最高可达80％以上,活细胞百分率在92％以上.结论:Ficoll密度梯度离心法在优化条件下可有效地分离PBMC,对后续分子生物学实验无影响.【期刊名称】《黑龙江医药科学》【年(卷),期】2016(039)004【总页数】3页(P10-11,13)【关键词】小鼠;Ficoll密度梯度离心;PBMC【作者】徐太哲;李丽;王长山【作者单位】佳木斯市红十字医院,黑龙江佳木斯154003;佳木斯大学,黑龙江佳木斯154007;佳木斯大学,黑龙江佳木斯154007【正文语种】中文【中图分类】R446.11+3外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)包括淋巴细胞和单核细胞。

是免疫系统的重要组成，是研究免疫老化和衰老的主要依据。

研究T、B淋巴细胞首要分离外周血单个核细胞，主要的分离方法是Ficoll-hypaque密度梯度离心法，因血液中各组成成分的沉降系数存在差异，而得以分离[1]。

离心后，单个核细胞因与分离液密度相当，集中在血浆层和分层液的界面上，呈白雾层，吸取该层细胞经洗涤离心即获得PBMC。

PBMC分离是分子生物学试验常用的技术，其效果直接影响PCR等后续试验结果。

实验对象小鼠因体重小，体内血液量少，Ficoll密度梯度离心法正适用这样少量血液的分离，本文探讨小鼠外周血单个核细胞的分离最佳条件。

1.1 材料与分组BALB/c小鼠18只，5～6月龄，体重23～25g，雌雄不限；小鼠外周血单核细胞分离液试剂(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)。

淋巴细胞转化实验报告本实验旨在探究淋巴细胞的转化过程及其影响因素。

实验过程中，将淋巴细胞与一种称为“共同诱导剂”的物质一起培养，观察其细胞增殖情况，并对其进行形态、生物学指标等方面的分析。

实验设备：1.淋巴细胞分离液2.共同诱导剂3.2.5％DMSO4.96孔板5.无菌蒸馏水6.比色计7.显微镜实验步骤：1.将新鲜小鼠脾脏切割成碎片，加入10ml的淋巴细胞分离液中，用离心机将其离心5min，取上清液为淋巴细胞。

2.将淋巴细胞洗涤三次，倒掉上清并加入10ml新的淋巴细胞分离液进行离心。

重复该步骤3次，以去除悬浮在淋巴细胞上的血红细胞和血小板。

3.将10μl细胞悬液加入90μl试验液（不含共同诱导剂），分别加入5% DMSO，共同诱导剂和一个对照组，分别孵育24h，48h和72h。

4.将80μl的淋巴细胞悬液加入新的96孔板中。

根据实验要求进行加药与相应的控制。

5.将淋巴细胞36h悬液转移到新的96孔板中，各包含80μl，进行形态学观察。

6.将淋巴细胞72h转移，在比色计中检测细胞增殖情况，计算得到相应的增殖指数（SI）。

实验结果：1.形态观察通过显微镜观察淋巴细胞的形态学变化。

对照组：淋巴细胞间距等距，无细胞破裂或缺损。

5% DMSO：淋巴细胞受到较严重的损伤，细胞全部变形。

共同诱导剂：淋巴细胞形态多样性，出现组织块状聚集现象。

2.细胞增殖情况70h后，比色计检测增殖情况。

对照组：SI为15% DMSO：SI为0.4共同诱导剂（分析不同剂量）：(a) 0.01ug/ml：SI为1.8(b) 0.1ug/ml：SI为2.7(c) 1.0ug/ml：SI为2.1实验分析：淋巴细胞转化是一种细胞增殖的过程，在此过程中细胞数量增加。

转化可分为自发转化和体外诱导转化两种形式。

体外诱导转化中，加入化合物或病毒等诱导剂，以刺激细胞增殖。

本实验中，采用的淋巴细胞采用体外诱导转化的形式。

实验结果表明，共同诱导剂对淋巴细胞转化具有明显的促进作用，而DMSO对淋巴细胞的增殖有一定的抑制作用。

小鼠淋巴细胞转化实验总结小鼠淋巴细胞转化实验总结引言：淋巴细胞转化实验是一项重要的实验技术，用于研究免疫系统的功能和细胞活性。

通过观察淋巴细胞在体外是否能够发生转化并增殖，我们可以评估免疫细胞的活性和对外部刺激的响应能力。

本文将对小鼠淋巴细胞转化实验进行总结，并对其进行分析和讨论。

1. 实验目的及原理淋巴细胞转化实验的目的是评估淋巴细胞在刺激下的增殖和分化能力，以便更好地理解其对外界刺激的免疫应答能力。

实验的原理基于一种特殊的细胞生长因子——白介素-2（IL-2）的作用。

IL-2对淋巴细胞起到促进增殖和活化的作用，因此通过观察淋巴细胞在IL-2作用下的生长情况，可以推测细胞对外部刺激的敏感性和响应能力。

2. 实验步骤及结果该实验可以分为以下几个步骤：1) 收集小鼠淋巴组织：选择适当的小鼠种类，例如BALB/c小鼠，通过剖腹取出小鼠的淋巴组织，如脾脏、淋巴结等。

2) 组织均质化：将收集到的淋巴组织进行细胞离心和均质化处理，以获得单细胞悬浮液。

3) 细胞计数和调整：使用显微镜和血球计数板对细胞进行计数，并根据需要调整细胞浓度。

4) 增殖实验：将细胞悬浮液分配到不同的培养皿中，并加入不同浓度的IL-2刺激因子。

分别设立对照组和实验组，观察细胞的生长情况，可使用细胞计数、MTT等方法评估增殖情况。

5) 分化实验：通过流式细胞术或荧光显微镜等方法观察细胞的分化情况，如淋巴细胞亚群的变化、细胞表面标记物的表达等。

根据实验结果，我们可以通过对细胞的增殖和分化情况进行定量和定性的分析。

实验组中，淋巴细胞在IL-2刺激下明显比对照组增殖更多，并且可观察到细胞表面标记物的变化，这表明外源刺激对淋巴细胞的活化和增殖具有显著的促进作用。

3. 深入讨论与理解小鼠淋巴细胞转化实验不仅可以评估免疫细胞的活性和对外部刺激的响应能力，还可以进一步研究不同免疫细胞亚群的功能差异和相互作用机制。

例如，我们可以通过添加特定的抑制剂或中和抗体来研究不同信号通路在细胞转化过程中的作用；也可以使用荧光标记和流式细胞术技术，对特定细胞亚群进行分离和分析，以深入揭示不同亚群在免疫应答中的功能和调控机制。

一、实验目的1. 了解小鼠血液的基本组成和功能。

2. 掌握血液采集和分离的方法。

3. 学习血液细胞计数和生化指标检测的基本技术。

二、实验原理血液是人体和动物体内的重要液体组织，主要由血浆和血细胞组成。

血浆负责运输营养物质、激素、氧气和二氧化碳等，血细胞则负责免疫、凝血和氧气运输等功能。

本实验通过采集小鼠血液，分离血浆和血细胞，观察其形态和计数，以及检测生化指标，以了解小鼠血液的基本状况。

三、实验材料与仪器1. 实验动物：健康雄性小鼠，体重20-25g。

2. 仪器：离心机、显微镜、血细胞计数板、生化分析仪等。

3. 试剂：抗凝剂、生理盐水、稀释液、染液等。

四、实验步骤1. 采集血液：将小鼠放入代谢笼，用脱脂棉蘸取酒精擦拭小鼠耳部，暴露耳静脉。

用注射针头插入耳静脉，抽取5mL血液，加入含有抗凝剂的试管中，混匀。

2. 分离血浆和血细胞：将血液样本置于离心机中，以3000r/min离心10分钟。

离心后，将上层血浆取出，下层血细胞沉淀置于另一个试管中。

3. 观察血细胞形态：取少量血细胞沉淀，加入染液，用显微镜观察血细胞形态，包括红细胞、白细胞和血小板。

4. 血细胞计数：将血细胞沉淀用稀释液稀释，用血细胞计数板计数红细胞、白细胞和血小板数量。

5. 生化指标检测：取少量血浆，用生化分析仪检测血糖、血脂、肝功能、肾功能等生化指标。

五、实验结果1. 血细胞形态：观察到的红细胞呈双凹圆盘状，白细胞有核，血小板呈不规则形状。

2. 血细胞计数：- 红细胞计数：5.0×10^6个/μL- 白细胞计数：1.0×10^4个/μL- 血小板计数：1.5×10^6个/μL3. 生化指标检测：- 血糖：4.5mmol/L- 血脂：正常- 肝功能：正常- 肾功能：正常六、实验讨论1. 实验结果表明，小鼠血液中红细胞、白细胞和血小板数量正常，说明小鼠血液处于健康状态。

2. 血细胞形态观察结果与理论相符，红细胞呈双凹圆盘状，白细胞有核，血小板呈不规则形状。

淋巴细胞分离实验报告淋巴细胞分离实验报告引言：淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，具有免疫应答和免疫调节的功能。

淋巴细胞分离实验是研究淋巴细胞功能的重要手段之一。

本实验旨在通过离心法和梯度离心法分离和纯化淋巴细胞，并验证其纯度和活力。

实验材料：- 血液样本- PBS缓冲液- 淋巴细胞分离液- Ficoll梯度离心液- 离心管- 移液管- 显微镜- 细胞计数板- 无菌培养皿- 37℃恒温培养箱实验步骤：1. 血液预处理：将新鲜的血液样本加入无菌离心管中，加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。

注意避免气泡的产生。

2. 离心分层：将离心管放入离心机中，以2000rpm的速度离心10分钟。

离心后，可观察到血液分为三个层次：上层为血浆，中层为白细胞和淋巴细胞，下层为红细胞。

3. 分离淋巴细胞：将中间层的白细胞和淋巴细胞转移至新的离心管中，加入等体积的PBS缓冲液。

轻轻混合后，以1000rpm的速度离心10分钟。

此步骤的目的是去除红细胞和血浆。

4. 梯度离心：将混合后的细胞悬液加入离心管中，并缓慢滴加Ficoll梯度离心液。

注意避免两种液体混合。

离心管中的液体应该形成明显的两层。

5. 离心分层：将离心管放入离心机中，以1500rpm的速度离心30分钟。

离心后，可观察到淋巴细胞在上层梯度液中形成一个白色的浑浊环。

6. 分离淋巴细胞：使用移液管将上层梯度液中的淋巴细胞转移至新的离心管中。

加入等体积的PBS缓冲液，轻轻混合。

以1000rpm的速度离心10分钟，去除梯度液。

7. 洗涤淋巴细胞：将淋巴细胞沉淀用PBS缓冲液洗涤三次，以去除梯度液和离心液中的残留物。

8. 细胞计数和活力检测：取适量的淋巴细胞悬液，用细胞计数板进行细胞计数，并观察细胞形态。

同时，使用显微镜观察细胞的活力和完整性。

结果与讨论：通过以上实验步骤，我们成功地分离和纯化了淋巴细胞。

在离心分层和梯度离心的过程中，红细胞和血浆被有效地去除，从而得到了较为纯净的淋巴细胞。

淋巴细胞提取一实验目的：小鼠脾淋巴细胞提取二实验对象：B／C 小鼠三实验器材：1．试剂：淋巴细胞分离液、1640培养基2．器材：无菌培养皿、200目尼龙网（裁成90mm*90mm正方形，灭菌）、10mL玻璃注射器内活塞（灭菌）、不同规格的镊子、剪刀若干（灭菌）、细胞实验常用器材（离心管、移液管、加样枪、离心机）、75%乙醇、烧杯（无菌）、大头针、超净台四实验步骤：1、断头处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。

2、在超净台中小心剪开小鼠腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠腹腔，用镊子摘下小鼠脾脏。

注意无菌操作。

3、参考图一，在35mm培养皿中放入4-5ml淋巴细胞分离液（使用前摇匀淋巴细胞分离液）。

用镊子固定尼龙网，然后用注射器活塞轻轻研磨小鼠脾脏，使得分散的单细胞透过尼龙网进入淋巴细胞分离液中。

（没研磨每一只脾脏话费的时间最好控制在5分钟之内，防止在研磨过程中液体挥发，使得密度与渗透压改变，影响分离效果）4、把悬有脾脏细胞的分离液立即转移到离心管中，离心前再覆盖上大约200μL的1640培养基。

5、800g离心30分钟，注意离心设置较慢的加速度和减速度（如果有十档，一般设置在第三档）。

离心结束后淋巴细胞会漂浮上来，在1640覆盖层下面聚集，细胞分层如图二所示6、析出淋巴细胞层，再加入10mL1640培养基，250g离心10分钟。

倾倒上清液，加入3-5mL Lympho-SpotTM无血清培养基重悬，细胞计数。

五、注意事项：①离心前在细胞悬液上面加盖一层1640培养基，既有利于漂浮上来的淋巴细胞的聚集，又有利于下一步的吸取操作。

覆盖层不必太厚，2Μl足矣。

②如果实验者一次实验要处理很多只小鼠，需要注意两点：其一，每研磨一只小鼠，立即把脾细胞悬液从培养皿转入离心管中，注意盖严管盖，切不可敞口放在超净台中。

否则，液体挥发，密度与渗透压都会改变，严重影响分离效果。

其二，在所有的小鼠脾脏处理完后，统一再加1640覆盖层。

小鼠淋巴细胞的分离培养
一、血液中淋巴细胞的分离：
1在1.5ML离心管中加入淋巴细胞分离液0.7ML；
2眼部采集小鼠的抗凝血，抗凝剂20%.。

3轻轻将血液加入淋巴细胞分离液的表面，立即以2000—2500转/分离心10MIN。

4小心吸取上层细胞，转移至另一1.5ML离心管中,再用HANK’S 悬浮至1.5ML，再离心，去上清，再悬浮，等待分型用。

二、鼠脾脏中淋巴细胞的分离：
1无菌采集鼠的脾脏，且灭菌注射器的弯针头轻轻扎取，尽可能使单个细胞分离，再分别用4层灭菌纱布过滤2次。

2将滤液小心加入淋巴细胞分离液中。

离心。

3 吸取上层淋巴细胞，HANK‘S液洗涤2次（尽可能去除淋巴
细胞分离液）。

4加入1640培养液进行培养。

、
*淋巴细胞分离液不低于全部液体的50%。

小鼠外周血单个核细胞分离、纯化①徐太哲1，李丽2，王长山2（1．佳木斯市红十字医院，黑龙江佳木斯154003；2．佳木斯大学，黑龙江佳木斯154007）摘要：目的：探讨小鼠外周血单个核细胞（PBMC）最佳分离条件，提高细胞获得率与纯度，以便后续分子生物学实验。

方法：小鼠摘除眼球取血，设置离心力、离心时间、实验环境温度等梯度优化，分别采用EDTA－K2、肝素、枸橼酸钠抗凝，Ficoll 密度梯度离心法分离单个核细胞，直接进行贴壁培养和分析获得率、纯度，计数存活率。

结果：Ficoll密度梯度离心法经条件优化后分离的PBMC纯度可达85%，细胞获得率最高可达80%以上，活细胞百分率在92%以上。

结论：Ficoll密度梯度离心法在优化条件下可有效地分离PBMC，对后续分子生物学实验无影响。

关键词：小鼠；Ficoll密度梯度离心；PBMC中图分类号：Ｒ446．11+3文献标识码：A文章编号：1008－0104（2016）04－0010－02外周血单个核细胞（Peripheral blood mononucle-ar cells，PBMCs）包括淋巴细胞和单核细胞。

是免疫系统的重要组成，是研究免疫老化和衰老的主要依据。

研究T、B淋巴细胞首要分离外周血单个核细胞，主要的分离方法是Ficoll－hypaque密度梯度离心法，因血液中各组成成分的沉降系数存在差异，而得以分离［1］。

离心后，单个核细胞因与分离液密度相当，集中在血浆层和分层液的界面上，呈白雾层，吸取该层细胞经洗涤离心即获得PBMC。

PBMC分离是分子生物学试验常用的技术，其效果直接影响PCＲ等后续试验结果。

实验对象小鼠因体重小，体内血液量少，Ficoll密度梯度离心法正适用这样少量血液的分离，本文探讨小鼠外周血单个核细胞的分离最佳条件。

1材料和方法1．1材料与分组BALB/c小鼠18只，5 6月龄，体重23 25g，雌雄不限；小鼠外周血单核细胞分离液试剂（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）。

一、实验目的本次实验旨在通过体外培养和刺激外周血淋巴细胞，观察并分析淋巴细胞在特定刺激条件下的转化情况，从而了解细胞免疫的功能和状态。

二、实验材料1. 实验试剂：- 外周血采集管- RPMI-1640培养基- 胎牛血清- 植物血凝素（PHA）- 青霉素-链霉素溶液- 0.25%胰蛋白酶- 台盼蓝染液- 计数板- 显微镜2. 实验仪器：- 酶标仪- 培养箱- 水浴箱- 移液器- 微量离心机三、实验方法1. 外周血采集：采集受试者外周血，将采集管置于室温下静置2小时，使红细胞自然沉降。

2. 淋巴细胞分离：将上层血浆转移至新的离心管中，加入0.25%胰蛋白酶，37℃水浴消化10分钟，然后加入胎牛血清终止消化。

3. 淋巴细胞洗涤：将消化后的细胞悬液离心洗涤，去除未结合的细胞碎片和红细胞。

4. 淋巴细胞培养：将洗涤后的淋巴细胞悬液转移至培养瓶中，加入适量的RPMI-1640培养基和PHA，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养48小时。

5. 淋巴细胞计数：培养结束后，用台盼蓝染液对淋巴细胞进行染色，计数活细胞数量。

6. 淋巴细胞转化率计算：计算转化细胞的数量与总细胞数量的比值，即为淋巴细胞转化率。

四、实验结果1. 淋巴细胞数量：实验组淋巴细胞数量显著高于对照组（P<0.05），说明PHA刺激可以促进淋巴细胞增殖。

2. 淋巴细胞转化率：实验组淋巴细胞转化率显著高于对照组（P<0.05），说明PHA刺激可以促进淋巴细胞转化。

五、实验分析1. 淋巴细胞转化实验结果显示，PHA刺激可以显著促进淋巴细胞增殖和转化，这与淋巴细胞在免疫反应中的作用相符。

2. 实验结果表明，淋巴细胞转化率可以作为评价机体细胞免疫功能的一个重要指标。

六、实验结论本次实验通过体外培养和刺激外周血淋巴细胞，成功观察到了淋巴细胞在特定刺激条件下的转化情况，为研究细胞免疫功能提供了实验依据。

七、实验注意事项1. 实验过程中，需严格按照操作规程进行，确保实验结果的准确性。

第1篇一、实验目的1. 了解小鼠血细胞的基本组成和功能。

2. 掌握血细胞计数和分类的方法。

3. 分析小鼠血细胞在不同生理和病理状态下的变化。

二、实验原理血细胞是血液的重要组成部分，包括红细胞、白细胞和血小板。

红细胞主要负责运输氧气和二氧化碳，白细胞具有免疫和防御功能，血小板则参与止血和凝血。

通过血细胞计数和分类，可以了解小鼠的生理和病理状态。

三、实验材料1. 小鼠：体重20-30g，雌雄不限。

2. 采血管：EDTA抗凝管。

3. 显微镜：高倍显微镜。

4. 血细胞计数板：10×10计数室。

5. 细胞染色液：姬姆萨染色液。

6. 胶头滴管、吸管、盖玻片等。

四、实验方法1. 采血：将小鼠放入麻醉箱中，待小鼠麻醉后，剪断小鼠尾部，用采血管采集血液约0.2ml。

2. 制备血涂片：将血液滴在玻片上，用另一玻片将血液涂抹均匀，制成血涂片。

3. 染色：将制备好的血涂片放入染色液中，染色约5分钟。

4. 计数：将染色后的血涂片放在显微镜下，观察红细胞、白细胞和血小板。

5. 计算血细胞计数和分类：（1）红细胞计数：在显微镜下，选择红细胞分布均匀的区域，计算10×10计数室内的红细胞数量，再根据稀释倍数计算出每微升血液中的红细胞数量。

（2）白细胞计数：在显微镜下，选择白细胞分布均匀的区域，计算10×10计数室内的白细胞数量，再根据稀释倍数计算出每微升血液中的白细胞数量。

（3）血小板计数：在显微镜下，观察血涂片上的血小板分布情况，估算每微升血液中的血小板数量。

（4）白细胞分类：根据白细胞形态和大小，将白细胞分为淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞等。

五、实验结果1. 红细胞计数：每微升血液中红细胞数量为6.5×10^12个。

2. 白细胞计数：每微升血液中白细胞数量为1.5×10^9个。

3. 白细胞分类：淋巴细胞占40%，单核细胞占30%，嗜酸性粒细胞占15%，嗜碱性粒细胞占5%，粒细胞占10%。

小鼠淋巴细胞分离方法一、实验用品的准备：1.采血用品：10ml注射器10个；手套20付；15ml离心管10个；20µl枪头、200µl枪头、1000µl枪头。

摄子、剪刀各2把；加样器；70%酒精；5%碘酒；2.取脾用品：10ml注射器10个；手术器械10套；手套20付，60mm玻璃培养皿10个；200 目尼龙网，裁成100mm×100mm正方形10块；10mL 玻璃注射器内活塞10个；5mL刻度吸管、15mL离心管、1640培养基；鼠淋巴细胞分离液；摄子、剪刀各10把；70%酒精；5%碘酒；移液器、离心机；刀剪浸泡液（新洁尔灭）；注：红色必须灭菌；蓝色可以不灭菌；绿色需特殊处理；黑色不用灭菌。

二、相关实验：（一）实验名称：分离小鼠脾脏淋巴细胞实验目的：获得小鼠脾脏淋巴细胞，为ELISPOT实验做准备。

实验动物：BABALB/c小鼠；雌性实验材料：1．小鼠淋巴细胞分离液,2．60mm玻璃培养皿3．10mL 玻璃注射器内活塞，灭菌4．气管切开包5．5mL刻度吸管、15mL离心管、移液器、离心机6．1640培养基实验方法1. 断颈处死小鼠，浸入75%的乙醇中浸泡1-2分钟。

2. 在超净台中小心剪开小鼠的腹部外皮，用大头针固定，再剪开小鼠的腹腔，用镊子取出小鼠脾脏。

注意无菌操作。

3. 在培养皿中放入3mL1640基础培养基，将小鼠脾脏放入培养皿中，用1ml注射器吸取小鼠淋巴细胞分离液，注入小鼠脾脏，直至完全分离。

4. 把悬有脾脏细胞的1640培养基缓慢转移到装有6 mL淋巴细胞分离液的15 mL离心管中。

5. 3000转离心15分钟。

（病毒室离心机）6.吸出淋巴细胞层，加入5mL 1640培养基洗涤一次，1500转离心10 分钟。

7.倾倒上清液，加入3-5mL5ml5%FCS1640培养基重悬，细胞计数。

8.对获得的小鼠脾脏淋巴细胞进行ELSPOT 检测。

实验试剂用量：1．小鼠淋巴细胞分离液：60 mL 2．1640基础培养基：80 mL 3．5%FCS1640培养基：50Ml。

一、实验目的1. 了解小鼠血细胞的组成和形态。

2. 掌握显微镜的使用方法。

3. 学会观察和描述血细胞的特征。

二、实验原理血液是人体和动物体内循环系统的重要组成部分，主要由血细胞和血浆组成。

血细胞包括红细胞、白细胞和血小板。

红细胞主要负责运输氧气和二氧化碳；白细胞具有防御和保护作用；血小板具有凝血和止血功能。

通过观察小鼠血细胞，可以了解其生理功能和形态结构。

三、实验材料1. 小鼠2. 显微镜3. 血细胞计数板4. 生理盐水5. 吸管6. 滴管7. 玻片8. 物镜和目镜四、实验步骤1. 准备工作（1）将小鼠置于实验台上，固定好。

（2）用酒精棉球擦拭小鼠的耳朵，消毒。

（3）用滴管吸取生理盐水，滴于小鼠耳朵上。

（4）用吸管吸取小鼠耳朵上的血液，滴于玻片上。

（5）用盖玻片覆盖血液，轻轻压平。

2. 显微镜观察（1）将玻片置于显微镜载物台上。

（2）调整物镜和目镜，使视野清晰。

（3）观察血细胞，记录其形态、数量和分布情况。

3. 数据处理（1）计算红细胞、白细胞和血小板的数量。

（2）分析血细胞的特征和生理功能。

五、实验结果1. 红细胞（1）数量：每高倍视野下红细胞数量约为500个。

（2）形态：红细胞呈双凹圆盘状，大小均匀，边缘较薄。

2. 白细胞（1）数量：每高倍视野下白细胞数量约为50个。

（2）形态：白细胞呈圆形或椭圆形，大小不一，细胞核明显。

3. 血小板（1）数量：每高倍视野下血小板数量约为200个。

（2）形态：血小板呈不规则形状，大小不一。

六、实验分析1. 通过本次实验，我们了解了小鼠血细胞的组成和形态，掌握了显微镜的使用方法。

2. 实验结果表明，小鼠血液中红细胞数量较多，主要功能是运输氧气和二氧化碳；白细胞数量适中，具有防御和保护作用；血小板数量较少，具有凝血和止血功能。

3. 在实验过程中，我们发现显微镜的调整和操作对观察结果有很大影响。

因此，在今后的实验中，我们要更加熟练地掌握显微镜的使用方法。

七、实验总结1. 通过本次实验，我们学会了观察和描述血细胞的特征，了解了小鼠血细胞的组成和生理功能。

实验三小鼠淋巴结分离及淋巴细胞的获取一、实验目的1、了解小鼠淋巴结的分布特点2、熟练掌握小鼠淋巴细胞分离技术和显微观察技术二、实验原理淋巴结是外周免疫器官，位于淋巴管汇集部位，是淋巴细胞定居和特异性免疫应答发生的场所。

淋巴结遍布全身，其中以颈部、腋下、腹股沟，肠系膜淋巴结最容易分离，是获取淋巴细胞的主要组织之一。

小鼠颈部和腋下淋巴结分布如图3所示。

淋巴结内，T 细胞占淋巴细胞总数的75％，B 细胞占25％。

三、实验仪器和试剂1、仪器设备显微镜、玻片、解剖台、大头针、摄子、剪刀、玻璃平皿、微量移液器、注射器、离心管、筛网等2、试剂和材料（1）实验小鼠（2）生理盐水（3）75%酒精四、实验步骤1、杀鼠：将小鼠颈椎脱臼法处死，75%酒精喷表面，用大头针将鼠四肢固定在解剖台上。

2、分离淋巴结：用剪刀剪开小鼠皮肤，钝性剥开皮肤，仔细寻找小鼠取颈部和腋下淋巴结，并用镊子取下淋巴结，将淋巴结置于盛有3mL 生理盐水的玻璃平皿中。

3、淋巴结淋巴细胞的分离：（1）淋巴结处理：将淋巴结转移到筛网上，筛网置于原玻璃平皿中，用5mL 注射器内芯轻轻研磨淋巴结，不断从平皿中吸取生理盐水冲洗筛网。

（2）移开筛网，将平皿内的细胞收集于2 个1.5mL 离心管中。

（3）3000rpm 室温离心3min，弃上清。

（4）加入20～100μL 生理盐水，重悬沉淀。

4、显微观察：取出10μL 细胞悬液滴在干净干燥的玻片上，盖上盖玻片，在显微镜下观察分离到的淋巴细胞。

五、注意事项1、要按正确的方法抓小鼠和处死小鼠，避免被小鼠伤害。

2、注意区分淋巴组织和其他组织，取到的淋巴结要足够，至少三个。

3、用注射器内芯研磨淋巴结时，力度一定要准确，避免破坏淋巴细胞。

4、冲洗筛网要干净，避免淋巴浓度过低。

5、装玻片时要记得盖上盖玻片，观察时从低倍镜到高倍镜。

六、结果分析试验结果如图所示图中气泡状的小圆点就是淋巴细胞。

淋巴细胞布满这个视野，呈均匀分布，且没有其他的杂质细胞，说明试验过程很成功。

淋巴细胞分离计数实验报告一、实验目的本实验旨在通过淋巴细胞分离计数实验，了解淋巴细胞的分离过程和计数方法，并掌握相关技能。

二、实验原理1. 淋巴细胞的分离：通过梯度离心法将淋巴细胞与其他血液成分进行分离。

2. 细胞计数：使用显微镜和特殊计数板对淋巴细胞进行计数。

三、实验材料和设备1. 血液样品2. Ficoll-Paque液（用于梯度离心）3. 生理盐水4. 无菌注射器、针头5. 显微镜、计数板四、实验步骤1. 取适量血液样品加入无菌注射器中。

2. 将Ficoll-Paque液加入另一无菌注射器中。

3. 在针头上滴上生理盐水，避免空气进入。

4. 缓慢注入Ficoll-Paque液至血液样品上方。

注意不要将两种液体混合。

5. 离心20分钟，速度为400g。

此时，白色细胞会沉积到Ficoll-Paque层，红细胞会沉积到底部。

6. 用无菌注射器吸取上层白色细胞，转移到新的离心管中。

7. 加入适量生理盐水，混合均匀。

8. 离心10分钟，速度为200g。

此时，淋巴细胞会沉积到底部。

9. 弃去上层液体，用生理盐水洗涤淋巴细胞。

10. 在计数板上吸取适量淋巴细胞进行计数。

五、实验结果分析1. 淋巴细胞的分离效果：根据显微镜下观察到的细胞形态和数量来判断分离效果是否良好。

2. 细胞计数：根据计数板上的规则进行计数，并结合显微镜下观察到的图像来确定结果。

六、实验注意事项1. 操作过程要严格无菌，避免污染样品。

2. 离心过程中要注意速度和时间，以避免对样品产生影响。

3. 计数板要保持干燥和清洁。

七、实验结论通过本次淋巴细胞分离计数实验，我们成功地将淋巴细胞与其他血液成分进行了分离，并通过计数板对淋巴细胞进行了计数。

这些实验结果为我们进一步了解淋巴细胞的生物学特性和相关疾病提供了基础数据。

小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告一、实验目的1. 了解淋巴细胞分离的意义和原理2. 掌握淋巴细胞分离的技术，为进行下一步生物实验奠定基础二、实验材料1.淋巴细胞分离液2.EDTA抗凝剂常用EDTA的钠盐或钾盐作为抗凝剂，能与血液中的钙离子结合成螯合物，而是钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固3.PBS缓冲液PBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用4.戊巴比妥钠溶液作用与苯巴比妥相同，为中时作用的巴比妥类催眠药，作用时间可维持3～6小时，显效较快。

用作催眠和麻醉前给药，亦可用于治疗癫痫和破伤风的痉挛。

5.其他实验材料：健康的小白鼠一只、注射器（1ml，10ml）1ml、20ul的枪以及相应的枪头、滴管、水平离心机、医用镊子、EP管（5ml，10ml）三、实验原理外周血中各种细胞的密度不同。

密度离心法的原理主要根据各类血细胞的比重差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立区带，从而达到分离的目的。

第一层为血浆层。

第二层为环状乳白色淋巴细胞层。

第三层为透明分离液层。

第四层为红细胞层图1 小鼠外周血离心前后示意图四、实验步骤1.给小鼠注射适量的戊巴比妥钠麻醉剂，使其麻醉2.用镊子用力拉扯掉麻醉完全小鼠的其中一只眼睛，将血液滴入事先已经加入100ulEDTA抗凝剂的5mlEP管中，取足1ml新鲜血液3.用滴管将抗凝后的血加入事先加入1mlPBS缓冲液的5ml的EP管中稀释(血液与PBS的比率为1:1)4.用滴管将稀释后的1ml新鲜血液沿试管壁缓缓（一定要慢）加到含有2ml淋巴细胞分离液(事先要恢复到室温)的10mlEP管中（稀释血液：分离液=1:1），沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面5.经水平式离心机离心（1500r/min）15分钟，小心取出试管6.用平口滴管小心吸取中层呈白絮状的淋巴细胞，用PBS溶液洗涤两次，每次离心1800r/min，离心10min7.弃上清液，加入4mlPBS待用图2 第一次离心后图片五、注意事项1.EDTA和淋巴细胞分离液使用前应预温至22℃2.在淋巴细胞分离过程中，应控制室温在22~25℃，过低或过高应延长或缩短离心时间六、实验思考第一次分离后淋巴细胞层存在红细胞，应该是抗凝剂储存时间久导致血液抗凝补充分的缘故。