小鼠外周血淋巴细胞分离实验报告
一、实验目的
1. 了解淋巴细胞分离的意义和原理
2. 掌握淋巴细胞分离的技术，为进行下一步生物实验奠定基础
二、实验材料
1.淋巴细胞分离液
2.EDTA抗凝剂
常用EDTA的钠盐或钾盐作为抗凝剂，能与血液中的钙离子结合成螯合物，而是钙离子失去凝血作用，从而阻止血液凝固
3.PBS缓冲液
PBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用
4.戊巴比妥钠溶液
作用与苯巴比妥相同，为中时作用的巴比妥类催眠药，作用时间可维持3～6小时，显效较快。用作催眠和麻醉前给药，亦可用于治疗癫痫和破伤风的痉挛。
5.其他实验材料：健康的小白鼠一只、注射器（1ml，10ml）1ml、20ul的枪以及相应的枪头、滴管、水平离心机、医用镊子、EP管（5ml，10ml）
三、实验原理
外周血中各种细胞的密度不同。密度离心法的原理主要根据各类血细胞的比重差异，利用比重介于某两类细胞之间的细胞分离液对血液离心，使一定比重的血细胞依相应的密度梯度分布于不同的独立区带，从而达到分离的目的。
第一层为血浆层。第二层为环状乳白色淋巴细胞层。第三层为透明分离液层。第四层为红细胞层
图1 小鼠外周血离心前后示意图
四、实验步骤
1.给小鼠注射适量的戊巴比妥钠麻醉剂，使其麻醉
2.用镊子用力拉扯掉麻醉完全小鼠的其中一只眼睛，将血液滴入事先已经加入100ulEDTA抗凝剂的5mlEP管中，取足1ml新鲜血液
3.用滴管将抗凝后的血加入事先加入1mlPBS缓冲液的5ml的EP管中稀释(血液与PBS的比率为1:1)
4.用滴管将稀释后的1ml新鲜血液沿试管壁缓缓（一定要慢）加到含有2ml淋巴细胞分离液(事先要恢复到室温)的10mlEP管中（稀释血液：分离液=1:1），沿管壁流下的稀释血液叠加在分离液之上，并与分离液形成明显的界面
5.经水平式离心机离心（1500r/min）15分钟，小心取出试管
6.用平口滴管小心吸取中层呈白絮状的淋巴细胞，用PBS溶液洗涤两次，每次离心1800r/min，离心10min
7.弃上清液，加入4mlPBS待用
图2 第一次离心后图片
五、注意事项
1.EDTA和淋巴细胞分离液使用前应预温至22℃
2.在淋巴细胞分离过程中，应控制室温在22~25℃，过低或过高应延长或缩短离心时间
六、实验思考
第一次分离后淋巴细胞层存在红细胞，应该是抗凝剂储存时间久导致血液抗
凝补充分的缘故。
