生态毒理基因组学和生态毒理蛋白质组学研究进展_戴家银

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第18卷第1期2023年2月V ol.18,No.1Feb.2023㊀㊀基金项目:国家自然科学基金面上项目(22076179,21677142);福建省自然科学基金资助项目(2022J06033);厦门市青年创新基金资助项目(3502Z20206091)㊀㊀第一作者:李富萍(1997 ),女,硕士研究生,研究方向为环境毒理学,E -mail:***********.cn ㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:**************.cnDOI:10.7524/AJE.1673-5897.20220914003李富萍,黄清育.环境污染物诱导神经毒性的表观遗传机制研究进展[J].生态毒理学报,2023,18(1):1-15Li F P,Huang Q Y.Research progress on epigenetic mechanism of neurotoxicity induced by environmental pollutants [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(1):1-15(in Chinese)环境污染物诱导神经毒性的表观遗传机制研究进展李富萍1,2,3,黄清育1,*1.中国科学院城市环境研究所,中国科学院城市环境与健康重点实验室,厦门3610212.中国科学院大学,北京1000493.福建农林大学生命科学学院,福州350028收稿日期:2022-09-14㊀㊀录用日期:2022-11-09摘要:表观遗传修饰与神经系统功能密切相关,其在环境污染物暴露致神经毒性中的作用机制已引起广泛关注㊂本文综述了重金属㊁有机污染物和空气颗粒物等典型环境污染物对人体和模式生物表观遗传修饰(DNA 甲基化㊁组蛋白修饰和ncRNA 等)和神经系统功能的影响,指出环境污染物可直接或(通过引起氧化胁迫)间接改变表观遗传修饰状态,导致相关基因表达失调,从而诱导一系列神经毒性,并提出当前研究存在的局限性㊂建议未来针对污染物的神经毒性机制研究,应着重关注组蛋白修饰和ncRNA 以及不同类型表观遗传修饰之间的交互作用;同时,环境污染物复合暴露导致神经毒性的表观遗传机制有待深入研究;如何从表观遗传角度解释环境污染物诱导神经毒性的年龄易感性及性别特异性也值得进一步探讨㊂关键词:环境污染物;表观遗传修饰;神经毒性;毒理机制文章编号:1673-5897(2023)1-001-15㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:AResearch Progress on Epigenetic Mechanism of Neurotoxicity Induced by Environmental PollutantsLi Fuping 1,2,3,Huang Qingyu 1,*1.Key Laboratory of Urban Environment and Health,Institute of Urban Environment,Chinese Academy of Sciences,Xiamen 361021,China2.University of Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China3.College of Life Sciences,Fujian Agriculture and Forestry University,Fuzhou 350028,ChinaReceived 14September 2022㊀㊀accepted 9November 2022Abstract :Studies have shown that environmental pollutants can enter the human body directly through drinking water,breathing,dermal contact or indirectly through the food chain,and can pose adverse effects on the central nervous system.Epigenetic modifications are closely related to the function of the nervous system,and their role in the neurotoxicity induced by environmental pollutant exposure has attracted much attention.This paper reviews the effects of typical environmental pollutants,such as heavy metals,organic pollutants and air particulate matters,on epigenetic modifications (DNA methylation,histone modifications,and ncRNAs)and neurological functions in hu -2㊀生态毒理学报第18卷mans and model organisms,and suggests that environmental pollutants can directly or indirectly (by causing oxida -tive stress)alter the status of epigenetic modifications,leading to dysregulation of relevant gene expression and thus inducing a series of neurotoxicity,such as neuronal apoptosis,learning and memory deficits and neurodegenerative diseases.The limitations of the current studies are also presented.It is suggested that future research on the neuro -toxicity mechanisms of pollutants should pay more attention to histone modifications and ncRNAs,as well as the corsstalk between different epigenetic modifications.In addition,the epigenetic mechanisms involved in the neuro -toxicity induced by combined exposure of various pollutants and the age susceptibility and sex specificity of neuro -toxicity also deserve further investigation.Keywords :environmental pollutants;epigenetic modifications;neurotoxicity;toxicological mechanisms ㊀㊀包括神经系统疾病在内的许多疾病都与环境因素密切相关㊂大量研究证实,暴露于环境污染物会导致神经炎症㊁氧化应激㊁线粒体功能障碍和神经元凋亡等,从而诱发一系列神经毒性和疾病㊂例如,大鼠长期暴露于铅(Pb)后,其海马中白细胞介素(IL)-1β和肿瘤坏死因子-α水平上升,同时慢性胶质细胞活化并伴有炎症和神经退行性特征[1]㊂斑马鱼在双酚A(BPA)处理后,焦虑和恐惧反应异常,而这些行为改变可能源于其中枢神经系统中参与抗氧化防御机制的基因表达失调[2]㊂此外,低剂量甲基汞可通过改变线粒体功能和引起mtDNA 的氧化损伤诱导人类神经祖细胞凋亡[3];而大鼠肾上腺髓质嗜铬瘤分化细胞(PC12)在经过Mn 3O 4纳米颗粒暴露后,细胞活力降低,并通过引发氧化应激诱导细胞发生凋亡[4]㊂一般认为,大多数环境污染物主要改变生物体的表观基因组而非直接改变其DNA 序列㊂表观遗传学是研究在不改变DNA 序列情况下的基因表达的可遗传变化,其研究对象是表观基因组㊂表观基因组相对于基因组而言,不仅序列包含遗传信息,同时它们的修饰也记载遗传信息㊂表观基因组记录生物体DNA 和组蛋白的一些改变或修饰,同时这些变化或修饰可以从亲本传给子代㊂表观遗传修饰包含DNA 甲基化(DNA methylation)㊁组蛋白修饰(his -tone modification)和非编码RNA (non -coding RNA,ncRNA)等,它们可以在外界环境的影响下改变基因组功能㊂DNA 甲基化是DNA 化学修饰的一种形式,指在DNA 甲基化转移酶(如Dnmt1㊁Dnmt2㊁Dnmt3a 和Dnmt3b 等)的作用下,将一个甲基加到胞嘧啶上,并转化为5-甲基胞嘧啶的一种修饰[5]㊂这一过程通常是发生在CpG 岛上,对生物的基因表达调控具有重要意义㊂DNA 甲基化参与调控许多细胞过程,包含染色质结构㊁染色质重塑㊁X 染色体失活㊁基因组印记㊁染色体稳定性以及基因转录等等㊂一般情况下,基因启动子的高甲基化通常被认为可导致该基因的表达水平降低㊂相反,基因启动子的低甲基化则可激活基因表达㊂组蛋白修饰主要是指发生在核心组蛋白N 端氨基酸残基上的甲基化㊁乙酰化㊁磷酸化和泛素化等共价修饰[6]㊂组蛋白修饰可以通过影响相邻核小体中不同组蛋白的接触或组蛋白与DNA 的相互作用影响高阶染色质结构,使之变得松散或紧密,从而影响基因的转录水平[7]㊂其中,组蛋白高乙酰化能够使染色质结构变松散,与转录激活有关㊂组蛋白乙酰化酶和组蛋白去乙酰化酶的作用维持了组蛋白乙酰化的动态平衡㊂但当外界环境发生改变时,这种稳态便会被破坏,从而使基因表达水平发生变化㊂组蛋白甲基化则是另一种重要的组蛋白修饰,在基因表达中同时具有激活和抑制的作用㊂组蛋白中不同位点赖氨酸残基上发生的甲基化具有不同的生物学功能㊂比如,组蛋白H3K9的甲基化通常导致基因沉默,而H3K4甲基化则与基因表达激活有关[8]㊂非编码RNA 也在基因表达调控中发挥重要作用㊂根据非编码RNA 的大小可以分为长链非编码RNA(lncRNA)和短链非编码RNA(sncRNA),常见的短链非编码RNA 包括小干扰RNA (siRNA)㊁微小RNA(miRNA)等[9]㊂其中miRNA 可通过导致靶标mRNA 的降解或翻译沉默调控基因表达,因而一般可使基因表达沉默㊂大多数人类中枢神经系统疾病都与表观基因组的扰动有关[10]㊂表观遗传修饰最典型的作用主要表现在神经细胞命运决定㊁突触㊁神经网络连接和可塑性以及跨代遗传等㊂例如,有研究表明,缺乏Dnmt1和Dnmt3a 的小鼠DNA 甲基化水平降低,海马CA1区域的可塑性发生改变,导致学习记忆功能受损[11]㊂第1期李富萍等:环境污染物诱导神经毒性的表观遗传机制研究进展3㊀死亡域相关蛋白是一组组蛋白伴侣,它通过促进H3.3加载和转录结合到神经元基因相关的染色质中响应神经元去极化,从而导致基因转录激活[12]㊂miRNAs㊁Piwi互作RNA(piRNAs)和lncRNA都参与调节突触的形成和功能㊂miR-339-5p靶向调节BACE1,导致BACE1在阿尔茨海默症(AD)患者脑中的表达水平降低[13]㊂此外,许多研究已经聚焦于不同的表观遗传因子如何协调神经干细胞的自我更新和维持㊁谱系限制及神经元和胶质成熟等方面[14]㊂目前关于环境污染物诱导神经毒性的机制研究也逐渐深入㊂随着表观遗传学研究技术的不断发展,表观遗传修饰在环境污染物暴露导致神经毒性中的作用机制研究日益受到重视[15-16]㊂本文主要综述了典型环境污染物(金属㊁有机污染物和空气颗粒物等)暴露诱导神经系统毒性的表观遗传学机制(DNA甲基化㊁组蛋白修饰和非编码RNA)相关研究㊂1㊀环境污染物暴露诱导神经毒性的表观遗传机制(Epigenetic mechanism of neurotoxicity induced by environmental pollutants exposure)1.1㊀重金属1.1.1㊀铝(Al)有研究探讨了Al电解工人认知功能与DNA 甲基化的关系㊂结果表明,简易精神状态检查得分和全基因组DNA甲基化水平随血清Al浓度的升高而降低,轻度认知障碍(MCI)发病风险增加,并且MCI与DNA甲基化显著负相关[17]㊂另一项研究表明,淀粉样前体蛋白(APP)基因启动子DNA甲基化水平的降低可能与工人血清Al水平的升高有关[18]㊂此外,在动物模型中也有相同的发现,雄性大鼠暴露于AlCl3后,海马组织中APP启动子DNA甲基化水平降低,APP㊁Aβ含量升高[19],从而增加AD患病风险㊂小鼠在AlCl3暴露后,海马中MBDs㊁DnMTs 和MeCPb表达水平降低导致APP基因的低甲基化和Aβ沉积[20],成为AD发展的潜在风险因素㊂报道显示,大鼠暴露于麦芽酸铝后,脑组织的全基因组DNA甲基化水平降低,并导致学习记忆功能障碍[21]㊂组蛋白修饰也与Al诱导的神经毒性密切相关㊂有研究表明,职业Al暴露可通过提高组蛋白H3的甲基化修饰(尤其H3K27me3和H3K9me2)水平,抑制学习记忆相关蛋白BDNF和EGR1的表达,从而影响学习记忆功能[22]㊂此外,Al暴露可上调组蛋白去乙酰化酶6(HDAC6)的表达,下调BDNF启动子的H3K9和H4K12乙酰化,最终抑制BDNF表达,导致大鼠空间学习记忆能力减弱[23]㊂低强度脉冲超声(LIPUS)则可通过恢复组蛋白乙酰化和BDNF表达,使受损的认知功能得到改善[23]㊂1.1.2㊀砷(As)As暴露和表观遗传修饰之间的一个可能联系在于其生物转化,即通过共用染色质重塑所需的甲基供体S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosyl methionine, SAM)对DNA甲基化产生影响[24]㊂随着大鼠脑皮质和海马组织中总As浓度增加,DNA甲基转移酶(DNMTs)和去甲基化酶(TETs)表达下调,导致脑组织中DNA甲基化/去甲基化过程显著受到抑制,且这种变化呈剂量依赖性[25]㊂同时,As可以破坏氧化/抗氧化平衡,并通过TCA循环和α-酮戊二酸(α-KG)途径进一步抑制TETs的表达,从而导致DNA 甲基化/去甲基化破坏,诱导大鼠学习记忆功能损伤[25]㊂发育阶段暴露于低水平As可导致组蛋白H3K9ac和H3K4me3在成年雌性小鼠中水平下降,但在雄性小鼠中上升,最终导致小鼠齿状回海马神经发生障碍,并出现抑郁样症状[26]㊂母鼠在妊娠期持续As暴露后,子代小鼠的空间㊁情景记忆功能受到损害,这可能是由于小鼠皮质和海马组织H3K9的低乙酰化[27]㊂流行病学调查和实验研究表明,miRNA在As 暴露中也发挥着重要作用,同时可能对认知功能产生影响㊂As可通过上调miR-219,靶向降低CaMK Ⅱ水平,诱导学习和记忆障碍[28]㊂同时NMDA受体亚基2(NR2)和记忆相关蛋白c-Fos和c-Jun可通过抑制miR-219而上调,从而改善As诱导的海马结构损害和学习记忆损伤[28]㊂1.1.3㊀锰(Mn)有研究测定了201名电焊工人血液中的NOS2外显子1的DNA甲基化水平,发现该位点的低甲基化促进了该基因的表达,从而诱导神经炎症的发生,增加帕金森病(PD)的发病风险[29]㊂人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)经慢性Mn暴露后,Parkin和PINK1这2个基因均发生高甲基化,基因活性降低,也可能加剧PD发病风险[30]㊂酪氨酸羟化酶(TH)在多巴胺的生物合成中起着至关重要的作用㊂Mn暴露可导致TH的DNA甲基化水平升高,基因表达水平下降,从而抑制多巴胺生物合成[30]㊂此外,SH-4㊀生态毒理学报第18卷SY5Y细胞在慢性Mn暴露后,通过诱导高甲基化下调了PINK1-PARK2表达,表明Mn可能通过表观遗传调控导致神经细胞线粒体功能障碍[30]㊂由于表观遗传修饰变化是可遗传的,小鼠在Mn暴露后,其子代海马中一些参与分化过程的基因如Mid1㊁Nr2f1和Atp1a3等发生高甲基化,致使多巴胺能中间神经元数量减少,海马神经发生持续中断[31]㊂还有研究表明,产前Mn暴露可能通过表观遗传机制影响胎儿神经发育㊂分析胎盘的全基因组甲基化,发现713个CpG位点甲基化与Mn暴露有关,其中5个差异甲基化位点位于神经发育相关基因中[32]㊂PC12和SH-SY5Y细胞暴露于MnCl2后, HDAC3和HDAC4表达水平显著增加,同时HAT 水平下降,导致H3和H4乙酰化水平下调,从而诱导细胞凋亡,而HAT抑制剂处理后则可以缓解Mn 诱导的细胞活力下降以及凋亡[33]㊂1.1.4㊀铅(Pb)研究发现,雌性小鼠在孕前㊁孕中和哺乳期持续Pb暴露后,其子代小鼠海马体中MECP2水平显著下降,DNMT1水平显著增加,同时在皮质中发现DNMT1㊁DNMT3a和MECP2的表达显著增加,此外,子代雌鼠皮质中的糖皮质激素受体基因(Nr3c1)甲基化也发生显著改变,这可能会给小鼠海马和皮质功能以及认知功能造成不利影响[34]㊂有趣的是,围产期Pb暴露与出生后早期Pb暴露对小鼠海马中DNA甲基化相关酶的影响有所不同㊂与对照组相比,Dnmt1只有在出生后早期Pb暴露的雄鼠存在显著差异,Dnmt3a在围产期暴露雄鼠和出生后早期暴露雌鼠都显著降低,雌鼠MeCP2表达水平显著降低,可能会导致多种认知障碍疾病[35]㊂此外,Pb暴露还可能通过DNA高甲基化下调神经分化相关基因表达,从而促进神经退行性过程[36]㊂早期Pb暴露(出生1~21d)会导致DNMT1活性降低,改变参与AD通路的APP和β分泌酶1(bace1)基因的甲基化水平,导致APP的过表达,以及生命后期Aβ水平的增加,增加晚年AD发病风险[37]㊂小鼠早期Pb暴露后,大脑皮层中与基因激活相关的组蛋白H3K9ac和H3K4me2水平下降,而与基因活性抑制相关的H3K27me3蛋白水平上升[38],这可能增加神经退行性疾病的患病风险㊂靶向AD相关蛋白的miRNA也会受到Pb的影响㊂生命早期Pb暴露显著影响海马中6个靶向神经毒性蛋白的miRNA表达㊂其中,miR-106b(靶向APP mRNA)和miR-124(靶向SP1mRNA)减少,这可能会导致晚年神经毒性蛋白的过度表达,增加AD 的发病风险[39]㊂1.1.5㊀汞(Hg)有研究表明,产前Hg暴露水平与PON1基因的低甲基化水平相关,这可能导致了儿童期男孩的认知功能障碍[40]㊂除此之外,Hg暴露后,斑马鱼中长链非编码RNA Malat1可被特异性上调10倍以上,Malat1在斑马鱼胚胎的脑区㊁眼睛和脊索中高度表达,并改变神经发育相关基因表达模式,导致斑马鱼幼体的神经行为障碍[41]㊂由于大脑对甲基汞(MeHg)具有很强的亲和力,它可以通过中性氨基酸转运系统Ⅰ与L-半胱氨酸的复合体穿过血脑屏障并分布到大脑的各个区域[42],使大脑功能受到不同程度的损害㊂越来越多的研究表明,MeHg诱导的神经系统疾病与DNA甲基化有关㊂大鼠胚胎皮质神经干细胞(NSCs)暴露于低剂量MeHg后,整体DNA甲基化水平下降,细胞周期调节因子p16和p21表达上升,导致细胞周期阻滞,并且这些变化在无MeHg暴露的传代细胞中也可观察到[43]㊂胎儿脑源性永生细胞(LUHMES)暴露于MeHg 后,TH基因启动子的组蛋白H3K27me3显著增加, TH水平降低,从而抑制多巴胺的生物合成[44]㊂此外,MeHg显著下调了小鼠海马中BDNF启动子的H3乙酰化并上调H3K27me3,同时DNA甲基化也显著上调,导致BDNF基因表达抑制,小鼠出现抑郁行为[45]㊂人类神经祖细胞ReNcell CX对MeHg高度敏感㊂研究结果显示,低剂量MeHg可通过降低miR-25的水平㊁上调p53以及线粒体发生相关基因的表达,进而可能损害细胞线粒体功能[46]㊂1.1.6㊀其他重金属铜(Cu)暴露与神经系统中DNA甲基化㊁组蛋白修饰之间的联系尚未被发现㊂但有研究发现,Cu暴露可能会导致某些miRNA水平的变化㊂miR-187㊁miR-128㊁miR-138㊁miR-183和miR-7a已经被证明在嗅觉系统中特异性表达,特别是miR-183家族成员在斑马鱼的神经感觉器官中大量表达㊂有研究结果显示,斑马鱼经Cu暴露后,其侧线嗅觉感觉细胞中miR-183表达水平显著下降,嗅觉上皮细胞凋亡增加,感觉神经元丢失,最终可能导致斑马鱼嗅觉障碍[47]㊂第1期李富萍等:环境污染物诱导神经毒性的表观遗传机制研究进展5㊀镍(Ni)处理的原代培养海马神经元中可以观察到细胞树突的复杂性降低,同时组蛋白乙酰化受到了抑制[48]㊂此外,Ni暴露后的小鼠海马组织组蛋白低乙酰化,海马树突复杂性下降,并且学习记忆能力受损[48]㊂神经细胞(Neuro-2a)在Ni暴露下,miR-210过表达并导致ISCU1/2表达水平下调,miR-210抑制剂则可缓解Ni诱导的ISCU1/2下调[49]㊂ISCU1/2负责线粒体呼吸和能量产生[50],其表达下调可能影响细胞的线粒体功能㊂铅和镉联合暴露则通过上调组蛋白去乙酰化酶HDAC2表达,降低大鼠海马组织的组蛋白乙酰化水平,最终降低大鼠海马树突棘密度,损害大鼠的学习记忆能力[51]㊂1.2㊀有机物1.2.1㊀多环芳烃(PAHs)一项流行病学研究发现,产前PAHs暴露与LINE1DNA甲基化负相关,而LINE1甲基化与儿童智商显著正相关,但LINE1并未直接介导PAHs 暴露与智商之间的关联[52]㊂苯并(a)芘(B[a]P)是一种常见的PAHs㊂由于其亲脂性,B[a]P及其代谢产物可以穿过血脑屏障,到达脑组织,引起中枢神经系统损伤[53]㊂斑马鱼暴露于B[a]P后,DNA甲基转移酶表达普遍降低,整体DNA甲基化水平下降,斑马鱼现表出社会焦虑样行为,并且F2代成年斑马鱼也存在此现象[54],这可能与表观遗传修饰的跨代遗传有关㊂此外,B[a]P暴露后,大鼠海马中miRNA水平下降,而DNA甲基化和lncRNA水平显著上调,其中差异甲基化基因涉及通路大部分与学习记忆相关,最终导致大鼠的学习记忆功能障碍[55]㊂而小鼠暴露于B[a]P后,可通过DNA高甲基化下调NR2B[56]㊁BDNF[57]基因的转录水平,致使小鼠出现短期记忆缺陷㊁焦虑样行为及认知和行为障碍㊂在体外实验中也发现,海马神经元细胞HT22经B[a]P暴露后,BDNF基因启动子的DNA甲基化水平上升,基因转录水平下降,从而诱导细胞肿胀及炎症发生[57]㊂1.2.2㊀双酚A(BPA)有研究观察到,产前BPA暴露后,低APGAR (神经发育疾病风险增加的预测因子)与BPA诱导的Grin2b高甲基化有关[58]㊂此外,BPA暴露会导致雌性大鼠后代海马体中的BDNF基因启动子高度甲基化,下调其基因转录水平,从而影响大鼠的空间学习记忆功能[59]㊂另一研究发现,子代大鼠海马组织中的Fkbp5基因高甲基化也与母本BPA暴露有关,并因此对子代大鼠的应激反应产生不良影响[60]㊂围产期的小鼠暴露于BPA后,其子代雄鼠的空间记忆能力受到损伤,同时伴随着大脑皮质和海马的DNA甲基化减少以及组蛋白H3乙酰化增加[61]㊂氯化钾协同转运蛋白2(KCC2)参与维持细胞内氯化物的平衡,负责从成熟神经元中转运出氯化物[62]㊂有研究发现,经BPA暴露后,小鼠大脑皮层神经元中组蛋白乙酰化水平下降,Kcc2基因的表达受到了抑制和延迟,从而导致皮质神经网络受损[63]㊂1.2.3㊀农药Neuro-2a细胞用百草枯处理后,通过ROS上调DNA甲基化,降低与细胞增殖㊁迁移与凋亡相关的miR-17-5p表达水平,进而促进细胞凋亡[64]㊂此外, N27多巴胺能神经元细胞暴露于百草枯后,PKCδ蛋白水解增强,同时细胞中HDAC蛋白水平显著下降㊁组蛋白H3乙酰化增加[65]㊂PKCδ蛋白水解活化是细胞死亡的关键标志之一㊂因此,百草枯可通过提高组蛋白乙酰化水平,增强PKCδ水解活化,从而诱导神经元细胞凋亡[65]㊂研究表明,氯菊酯暴露导致斑马鱼整体游泳活动迟发性降低㊁焦虑,这可能是由于DNA高甲基化诱导的谷氨酸活性相关基因(如fmr1㊁pnocb等)的下调所导致,并且该表观遗传变化所导致的神经行为改变具有跨代遗传效应[66]㊂C57BL/6小鼠发育过程中暴露于狄氏剂,可导致其脑黑质中Nr4a2和Lmx1b等多巴胺能神经元发育相关基因的DNA甲基化水平改变,从而导致多巴胺能神经元进行性退化,增加PD发病风险[67]㊂组蛋白修饰在狄氏剂诱导的神经细胞死亡中发挥重要作用㊂中脑多巴胺能神经元细胞暴露于狄氏剂,可诱导组蛋白H3和H4的高度乙酰化,并导致cAMP反应元件结合蛋白的积累和蛋白激酶PKCδ的水解活化,进而促进细胞凋亡[68]㊂体外实验发现,分化前阿特拉津暴露会诱发SH-SY5Y细胞一系列的表型改变,例如突触数量以及长度发生变化,同时伴随着表观遗传基因组的变化,如DNA甲基化增加,H3K9me3和H3K27me3的减少㊂这些表观遗传修饰变化可能破坏了组成性异染色质的形成,并导致SNCA表达上调,增加PD 风险[69]㊂1.2.4㊀其他有机物多氯联苯暴露后,大鼠小脑和大脑皮层甲基化6㊀生态毒理学报第18卷水平下调,并诱导小脑和大脑皮层发生DNA 损伤[70]㊂SK -N -SH 细胞经全氟辛烷磺酸(PFOS)暴露后,BDNF 基因启动子的DNA 甲基化水平及miR -NA -16㊁miRNA -22和miRNA -30a -5p 均上升,BDNF转录水平下降,最终导致细胞缩小㊁活力下降[71]㊂另外,挥发性有机物(VOCs)复合暴露导致MALAT1lncRNA 显著减少,同时8个基因因DNA 超甲基化而显著下调,其中包含CNTNAP3㊁SULT4A1㊁CLIP2㊁CACNG8㊁WNT7B ㊁GLS2㊁TP73和FMR1等基因,这些基因的下调可能导致突触㊁树突棘的数量和密度降低,以及运动㊁学习记忆能力受损[72]㊂1.3㊀空气颗粒物少量研究表明,表观遗传调控在空气颗粒物暴露诱导的神经毒性中发挥重要作用㊂人体和动物模型研究发现,空气颗粒物暴露引起的脑组织中H3K9me2/3降低可能导致基因组不稳定㊁DNA 损伤及APP 基因的转录上调,从而增加AD 发病风险[73]㊂在另一研究中也发现,空气细颗粒物可通过提高SH -SY5Y 细胞的DNA 甲基化水平,抑制突触相关基因的转录表达,增加自闭症的发病几率[74]㊂焊接烟雾暴露后,大鼠全脑组织的DNA 甲基化水平升高,端粒长度增加,神经退化标志蛋白表达上调,提示表观遗传变化㊁端粒长度与神经退行性改变之间的可能联系[75]㊂2㊀结论与展望(Conclusion and prospect )环境污染物可通过引起各种表观遗传修饰的改变而诱导神经毒性(表1)㊂基于现有的研究结果,我们发现环境污染物可以直接或通过氧化胁迫等其他机制间接引起表观遗传机制改变,进而导致神经系统功能相关基因表达失调,最终诱导神经毒性(图1)㊂然而,目前该领域研究仍存在一定的局限性㊂图1㊀环境污染物诱导神经毒性的表观遗传机制示意图注:AD 表示阿尔茨海默病,PD 表示帕金森病㊂Fig.1㊀Proposed epigenetic mechanism of neurotoxicity induced by environmental pollutantsNote:AD stands for Alzheimer Disease,and PD stands for Parkinson Disease.第1期李富萍等:环境污染物诱导神经毒性的表观遗传机制研究进展7㊀表1㊀环境污染物对表观遗传修饰的影响及其神经毒性效应T a b l e 1㊀E f f e c t s o f e n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t s o n e p i g e n e t i c m o d i f i c a t i o n s a n d t h e i r n e u r o t o x i c e f f e c t s环境污染物E n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t s 研究对象S u b j e c t s表观遗传改变E p i g e n e t i c c h a n g e s 靶基因/蛋白质T a r g e t g e n e s /P r o t e i n s 神经毒性N e u r o t o x i c i t y 参考文献R e f e r e n c e s重金属H e a v y m e t a l s铝A l 人体血清H u m a n s e r u m大鼠海马组织R a t h i p p o c a m p u s小鼠海马组织M o u s e h i p p o c a m p u s大鼠脑组织R a t b r a i n t i s s u e人体血清H u m a n s e r u m大鼠海马组织R a t h i p p o c a m p u sˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o n全基因组G e n o m e -w i d e认知障碍C o g n i t i v e i m p a i r m e n t [17]ˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o nʏA P P 阿尔茨海默病A l z h e i m e r D i s e a s e[18]ˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o nʏA P P阿尔茨海默病A l z h e i m e r D i s e a s e[19]ˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o n全基因组G e n o m e -w i d e记忆和认知缺陷M e m o r y a n d c o g n i t i v e d e f i c i t s[20]ˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o n全基因组G e n o m e -w i d e学习记忆功能损伤I m p a i r m e n t o f l e a r n i n g a n d m e m o r y f u n c t i o n[21]ʏH 3K 27m e 3ʏH 3K 9m e 2ˌB D N F ,ˌE G R 1学习记忆功能损伤I m p a i r m e n t o f l e a r n i n g a n d m e m o r y f u n c t i o n[22]ˌH 3K 9a cˌH 4K 12a cˌB D N F学习记忆功能损伤I m p a i r m e n t o f l e a r n i n g a n d m e m o r y f u n c t i o n[23]砷A s大鼠皮质㊁海马组织R a t c o r t e x a n d h i p p o c a m p u sˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o n雌性小鼠海马齿状回组织F e m a l e m i c e h i p p o c a m p a l d e n t a t e g y r u sˌH 3K 9a cˌH 3K 4m e 3雄性小鼠海马齿状回组织M a l e m i c e h i p p o c a m p a l d e n t a t e g y r u sʏH 3K 9a cʏH 3K 4m e 3小鼠皮质㊁海马组织M o u s e c o r t e x a n d h i p p o c a m p u sˌH 3K 9a c 小鼠海马组织M o u s e h i p p o c a m p u sʏm i R -219全基因组G e n o m e -w i d e学习记忆功能损伤I m p a i r m e n t o f l e a r n i n g a n d m e m o r y f u n c t i o n[25]全基因组G e n o m e -w i d e海马神经元发生障碍㊁抑郁症H i p p o c a m p a l n e u r o n a l d y s f u n c t i o n a n d d e p r e s s i o n[26]全基因组G e n o m e -w i d e空间和情景记忆能力损伤I m p a i r m e n t o f s p a t i a l a n d e p i s o d i c m e m o r y[27]ˌC a M K Ⅱ学习记忆障碍以及突触损伤L e a r n i n g a n d m e m o r y i m p a i r m e n ta n d s y n a p t i c d a m a g e[28]8㊀生态毒理学报第18卷续表1环境污染物E n v i r o n m e n t a l p o l l u t a n t s 研究对象S u b j e c t s表观遗传改变E p i g e n e t i c c h a n g e s 靶基因/蛋白质T a r g e t g e n e s /P r o t e i n s 神经毒性N e u r o t o x i c i t y 参考文献R e f e r e n c e s 锰M n人体血清H u m a n s e r u mˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o nʏN O S 2神经炎症N e u r o i n f l a m m a t i o n[29]S H -S Y 5Y 细胞S H -S Y 5Y c e l l sʏD N A 甲基化ʏD N A m e t h y l a t i o nˌP a r k i nˌP I N KˌT HˌP I N K 1-P A R K 2帕金森病P a r k i n s o n s D i s e a s e多巴胺生物合成减少R e d u c e d d o p a m i n e b i o s y n t h e s i s线粒体功能障碍M i t o c h o n d r i a l d y s f u n c t i o n[30]小鼠脑组织M o u s e b r a i n t i s s u eʏD N A 甲基化ʏD N A m e t h y l a t i o nˌM i d 1ˌN r 2f 1ˌA t p 1a 3海马神经发生持续中断,多巴胺能中间神经元数量减少S u s t a i n e d d i s r u p t i o n o f h i p p o c a m p a l n e u r o g e n e s i s a n dd e c r e a s e d n u m b e r s o f d o p a m i n e r g i c i n t e r n e u r o n s[31]P C 21细胞㊁S H -S Y 5Y 细胞P C 21c e l l s a n d S H -S Y 5Y c e l l sˌH 3a cˌH 4a c全基因组G e n o m e -w i d e细胞凋亡C e l l a p o p t o s i s[33]铅P b小鼠皮质组织M o u s e c o r t i c a l t i s s u e小鼠额叶皮层组织M o u s e f r o n t a l c o r t e x t i s s u e小鼠皮质组织M o u s e c o r t i c a l t i s s u e小鼠脑组织M o u s e b r a i n t i s s u eʏD N A 甲基化ʏD N A m e t h y l a t i o nˌN R 3C 1认知功能障碍C o g n i t i v e d y s f u n c t i o n[34]ʏD N A 甲基化ʏD N A m e t h y l a t i o nˌ神经分化相关基因ˌG e n e s i n v o l v e d i n n e u r a ld i f fe r e n t i a t i o n促进神经退化P r o m o t e n e u r o d e g e n e r a t i o n[36]ˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o nʏA P P阿尔茨海默症A l z h e i m e r D i s e a s e[37]ˌH 2K 9a cˌH 3K 4m e 2ʏH 3K 27m e 3全基因组G e n o m e -w i d e阿尔茨海默症A l z h e i m e r D i s e a s e[38]ˌm i R -106bˌm i R -124ʏA P PʏS P 1阿尔茨海默症A l z h e i m e r D i s e a s e[39]汞H g 无机汞H g 甲基汞M e H g 人体血清H u m a n s e r u mʏD N A 甲基化ʏD N A m e t h y l a t i o nˌP O N 1认知障碍C o g n i t i v e d y s f u n c t i o n[40]斑马鱼Z e b r a f i s hʏM a l a t 1/神经发育异常N e u r o d e v e l o p m e n t a l d i s o r d e r[41]N S C 细胞N S C c e l l sˌD N A 甲基化ˌD N A m e t h y l a t i o nʏP 16ʏP 21细胞周期阻滞C e l l c y c l e a r r e s t[43]L U H M E S 细胞L U H M E S c e l l sʏH 3K 27m e 3ˌT H细胞周期阻滞;多巴胺生物合成受抑制C e l l c y c l e a r r e s t ;I n h i b i t i o n o f d o p a m i n e b i o s y n t h e s i s[44]。

组学技术在环境毒理学中的应用-案例研究组学技术在环境毒理学中的应用主要包括基因组学、转录组学、蛋白组学和代谢组学等技术。

这些技术可以帮助研究人员全面、系统地了解环境污染物对生物体的影响，并揭示毒素诱导的分子机制和生物响应。

以下是一个环境毒理学中应用组学技术的案例研究：研究对象：小鼠研究目标：探究苯并[a]芘（BaP）等环境污染物引起的基因表达变化以及潜在的生物响应机制。

研究步骤：1. 通过转录组学技术获取BaP暴露小鼠和对照小鼠的RNA样本，利用高通量测序技术对转录组进行全面的分析。

2. 运用生物信息学分析方法对测序数据进行处理和筛选，找出差异表达基因（DEGs）。

3. 利用基因表达谱数据进行生物信息学分析，包括通路富集分析、转录因子分析和亚细胞定位分析等，以揭示BaP暴露对小鼠基因调控网络的影响。

4. 利用蛋白组学技术对DEGs进行验证，通过质谱分析鉴定差异表达的蛋白质。

5. 基于代谢组学技术对BaP暴露小鼠和对照小鼠的代谢产物进行分析，以揭示代谢途径的改变。

研究结果：1. 转录组学分析发现BaP暴露引起了大量基因的差异表达，包括一些与DNA修复、细胞凋亡、氧化应激和免疫反应等相关的基因。

2. 通路富集分析发现，BaP暴露可能影响多个通路，包括代谢通路、细胞凋亡通路和DNA修复通路等。

3. 转录因子分析揭示了一些差异表达基因可能关联的转录因子，进一步揭示了BaP暴露对基因调控的影响机制。

4. 蛋白组学分析发现了一些与差异表达基因相关的差异表达蛋白，进一步验证了基因表达谱数据的可靠性。

5. 代谢组学分析揭示了BaP暴露引起的代谢路径的变化，进一步揭示了BaP对代谢的潜在影响。

通过以上研究，可以深入地了解BaP等环境污染物对小鼠基因表达、蛋白质表达和代谢的影响，揭示了其潜在的生物毒性机制，为环境污染物的风险评估和环境健康保护提供了科学依据。

生态基因组学研究进展生态基因组学是生态学和基因组学的交叉学科，旨在了解生物群落的遗传多样性和功能。

在过去的几十年中，随着DNA测序技术的发展和DNA信息学分析的进步，生态基因组学已经成为一个极为活跃的领域，为我们认识和保护生物多样性以及理解生态系统的生物地球化学循环提供了新的手段。

1. 生态基因组学的研究对象生态基因组学研究的对象是生态系统中的微生物、植物、动物等所有生物，这些生物群落构成了地球上生命的重要组成部分。

生态基因组学不仅可以描述不同群落的种类和多样性，还可以分析生物间的互动关系，以及群落内的基因流及功能调节机制。

2. 生态基因组学的应用领域生态基因组学的应用领域十分广泛。

例如，生态基因组学被应用于环境污染监测中，通过对生物群落中污染物代谢和分解的基因进行分析，可以准确地了解污染物在生态系统中的分布和转化过程，进而提供有效的污染治理措施。

此外，生态基因组学也被应用于疾病的研究中。

通过对人体微生物群落基因组的深度分析，可以确定某些疾病发生的原因和机制，为科学家们发掘新型疾病治疗方案提供了新的研究思路。

3. 生态基因组学的研究进展（1）微生物革命：微生物是生态系统中最广泛存在的生物类群之一。

通过生态基因组学的研究，科学家们已经揭示了微生物控制生态系统能量和物质循环的机制以及其在生物群落功能中的重要地位。

同时，也让我们更加深入地了解了细菌以及其他微生物与宿主机体在基因和代谢水平上的关系。

（2）大规模基因组数据的挖掘：生态基因组学需要处理的基因组数据量非常大，这对于数据挖掘和信息发现提出了很高的要求。

随着机器学习、深度学习等技术的不断发展，科学家们已经成功地挖掘出了许多社区信息以及生物代谢网络等信息。

同时也发现了一些新的群落与物种，为我们认识生物多样性提供了新思路和方法。

（3）生态环境遗传学的崛起：环境遗传学是生态基因组学中的重要分支之一。

它的研究对象是生态系统与环境的相互作用中产生的基因组变异和进化过程，以及这些变异对群落组成和功能的影响。

环境毒理学表观遗传修饰催化机制详解表观遗传修饰是指在基因组水平上对基因的功能进行调控，而不改变DNA序列本身。

在环境毒理学研究中，表观遗传修饰的催化机制起到重要作用。

本文将详细解释环境毒理学中的表观遗传修饰催化机制，并探讨其对生物体的影响。

表观遗传修饰包括DNA甲基化、组蛋白修饰以及非编码RNA表达调控等多个层面。

这些修饰可以通过改变染色质的结构和功能，影响基因的表达状态。

环境毒理学中，环境污染物可以通过直接或间接地作用于这些修饰机制，从而改变基因表达和细胞命运。

首先，DNA甲基化是最常见的表观遗传修饰方式之一。

DNA甲基化是指DNA 分子上的甲基基团与某些碱基（通常是胸腺嘧啶）相结合的过程。

在环境毒理学中，DNA甲基化的催化机制可以通过污染物的介入来发生改变。

一些环境污染物，如多氯联苯（PCB）和苯并[a]芘（BaP），可作为DNA甲基转移酶的底物或抑制剂，导致DNA甲基化水平的改变。

这种改变可能会影响基因的表达，从而导致细胞的异常功能和疾病的发生。

其次，组蛋白修饰是另一种重要的表观遗传修饰方式。

组蛋白是染色质结构的主要组成部分，通过不同的修饰方式如乙酰化、甲基化、磷酸化等，可以改变染色质的结构和功能。

环境污染物可以通过直接或间接地干扰组蛋白修饰酶的活性，从而改变组蛋白的修饰模式。

例如，一些有机溶剂可以抑制乙酰化修饰酶的活性，导致组蛋白乙酰化水平的下降，进而影响基因的表达。

此外，环境污染物还可以直接与组蛋白结合，改变其结构和功能，进而影响基因的表达和细胞功能。

非编码RNA表达调控是近年来被广泛研究的表观遗传修饰方式之一。

在基因组中，大约90%的RNA转录出来后并没有编码成蛋白质，而是具有调控基因表达的功能。

环境污染物可以通过直接或间接地调控非编码RNA的表达，从而影响基因的转录和翻译过程。

例如，一些有机污染物可以干扰长链非编码RNA的表达，从而改变基因的表达模式。

此外，环境污染物还可以通过干扰非编码RNA与其靶标的结合，进一步影响基因表达和细胞功能。

微囊藻毒素对微生物的生态毒理学效应研究进展
杨翠云;刘苏静;周世伟;夏传海;刘永定
【期刊名称】《生态毒理学报》
【年(卷),期】2009(004)004
【摘要】微囊藻毒素是一类由蓝藻产生的具有肝毒性的环状肽类化合物,是富营养化淡水水体中最常见的藻类毒素,也是蓝藻水华污染过程中产量最大、危害最严重的藻毒素种类.论文根据微囊藻毒素对微生物(包括微型浮游植物、细菌、真菌)生态毒理学效应最新的研究进展,简要综述了微囊藻毒素的产生、理化性质以及对微生物的毒性效应,并对此研究领域进行了展望.
【总页数】7页(P602-608)
【作者】杨翠云;刘苏静;周世伟;夏传海;刘永定
【作者单位】中国科学院烟台海岸带可持续发展研究所,烟台264003;中国科学院烟台海岸带可持续发展研究所,烟台264003;中国科学院烟台海岸带可持续发展研究所,烟台264003;中国科学院烟台海岸带可持续发展研究所,烟台264003;中国科学院水生生物研究所,武汉430072
【正文语种】中文
【中图分类】X171.5
【相关文献】
1.微囊藻毒素对水生生物的生态毒理学研究进展 [J], 胡智泉;李敦海;刘永定;何光源
2.抗生素类兽药对植物和土壤微生物的生态毒理学效应研究进展 [J], 孔维栋;朱永官
3.扑草净在养殖水体中的生态毒理效应及其微生物降解的研究进展 [J], 张骞月;吴伟
4.微塑料对海洋生物生态毒理学效应研究进展 [J], 薄军;陈梦云;方超;郑榕辉;王素敏;洪幅坤;张玉生
5.微塑料对海洋生物生态毒理学效应研究进展 [J], 薄军;陈梦云;方超;郑榕辉;王素敏;洪幅坤;张玉生;;;;;;;
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中国科学院动物生态与保护生物学重点实验室实验室的前身是建立于1964年的中国科学院动物研究所动物生态学实验室。

在历代科学家和研究人员不懈地创新和努力下，从上世纪六十年代野生大熊猫研究的开创性工作、到九十年代初动物生态与保护生物学体系的建立，直至今日在宏、微观生物学领域所取得的卓著成就，实验室不仅已成为国内顶尖的动物生态学与保护生物学研究团队，并在同类领域内已具有相当的国际影响力。

实验室目前有十三个一流的科研团队，其中四人为杰出青年基金获得者，七人为中国科学院“百人计划”获得者，1人入选国家青年千人计划。

实验室80%以上的研究工作来自各类国家级项目和国际合作项目，每年所获得的科研经费在数千万元左右。

实验室与国际一流大学和科研机构（例如，哈佛大学，耶鲁大学，牛津大学，剑桥大学，伦敦大学学院等）有广泛和深入的合作，在大型兽类的基因组生态学、鸟类生态学、行为与进化生态学、生理生态学、入侵生态学、污染生态学、濒危珍稀动物的保护与管理、重要野生动物疫病的监测与预警等领域已获得一批具有国际一流水准的研究成果。

真诚地欢迎你加入动物生态与保护生物学实验室的研究团队，分享我们的科学理念与成就，贡献你的智慧，创造你的未来。

我们所关注的主要科学问题1．重要野生动物功能基因组及其进化历史：进入本世纪以来基因组技术的发展为揭示野生动物形状的进化机制及其演化历史提供了一个全新的技术手段。

例如，大熊猫与小熊猫均具有伪拇指，也称“第六指”，这一特殊的形态器官是食竹食性特化的趋同结果吗？大熊猫具有800多万年的进化历史，目前仅存于六大隔离的山系，是否有可能准确地重建大熊猫的演化历史？2．野生动物婚配制度的进化生物学：动物的婚配制度是动物种群繁衍发展的关键环节，也是最复杂的动物行为特征。

例如，为什么有些动物是一夫一妻，而另一些则是一夫多妻，一妻多夫，或混交制？不同的婚配制度所包含的进化生物学意义是什么？婚配制度与自然环境有什么样的关系？婚配制度的进化生物学还涉及性比、性选择及两性冲突等许多重要的科学问题。

斑马鱼在生态毒理学研究及环境监测中的应用刘辉;戴家银【摘要】斑马鱼作为一种新型的模式动物,由于其易于饲养、体外受精、产卵量大、胚胎透明及体外发育等优点,已经广泛应用于生物研究的多个领域. 近年来,斑马鱼及其胚胎也已经广泛应用于生态毒理学研究及环境监测领域;并且随着转基因斑马鱼技术的建立,斑马鱼及其胚胎将更好地应用于生态毒理学研究和环境监测.%Zebrafish, a new type of model animal , has been widely used in many fields of biological research be-cause of its low cost , ability of external fertilization , high fecundity , allowance of embryo transplant , and ectogenesis .Re-cently, zebrafish and its embryos have been widely used in ecotoxicological studies and environmental monitoring .Further-more, with the maturation of zebrafish transgenic techniques , a new era has come for environmental pollution monitoring .【期刊名称】《中国实验动物学报》【年(卷),期】2015(023)005【总页数】6页(P529-534)【关键词】斑马鱼;生态毒理学;环境监测;转基因【作者】刘辉;戴家银【作者单位】中国科学院动物生态与保护生物学重点实验室,中国科学院动物研究所,北京 100101;蚌埠医学院医学检验系,安徽蚌埠 233030;中国科学院动物生态与保护生物学重点实验室,中国科学院动物研究所,北京 100101【正文语种】中文【中图分类】Q95-33斑马鱼（英文名：zebrafish，拉丁文名：Danio rerio）也称为蓝条鱼、花条鱼、蓝斑马鱼、印度鱼或印度斑马鱼等，属于硬骨鱼类，辐鳍亚纲（Actinopterygii），鲤形目（Cypriniformes），鲤科（Cyprinidae），鱼丹属（Danio）。

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第18卷第1期2023年2月V ol.18,No.1Feb.2023㊀㊀基金项目:农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室开放课题(ZJK202010);中央高校基本科研业务费专项资金(2662021SCPY003)㊀㊀第一作者:孔娟(1995 ),女,硕士研究生,研究方向为生态毒理学,E -mail:*****************㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:*****************㊀㊀#共同通信作者(Co -corresponding author),E -mail:*********************DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20220124001孔娟,范博雅,原居林,等.环境浓度氧四环素与聚苯乙烯微塑料对黄颡鱼幼鱼肠道的联合毒性效应[J].生态毒理学报,2023,18(1):426-439Kong J,Fan B Y ,Yuan J L,et bined effects of environmental concentration of oxytetracycline and polystyrene microplastics on intestinal tract of juvenile yellow catfish (Pelteobagrus fulvidraco )[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(1):426-439(in Chinese)环境浓度氧四环素与聚苯乙烯微塑料对黄颡鱼幼鱼肠道的联合毒性效应孔娟1,范博雅1,原居林2,#,余丽琴1,3,*1.华中农业大学水产学院,武汉4300702.浙江省淡水水产研究所,湖州3130003.教育部长江经济带大宗水生生物产业绿色发展教育部工程研究中心,武汉430070收稿日期:2022-01-24㊀㊀录用日期:2022-04-24摘要:近年来,氧四环素(oxytetracycline,OTC)和聚苯乙烯微塑料(polystyrene microplastics,PS -MPs)在水环境中被广泛检出㊂为了探究PS -MPs 与OTC 对鱼类的联合毒性效应,选取黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco )幼鱼为研究对象,将其暴露于CON(对照)组㊁环境浓度OTC(500ng ㊃L -1)单独组㊁MPs -L(100μg ㊃L -1PS -MPs)单独组㊁MPs -L+OTC(100μg ㊃L -1PS -MPs+500ng ㊃L -1OTC)复合组㊁MPs -H(1000μg ㊃L -1PS -MPs)单独组和MPs -H+OTC(1000μg ㊃L -1PS -MPs+500ng ㊃L -1OTC)复合组中28d ,研究了OTC 和PS -MPs 单独以及联合暴露对幼鱼生长㊁肠道结构和肠道菌群的影响㊂研究结果表明,与对照组相比,OTC 单独暴露和MPs -L 单独暴露对黄颡鱼幼鱼体长㊁体质量及体质量增长率,肠道氧化应激酶(超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT))活性及消化酶(胰蛋白酶(trypsin,TRS)㊁淀粉酶(amylase,AMS)和脂肪酶(lipase,LPS))活性,肠道微生物组成(OTU 数目㊁α多样性㊁β多样性以及门㊁属水平上物种组成的相对丰度)均无显著性影响㊂但MPs -L+OTC 复合暴露导致SOD 和CAT 活性显著升高,引起肠道空泡化㊁肠上皮细胞轻微缺失,变形菌门的相对丰度显著升高,且与OTC 单独暴露组相比,肠道CAT 活性显著性升高㊂MPs -H 单独暴露抑制了黄颡鱼幼鱼体质量和体质量增长率,引起了肠道空泡化,导致其肠道SOD 和CAT 活性显著升高,消化酶TRS 和LPS 活性显著降低,厚壁菌门相对丰度显著降低㊂与MPs -H 单独组和OTC 单独组相比,MPs -H+OTC 组进一步加剧肠道氧化酶活性升高㊁消化酶活性降低㊁肠道损伤和肠道菌群紊乱㊂相关性分析表明,肠道葡萄球菌属和体长显著负相关;鲸杆菌属和SOD 显著正相关;气单胞菌属与LPS 显著负相关,与AMS 显著正相关㊂上述结果显示PS -MPs 高浓度单独以及与OTC 复合暴露可能通过肠道损伤以及肠道菌群的改变,进而影响肠道消化酶活性,导致黄颡鱼幼鱼生长抑制㊂此外,PS -MPs 和OTC 的复合肠道毒性表现出显著的协同效应㊂本实验结果将为水环境中抗生素和微塑料的生态风险评价提供新的视角和理论依据㊂关键词:聚苯乙烯微塑料;氧四环素;黄颡鱼幼鱼;复合暴露;肠道菌群文章编号:1673-5897(2023)1-426-14㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:ACombined Effects of Environmental Concentration of Oxytetracycline and Polystyrene Microplastics on Intestinal Tract of Juvenile Yellow Catfish (Pelteobagrus fulvidraco )Kong Juan 1,Fan Boya 1,Yuan Julin 2,#,Yu Liqin 1,3,*第1期孔娟等:环境浓度氧四环素与聚苯乙烯微塑料对黄颡鱼幼鱼肠道的联合毒性效应427㊀1.College of Fisheries,Huazhong Agricultural University,Wuhan430070,China2.Zhejiang Institute of Freshwater Fisheries,Huzhou313000,China3.Engineering Research Center of Green Development for Conventional Aquatic Biological Industry in the Yangtze River Economic Belt,Ministry of Education,Wuhan430070,ChinaReceived24January2022㊀㊀accepted24April2022Abstract:In recent years,oxytetracycline(OTC)and polystyrene microplastics(PS-MPs)have been widely detec-ted in aquatic environment.In order to investigate the combined effects of PS-MPs and OTC on intestinal tract of fish,we investigated the effects of OTC and PS-MPs exposure on growth,intestinal structure and intestinal micro-flora of fish.Juvenile yellow catfish(Pelteobagrus fulvidraco)were exposed to500ng㊃L-1OTC(OTC),100(low concentration)(MPs-L)and1000μg㊃L-1(high concentration)(MPs-H)PS-MPs,or their combination(combined MPs-L+OTC,combined MPs-H+OTC)for28d.Results showed that OTC and MPs-L alone exposure had no sig-nificant effect on the growth,intestinal antioxidant enzyme activities(including superoxide dismutase(SOD)and catalase(CAT)),digestive enzyme activities(including trypsin(TRS),amylase(AMS)and lipase(LPS)),or intesti-nal flora(including OTU number,alpha diversity,beta diversity,and relative abundance of species composition at phylum level and genus level)of juvenile yellow catfish.However,combined MPs-L+OTC exposure significantly increased SOD and CAT activities,induced intestinal vacuolation and slight loss of intestinal epithelial cells,as well as significantly increased the relative abundance of Proteobacteria as compared to the control group.Intestinal CAT activity was significantly increased in the combined MPs-L+OTC exposure group as compared to the OTC alone exposure group.Moreover,MPs-H alone exposure inhibited the body weight and weight gain rate of juvenile yellow catfish,induced intestinal vacuolation,significantly increased the activities of SOD and CAT,significantly decreased the activities of digestive enzymes TRS and LPS,and significantly decreased the relative abundance of pared with the MPs-H group and OTC group,the effects on oxidase activities,digestive enzyme activities,intestinal injury and intestinal flora were further exacerbated in the combined MPs-H+OTC group.In ad-dition,correlation analysis showed that a significant negative correlation between Staphylococcus and body length. Abundance of Cetobacterium was positively correlated with the activities of SOD.Aeromonas was negatively cor-related with the activity of LPS while positively correlated with AMS.Thus,high concentration of PS-MPs alone or combined OTC exposure might affect intestinal digestive enzyme activities through intestinal injury and changes in the intestinal flora,resulting in growth inhibition of juvenile yellow catfish.In addition,the combined intestinal tox-icity of PS-MPs and OTC showed significant synergistic effects.The results of this study might provide a new per-spective and theoretical basis for ecological risk assessment of antibiotics and microplastics in aquatic environment. Keywords:polystyrene microplastic;oxytetracycline;juvenile yellow catfish;combined exposure;intestinal flora㊀㊀抗生素(antibiotics)能干扰或抑制致病微生物的存在,广泛使用于人类及动物的疾病防治㊁畜牧及水产养殖等领域[1]㊂据统计,全世界抗生素的使用量可达10~20万t[2],其中我国是抗生素最大的生产国和消费国,2013年我国抗生素的使用量已高达16.2万t[3]㊂大多数的抗生素很难被人体或动物全部吸收,25%~75%的抗生素会以原药或代谢产物的形式通过粪便或尿液排入水环境中,已在各种水体中检测到了其广泛存在[4],主要包括四环素类㊁大环内酯类㊁磺胺类㊁喹诺酮类和氯霉素类[5-8]㊂四环素类抗生素(tetracyclines,TCs)作为我国生产量和实际使用量最大的抗生素,在各种水体中被频繁地检测到[9-12]㊂其中,氧四环素(oxytetracycline, OTC)的检出浓度最高㊂在黄浦江中OTC和TC的最高浓度分别可达479ng㊃L-1和440ng㊃L-1[13]㊂在中国的海陵湾地区水体中检测到了21种抗生素,其中OTC的浓度最高,平均浓度为417.76ng㊃L-1,最高浓度高达15.16μg㊃L-1[12]㊂有关OTC在环境浓度慢性暴露下对水生生物的影响研究较少,近几年的研究发现环境浓度OTC影响鱼类的肠道结构和微生物群落㊂环境浓度OTC(420ng㊃L-1)暴露或者投喂罗非鱼导致其生长受抑制㊁肠道屏障被破坏和428㊀生态毒理学报第18卷肠道菌群失调[14-15]㊂420ng㊃L-1OTC暴露导致斑马鱼抗氧化性显著降低,肠道屏障功能障碍,炎症因子表达量增加,肠道菌群受到干扰[16]㊂在水生态系统中,抗生素对水生生物的毒性效应也会受到一些非生物因素的影响,例如pH㊁温度㊁紫外线以及其他环境污染物(重金属㊁有机污染物等)㊂在众多的水环境污染物中,微塑料不仅能够直接对水生生物产生危害还可以作为载体吸附抗生素[17],因此其对抗生素毒性效应的影响亟待得到关注㊂微塑料(microplastics,MPs)被定义为尺寸<5mm 的塑料颗粒,具有粒径小㊁不易被降解等特点㊂环境调查发现我国水体㊁土壤和沉积物等环境中均有微塑料,且水体是其主要归趋地之一[18]㊂调查表明黄浦江与长江河口交界处微塑料浓度为(4137.3ʃ2461.5)个㊃m-3[19]㊂武汉市湖泊水体大多流动性较小或是静水,其微塑料的累积量高达(8925ʃ1591)个㊃m-3[20]㊂对水环境中微塑料种类的检测发现,聚苯乙烯微塑料(polystyrene microplastics,PS-MPs)是其主要成分之一[21]㊂MPs极易通过摄食等途径在水生生物体内累积,其在各种鱼类㊁中华白鳍豚和东亚江豚等肠道内均被检测到[22-25]㊂此外,微塑料能够抑制鱼类摄食和生长,引起肠道损伤和炎症,氧化应激毒性和生殖毒性等多种毒性效应[26-29]㊂其中,微塑料对鱼类肠道损伤和微生物群落的影响近年来受到了广泛的关注㊂研究发现PS-MPs暴露导致斑马鱼肠道菌群失调㊁炎症反应和肠道屏障功能障碍[30-32]㊂为了探索PS-MPs和OTC对鱼类的联合毒性效应,本文以黄颡鱼幼鱼为实验生物,探究了环境浓度OTC(500ng㊃L-1)和PS-MPs(100μg㊃L-1和1000μg㊃L-1)单独及联合暴露28d后对黄颡鱼幼鱼的生长㊁肠道氧化应激㊁肠道消化酶活性㊁肠道组织病理及肠道菌群的影响㊂本研究从个体水平㊁器官水平和微生物水平评价OTC和PS-MPs对黄颡鱼幼鱼的肠道影响,进而为评价PS-MPs和OTC的环境健康风险评价提供理论依据㊂1㊀材料与方法(Materials and methods)1.1㊀实验试剂氧四环素,CAS号为6153-64-6,纯度ȡ97%,购自上海麦克林生化科技有限公司,使用去离子水将OTC溶解配制成浓度为50μg㊃mL-1的储备液,储存在4ħ冰箱里㊂聚苯乙烯微塑料(PS-MPs,球形,5μm,纯度ȡ99%)购自天津倍思乐色谱技术开发中心,用去离子水将微塑料原液稀释为1mg㊃mL-1的储备液,储存在4ħ冰箱;PS-MPs储备液使用前需超声20min并用曝气24h的自来水稀释为100μg㊃L-1和1000μg㊃L-1的暴露液㊂1.2㊀黄颡鱼驯养及暴露实验黄颡鱼鱼苗购自武汉市黄优源渔业发展有限公司,将刚出苗3d的黄颡鱼鱼苗转移至室内养殖系统中进行为期2周的暂养㊂在实验开始时,选取规格一致的健康仔鱼(平均体长(13.38ʃ0.62)mm,平均体质量(0.028ʃ0.003)g)分别暴露在CON组㊁OTC (500ng㊃L-1)组㊁MPs-L(100μg㊃L-1PS-MPs)组㊁MPs-H(1000μg㊃L-1PS-MPs)组㊁MPs-L+OTC(100μg㊃L-1PS-MPs+500ng㊃L-1OTC)组和MPs-H+OTC (1000μg㊃L-1PS-MPs+500ng㊃L-1OTC)组共6个浓度组中,每组有3个平行缸,每缸60尾鱼于18L暴露液中㊂暴露养殖水为曝气24h的自来水,暴露过程中持续稳定曝气(防止微塑料颗粒凝聚)㊂保持稳定的水质参数:pH=7~8,水温(26.1ʃ0.8)ħ,溶氧(16.4ʃ0.2)mg㊃L-1,光周期为14h/10h(昼/夜),每天更换一半暴露液㊁暴露时间为28d㊂每天投喂商业饲料3次(10:00㊁16:00和21:00),投喂率为鱼体质量的4%㊂1.3㊀PS-MPs的表征分析表征前,将PS-MPs进行20min超声,采用超纯水制备5mL浓度为1000μg㊃L-1的测试溶液㊂采用透射电子显微镜(TEM,HT-7700,日本日立有限公司)来观察PS-MPs的尺寸;用纳米粒度及Zeta电位分析仪(Zetasizer Nano ZS,英国马尔文公司)测得PS-MPs的Zeta电位㊂1.4㊀生长指标的测定暴露结束后,黄颡鱼禁食24h后浸泡在<4ħ的冰水浴中安乐死㊂每个浓度每个平行取25尾黄颡鱼幼鱼,测量并分析黄颡鱼幼鱼的体质量(body weight,BW)㊁体长(body length,BL)(黄颡鱼幼鱼吻到尾鳍基部)㊁存活率(survival rate,SR)㊁体质量增长率(weight gain rate,WGR)㊁特定生长率(specific growth rate,SGR)(d-1)㊁脑体比(brain somatic index, BSI)和肝体比(hepato somatic index,HSI)㊂计算公式如下:存活率(SR)=(N t/N)ˑ100%体质量增长率(WGR)=(W t-W0)/W0ˑ100%特定生长率(SGR)=[ln(W t/N t)-ln(W/N)]/tˑ100%肝体比(HSI)=(肝脏质量/W t)ˑ100%脑体比(BSI)=(脑质量/W t)ˑ100%式中:W为试验鱼的初始质量(g),W t为试验鱼的第1期孔娟等:环境浓度氧四环素与聚苯乙烯微塑料对黄颡鱼幼鱼肠道的联合毒性效应429㊀终末质量(g),N和N t为试验开始和试验结束时每组鱼尾数,t为试验时间(d)1.5㊀肠道组织病理分析暴露28d后,随机从每个浓度每个平行缸取4尾黄颡鱼幼鱼用于肠道组织病理学分析㊂取样前禁食24h,解剖取中肠组织(1~2cm)于4%多聚甲醛缓冲液固定24~48h㊂肠组织经乙醇㊁二甲苯透明液脱水,石蜡包埋㊁切片(4μm),苏木精和伊红(H& E)染色切片,使用立体显微镜(Leica,M205FA,德国)的400倍镜头进行组织病理学评估㊂1.6㊀肠道抗氧化酶的活性测定暴露28d后,禁食24h,随机从每个浓度每个平行中取3尾黄颡鱼幼鱼肠道测定酶的活性㊂装入EP冻存管迅速置于液氮冷冻,置于-80ħ冰箱中保存待测㊂使用组织细胞破碎仪(Buller Blender,Tis-sulyser-24,美国Next Advance公司)将肠组织样品和0.86%冷生理盐水均质,4ħ离心15min(2500r㊃min-1)㊂取上清液按照试剂盒说明书测定肠道超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(catalase,CAT)酶活性㊂蛋白质浓度采用蛋白定量(TP)测定盒(BCA微板法)测定㊂实验所使用酶标仪为Synergy H4(Biotek,VT,USA),使用的商业化试剂盒均购自南京建成研究所㊂1.7㊀肠道消化酶的活性测定暴露结束后,每个浓度每个平行中取3尾黄颡鱼幼鱼用于消化酶活性的测定,肠道的取样方法和前处理方法同1.6㊂测定肠道胰蛋白酶(trypsin, TRS)㊁淀粉酶(amylase,AMS)和脂肪酶(lipase,LPS)活性的方法参照各试剂盒说明书㊂酶液蛋白质浓度采用蛋白定量(TP)测定盒(BCA微板法)测定㊂所使用的商业化试剂盒购自南京建成研究所㊂1.8㊀肠道菌群16S rRNA扩增子测序分析暴露结束后,随机从各实验组的每个平行缸中在无菌操作台上取6尾黄颡鱼幼鱼肠道用于肠道菌群测序检测㊂具体操作如下:冰盘上无菌解剖黄颡鱼肠道并收集,液氮速冻后转移至-80ħ冰箱中待测㊂将取得的36个肠道样本送至广东美立康生物科技有限公司进行测序分析㊂具体分析流程如下:采用两步PCR法,使用通用正向引物515F(5 -GT-GYCAGCMGCCGCGGTA-3 )和反向引物909R(5 -CCCCGYCAATTCMTTTRAGT-3 )扩增微生物16s rRNA基因的V4-V5高变区,扩增条件为94ħ预变性3min,然后进行30个循环的常规扩增(94ħ变性40s,56ħ退火60s,72ħ延伸60s),最后72ħ延伸10min㊂使用1.2%的琼脂糖凝胶电泳后采用sanPrep DNA凝胶回收试剂盒(生工,中国)纯化,所有纯化的DNA等量混合后,对高变区进行PCR扩增后用Illumina Miseq测序平台对PCR扩增产物进行测序,鉴定群落中的微生物组成和其相对丰度㊂采用QIIME1.9.0软件按照序列97%的相似性将序列聚类为OTUs(Operational Taxonomic Units),计算α多样性指数和UniFrac距离矩阵并进行PCoA排序分析㊂1.9㊀数据分析与统计所有数据均以 平均值ʃ标准误差 (MeanʃSEM)表示,双因素方差分析(Two-way ANOV A)方法分析试验数据的差异性(IBM SPSS Statistics22)㊂如果差异达到显著水平(P<0.05),选择Duncan法进行多重比较分析㊂运用R(4.1.2)采用相关分析方法分析黄颡鱼幼鱼生长㊁肠道氧化应激水平和肠道消化酶活性与肠道微生物之间的相关性㊂2㊀结果(Results)2.1㊀聚苯乙烯微塑料(PS-MPs)的表征如图1所示,用透射电子显微镜观察到PS-MPs 的尺寸为5μm(图1(a)),用纳米粒度及Zeta电位分析仪(Zetasizer Nano ZS)测得PS-MPs的Zeta电位为-44.3mV(图1(b)),表明PS-MPs在超纯水中,直径为5μm,粒径几乎没有差异㊂2.2㊀OTC和PS-MPs暴露28d后对幼年黄颡鱼生长性能的影响如表1所示,暴露28d后,与对照组相比,OTC 组㊁MPs-L组和MPs-L+OTC组的所有生长指标均无显著性差异;MPs-H组的体质量显著下降15.06%(P< 0.05),体质量增长率显著下降8.41%(P<0.05);MPs-H +OTC组的体质量显著下降15.45%(P<0.05),体质量增长率显著下降17.17%(P<0.05),SGR显著下降7.49%(P<0.05),BSI显著降低25.57%(P<0.05);此外,与MPs-H组相比,MPs-H+OTC组的BSI显著降低了19.79%(P<0.05)㊂2.3㊀中肠组织病理分析如图2所示,黄颡鱼肠组织结构可由黏膜层㊁肌层和浆膜层组成,淋巴细胞常在上皮细胞之间分布,多位于基底部㊂与对照组相比,OTC组和MPs-L组的肠道组织形态学完整,肠黏膜皱襞排列整齐,纹状缘清晰,边缘光滑,没有明显的病理损伤(图2(a)㊁2 (b)和2(d))㊂在MPs-H组中,肠道出现轻微的组织430㊀生态毒理学报第18卷损伤:少量空泡化现象(图2(c))㊂在MPs -L+OTC 组和MPs -H+OTC 组中,组织损伤加剧:部分淋巴细胞轻微向游离面游走,空泡化变性,肠上皮细胞轻微缺失,固有膜结缔组织疏松(图2(e)和2(f))㊂2.4㊀黄颡鱼幼鱼肠道抗氧化酶的活性如图3所示,与对照相比,OTC 组和MPs -L 组未受到显著性影响;MPs -H 组的SOD 活性和CAT活性分别显著提高了35.3%(P <0.05)和100.8%(P <0.05);MPs -L+OTC 组的SOD 活性和CAT 活性分别显著提高了42.7%(P <0.05)和85.5%(P <0.05);MPs -H+OTC 组中SOD 活性和CA T 活性分别显著提高了120.5%(P <0.05)和169.6%(P <0.05)㊂此外,与MPs -H 组相比,MPs -H+OTC 组CAT 活性和SOD 活性分别显著提高了34.3%(P <0.05)和63.7%(P <0.05)㊂图1㊀聚苯乙烯微塑料(PS-MPs )的尺寸和Zeta 电位注:(a)PS -MPs 透射电子显微镜图;(b)PS -MPs 在水溶液中的Zeta 电位㊂Fig.1㊀Dimensions and compositions of polystyrene microplastics (PS -MPs)Note:(a)TEM of PS -MPs;(b)Zeta potential of PS -MPs.表1㊀氧四环素(OTC )和PS-MPs 单独及复合暴露对幼年黄颡鱼生长性能的影响Table 1㊀Effects of oxytetracycline (OTC)and PS -MPs alone or in combination exposureon growth performance of juvenile yellow catfish指标Index CON OTC MPs -L MPs -L+OTC MPs -H MPs -H+OTC存活率(SR)/%Survival rate (SR)/%0.75ʃ0.040.71ʃ0.030.74ʃ0.020.72ʃ0.030.67ʃ0.050.71ʃ0.03体长(BL)/mm Body length (BL)/mm 24.77ʃ0.3324.72ʃ0.4723.99ʃ0.2623.82ʃ0.2624.27ʃ0.3024.31ʃ0.24体质量(BW)/mg Body weight (BW)/mg 279.40ʃ0.01a 274.74ʃ0.02a 245.62ʃ0.01ab 256.10ʃ0.01ab 237.32ʃ0.01b 236.24ʃ0.01b体质量增长率(WGR)/%Growth rate of body weight (WGR)/%897.85ʃ46.31a 881.20ʃ55.32ab 777.21ʃ40.04abc 814.53ʃ36.13abc 762.35ʃ38.08bc 743.70ʃ34.23c特定生长率(SGR)/d -1Specific growth rate (SGR)/d-18.96ʃ0.16a 8.90ʃ0.23a 8.69ʃ0.15ab 8.84ʃ0.14ab 8.43ʃ0.13ab 8.29ʃ0.15b肝体比(HSI)/%Hepato somatic index (HSI)/%2.12ʃ0.33 2.03ʃ0.29 1.85ʃ0.22 1.73ʃ0.17 1.85ʃ0.16 1.96ʃ0.14脑体比(BSI)/%Brain somatic index (BSI)/%3.05ʃ0.19a 2.72ʃ0.18ab 2.89ʃ0.18a 2.67ʃ0.15ab 2.83ʃ0.14a 2.27ʃ0.11b注:同列中标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P <0.05)㊂Note:Different lowercase letters in the same column indicated significant difference among groups (P <0.05).第1期孔娟等:环境浓度氧四环素与聚苯乙烯微塑料对黄颡鱼幼鱼肠道的联合毒性效应431㊀图2㊀OTC 和PS-MPs 单独及复合暴露对黄颡鱼幼鱼鱼肠道组织的影响(400ˑ,比例尺为50μm )注:柱状上皮细胞(1);杯状细胞(2);固有层(3);淋巴细胞(4);空泡化(ң);肠上皮细胞缺失(һ);淋巴细胞向游离面游走(ʀ)㊂Fig.2㊀Effect of OTC and PS -MPs alone or in combination exposure on gut histologyof juvenile yellow catfish (400ˑ,scale bars 50μm)Note:Columnar epithelial cells (1);goblet cells (2);lamina propria (3);lymphocytes (4);vacuolation (ң);intestinal epithelial cells are absent (һ);lymphocytes migrate to the free surface (ʀ).图3㊀OTC 和PS-MPs 单独及复合暴露对黄颡鱼幼鱼氧化应激酶活性的影响(n =3)注:标注不同小写字母表示组间有显著性差异(P <0.05)㊂Fig.3㊀Effects of OTC and PS -MPs alone or in combination exposure on oxidative stress activityof juvenile yellow catfish gut (n =3)Note:Different lowercase letters indicated significant difference among groups (P <0.05).2.5㊀黄颡鱼幼鱼肠道消化酶的活性如图4所示,与对照组相比,OTC 组㊁MPs -L 组和MPs -L +OTC 组的消化酶未受到显著性影响;MPs -H 暴露组的脂肪酶(LPS)和胰蛋白酶(TRS)活性分别显著下降了35.61%(P <0.05)和48.01%(P <0.05);MPs -H+OTC 暴露组的LPS 和TRS 活性分别432㊀生态毒理学报第18卷图4㊀OTC 和PS-MPs 单独及复合暴露对黄颡鱼幼鱼肠道消化酶活性的影响(n =3)注:标注不同小写字母表示组间有显著性差异(P <0.05)㊂Fig.4㊀Effects of OTC and PS -MPs alone or in combination exposure on gut digestive enzyme activitiesof juvenile yellow catfish (n =3)Note:Different lowercase letters indicated significant difference among groups (P <0.05).显著下降了47.73%(P <0.05)和60.25%(P <0.05)㊂2.6㊀微塑料和氧四环素对黄颡鱼幼鱼肠道菌群的影响2.6.1㊀微塑料和氧四环素对黄颡鱼幼鱼肠道菌群α多样性的影响和主成分分析㊀㊀α多样性中,Chao1指数为描述群落丰富度的指数,指数越大,代表对应的群落其丰富度就越高㊂Shannon 指数和Simpson 指数为描述群落多样性的指数,综合考虑了群落的丰富度和均匀度,其值越高,群落的多样性越高㊂如图5(a)所示,MPs -H +OTC 组OTUs 数目与对照组相比,显著下降(P <0.05),其余组别无显著性影响㊂如图5(b)㊁5(c)和5(d)所示,与对照组相比,所有处理组的Simpson 指数无显著性差异,MPs -H 组的Shannon 指数(菌群的物种多样性)显著性降低(P <0.05),MPs -H+OTC 组的Chao1指数(菌群丰富度)(P <0.05)和Shannon 指数(菌群的物种多样性)显著性降低(P <0.05)㊂如图5(e)所示,从Weighted Unifrac 距离来进行PCoA 分析,一个点代表一个样本,同种颜色的点表示相同的处理组㊂投影分析表明样本之间距离越近,在相应维度中的群落组成越相似㊂与对照组相比,MPs -H +OTC 暴露组发生了分离,其余组均有重合㊂2.6.2㊀微塑料和氧四环素对黄颡鱼幼鱼肠道菌群门㊁属水平的影响在门水平上,共检出53个门(2个古细菌门和51个真细菌门)㊂如图6(b)所示,其中优势门(至少在一个样品的相对丰度超过1%)有变形菌门(Pro -teobacteria)㊁梭杆菌门(Fusobacteria)㊁厚壁菌门(Firm -icutes)㊁蓝藻门(Cyanobacteria)㊁酸杆菌门(Acidobacte -ria)㊁放线菌门(Actinobacteria )㊁拟杆菌门(Bacte -roidetes)㊁浮霉菌门(Planctomycetes)和软壁菌门(Te -nericutes)㊂如图6(a)所示,肠道菌群主要富集在3个门上:变形菌门(Proteobacteria)㊁梭杆菌门(Fuso -bacteria)和厚壁菌门(Firmicutes)㊂对照组中变形菌门㊁梭杆菌门和厚壁菌门的相对丰度分别为38.44%㊁24.22%和15.53%;OTC 组中为33.73%㊁49.65%和13.74%;MPs -L 组中为27.63%㊁5.42%和13.01%;MPs -H 组中为43.56%㊁5.20%和2.52%;MPs -L +OTC 组中为78.57%㊁5.57%和2.65%;MPs -H+OTC 中为15.30%㊁79.32%和0.85%㊂与对照组相比,OTC 组㊁MPs -L 组肠道菌群无显著性变化;MPs -H 组中厚壁菌门的相对丰度显著下降83.77%(P <0.05);MPs -L+OTC 低浓度联合暴露组中变形菌门的相对丰度显著上升104.40%(P <0.05);MPs -H +OTC 高浓度联合暴露组中,变形菌门和厚壁菌门的相对丰度分别显著下降60.20%(P <0.05)和94.53%(P <0.05),梭杆菌门的相对丰度显著上升227.50%(P <0.05);此外,与MPs -H 组相比,MPs -H+OTC 中变形菌门的相对丰度显著下降64.87%(P <0.05),梭杆菌门的相对丰度显著上升了1425.38%(P <0.05)㊂在属水平上,如图6(c)所示,优势属主要有鲸杆菌属(Cetobacterium )㊁埃希氏菌属(Escherichia )和邻单胞菌属(Plesiomonas ),对照组中鲸杆菌属㊁埃希氏菌属和邻单胞菌属相对丰度分别为27.12%㊁25.91%和第1期孔娟等:环境浓度氧四环素与聚苯乙烯微塑料对黄颡鱼幼鱼肠道的联合毒性效应433㊀图5㊀OTC 和PS-MPs 单独及复合暴露对黄颡鱼幼鱼肠道菌群α多样性指数和β多样性指数的影响注:标注不同小写字母表示组间有显著性差异(P <0.05)㊂Fig.5㊀Effects of OTC and PS -MPs alone or in combination exposure on alpha diversity and beta diversity of intestinal microbiotain juvenile yellow catfishNote:Different lowercase letters indicated significant difference among groups (P <0.05).0.69%,OTC 组中为49.65%㊁0.1%和24.09%,MPs -L 组中为5.23%㊁1.10%和6.63%,MPs -H 组中为5.04%㊁6.83%和20.99%,MPs -L +OTC 组中为5.53%㊁46.57%和1.99%,MPs -H +OTC 组中为79.31%㊁0.05%和14.75%㊂与对照组相比,在MPs -H+OTC 高浓度联合暴露组中,鲸杆菌属的相对丰度显著上升了192.44%(P <0.05);与MPs -H 组相比,MPs -H+OTC 组中鲸杆菌属的相对丰度显著上升了1373.61%(P <0.05)㊂2.6.3㊀微塑料和氧四环素对黄颡鱼幼鱼的生理指标与肠道微生物之间的相关性分析㊀㊀如图7所示,葡萄球菌属(Staphylococcus )与体长成显著负相关(P <0.05)㊂鲸杆菌属(Cetobacterium )与SOD 成显著正相关(P <0.05),与BSI 成显著负相关(P <0.01)㊂气单胞菌属(Aeromonas )与LPS 成显著负相关(P <0.05),与AMS 成显著正相关(P <0.05)㊂3㊀讨论(Discussion )OTC 的滥用导致其在水环境中被频繁检测出,相关研究表明,环境中广泛存在的OTC 能够在水生生物体内累积[33],环境浓度OTC 能够通过PS -MPs 吸附加剧其在生物体内蓄积[34]㊂目前,OTC 和PS -MPs 联合暴露是否影响黄颡鱼幼鱼肠道健康损伤还是未知的㊂本研究通过OTC 和PS -MPs联合暴露黄颡鱼仔鱼28d ,探究其生长指标㊁肠道病理损伤㊁肠道抗氧化酶活性㊁消化酶活性及肠道菌群变化㊂毒理学实验中,生长是评价环境压力对生物影响的重要参数之一[35]㊂本研究中,环境浓度的OTC单独暴露对黄颡鱼幼鱼的生长无显著影响㊂这一结434㊀生态毒理学报第18卷图6㊀OTC 和PS-MPs 单独及复合暴露对黄颡鱼幼鱼肠道菌群组成的影响注:(a)各类群在门水平上的相对丰度;(b)门水平上肠道微生物组成;(c)属水平上的肠道微生物组成;标注不同小写字母表示组间有显著性差异(P <0.05)㊂Fig.6㊀Effect of OTC and PS -MPs alone or in combination exposure on the intestinal microbialcomposition in juvenile yellow catfishNote:(a)Relative abundance of various groups at phylum level;(b)Gut microbiota composition at the phylum level;(c)Gut microbiotacomposition at the genus level;different lowercase letters indicated significant difference among groups (P <0.05).果与之前的研究类似,420ng ㊃L -1OTC 暴露成年斑马鱼42d ,对其生长无显著影响,但引起成年代谢率显著性增加,表明鱼类需要额外的能量来耐受毒理学应激,而不是将其用于生长[35]㊂本实验中,100μg ㊃L -1PS -MPs 对黄颡鱼幼鱼的生长无显著性影响,但1000μg ㊃L -1PS -MPs 显著抑制黄颡鱼幼鱼的体质量增长㊂类似的研究也发现100mg ㊃L -1PS -MPs 暴露50d 后显著抑制了鲫鱼体质量增长[36],这可能是由于PS -MPs 会导致饱腹感,通过影响其进食来抑制其生长㊂本实验中MPs -H+OTC 组黄颡鱼幼鱼会显著降低其体质量,但与对应的MPs -H 和OTC 单独暴露组相比均无显著性㊂在肠道微生物与体长的相关性分析中发现,葡萄球菌属与体长成显著负相关㊂葡萄球菌属是一群革兰氏阳性球菌,其中金黄色葡萄球菌作为一种常见的致病菌,感染严重时能导致坏死性肺炎至肺组织坏死[37],表明金黄色葡萄球菌可能与黄颡鱼生长抑制相关㊂鱼类的肠道是一个重要的器官,不仅参与消化㊁吸收和免疫,而且还能充当有害物质入侵的屏障[32]㊂肠道的形态完整性在一定程度上可以反映肠道的健康状况[33,37]㊂我们的实验结果表明OTC 单独暴露(500ng ㊃L -1)对肠道无显著性病理损伤,但是有研究报道420ng ㊃L -1OTC 暴露斑马鱼48d 减少了斑马鱼肠道中杯状细胞的数量[35]㊂2个研究中结果的不一致可能与抗生素暴露浓度㊁暴露时间不同有关㊂近年来,一些研究探索微塑料暴露对生物肠道上皮细胞的影响[37],值得关注的是5μm 的PS -MPs 可以进入肠道,并穿过黏液屏障,与肠上皮细胞部分直接第1期孔娟等:环境浓度氧四环素与聚苯乙烯微塑料对黄颡鱼幼鱼肠道的联合毒性效应435㊀图7㊀黄颡鱼幼鱼样本的细菌属丰度(>1%)与鱼类健康指数的Pearson相关性分析注:筛选了与鱼类健康指数显著相关的肠道微生物属,蓝色表示正相关,红色表示负相关;*P<0.05和**P<0.01表示该相关性分析具有显著差异;SOD表示超氧化物歧化酶,CAT表示过氧化氢酶, TRS表示胰蛋白酶,LPS表示脂肪酶,AMS表示淀粉酶,HSI表示肝体比,BSI表示脑体比,Length表示体长,Weight表示体质量㊂Fig.7㊀Pearson correlation analysis of bacterial abundance (>1%)and fish health index in juvenile yellow catfish samples Note:The intestinal microbe genera significantly correlated with fish health index were screened,with positive correlation in blue and negative correlation in red;*P<0.05and**P<0.01indicate significant differences in the correlation analysis;SOD stands for superoxide dismutase;CAT stands for catalase;TRS stands for trypsin;LPS stands for lipase;AMS stands for amylase;HSI stands for hepato somatic index;BSI stands for brain somatic index;Length stands for body length;Weight stands for body weight.接触[38]㊂本实验中,MPs-H组造成肠道少量空泡化变性,类似的研究也发现纤维状PS-MPs(10μg㊃L-1)暴露成年斑马鱼21d后,使其肠道产生轻微空泡化变性[27]㊂本研究联合暴露中,MPs-L+OTC组和MPs-H+OTC组肠道中部分淋巴细胞轻微向游离面游走,空泡化变性,肠上皮细胞轻微缺失,固有膜结缔组织疏松,表明OTC与PS-MPs复合暴露加剧了黄颡鱼幼鱼的肠道损伤㊂氧化应激酶可以反映鱼体对外部刺激的反应及其自由基新陈代谢的状态[39]㊂抗氧化酶(包括SOD 和CAT)是对抗生物体中自由基的酶防御机制的第一道防线[40]㊂本实验中,OTC单独组(500ng㊃L-1)对黄颡鱼幼鱼肠道氧化应激酶活性无显著性影响㊂类似研究表明50μg㊃L-1的OTC暴露斑马鱼仔鱼48h后,对SOD和CAT的活性无显著性影响[41]㊂本研究中,MPs-H组中黄颡鱼幼鱼肠道SOD和CAT活性显著升高㊂这一结果与先前的研究类似, PS-MPs作为激活剂能促进体内抗氧化酶(SOD和CAT)的分泌,在这个过程中提高了鱼类清除自由基和减少过氧化氢的能力[39],PS-MPs(5μm,1000μg㊃L-1)暴露斑马鱼21d显著增加SOD和CAT活性[42]㊂本研究MPs-H+OTC组与MPs-H组相比,显著加剧了黄颡鱼幼鱼肠道SOD和CAT活性的升高㊂表明1000μg㊃L-1PS-MPs显著增加了黄颡鱼幼鱼肠道抗氧化能力,而1000μg㊃L-1PS-MPs和500ng㊃L-1OTC复合暴露会给黄颡鱼幼鱼肠道氧化应激抵抗力带来额外的压力,增强对其SOD和CAT活性的促进作用㊂而在肠道微生物与SOD的相关性分析中,鲸杆菌属和SOD呈显著正相关,在MPs-H+OTC组中,PS-MPs与OTC可能通过黄颡鱼幼鱼肠道内鲸杆菌属的显著上升影响其SOD活性的升高㊂鱼类消化酶活性能够直接反应鱼类本身摄食以及消化情况,消化酶活性越高,鱼的生长情况越好[43]㊂本实验中,OTC对黄颡鱼幼鱼肠道淀粉酶(AMS)㊁脂肪酶(LPS)和胰蛋白酶(TRS)活性无显著影响㊂这与肖亮[44]的发现类似,250mg㊃kg-1OTC 饲料喂养异育银鲫28d对其肠道消化酶(AMS㊁LPS 和TRS)活性和生长均无显著影响㊂这表明OTC组肠道消化酶与生长指标结果是相符的㊂本研究中1000μg㊃L-1PS-MPs显著降低了黄颡鱼幼鱼肠道LPS和TRS的活性㊂据报道,PS-MPs进入鱼类肠道,会导致饱腹感,使获取的食物和能量减少,影响其消化性能,MPs浓度越高,对消化性能的抑制作用越大[45],类似研究中PS-MPs(32~40μm,1000μg㊃L-1)暴露孔雀鱼幼鱼28d,显著降低其肠道AMS㊁LPS和TRS活性[46]㊂消化酶在蛋白质㊁脂质和碳水化合物的水解中起着非常重要的作用,从而。

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第18卷第6期2023年12月V ol.18,No.6Dec.2023㊀㊀基金项目:国家自然科学基金资助项目(42277116);山东省自然科学基金资助项目(ZR2022MB029)㊀㊀第一作者:杨怡欣(1999 ),女,硕士研究生,研究方向为生态毒理学,E -mail:****************㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:*****************.cn㊀㊀#共同通信作者(Co -corresponding author ),E -mail:******************.cnDOI:10.7524/AJE.1673-5897.20230704002杨怡欣,董文彬,刘文敏,等.双酚S 对斑马鱼幼鱼早期视觉发育的影响[J].生态毒理学报,2023,18(6):177-186Yang Y X,Dong W B,Liu W M,et al.Effects of bisphenol S on early visual development of zebrafish larvae [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(6):177-186(in Chinese)双酚S 对斑马鱼幼鱼早期视觉发育的影响杨怡欣1,董文彬2,刘文敏3,*,张晓娜1,#1.中国海洋大学海洋生命学院,青岛2660032.青岛启诚环境科技有限公司,青岛2660413.临沂大学,临沂276005收稿日期:2023-07-04㊀㊀录用日期:2023-09-07摘要:塑料添加剂双酚S(bisphenol S,BPS)广泛应用于多种工业产品和日用品的生产,在环境及人体样本中频繁检出,其视觉毒性近年来备受关注㊂本研究采用1㊁10㊁100㊁1000μg ㊃L -1BPS 暴露斑马鱼受精卵15d ,通过石蜡切片分析视网膜结构,并检测视黄酸代谢基因和视蛋白基因表达量变化,探究了BPS 对斑马鱼幼鱼早期视觉发育的影响㊂结果表明,10㊁100㊁1000μg ㊃L -1BPS 暴露抑制了其视黄酸合成相关基因的表达,并下调了感光细胞发育相关基因神经视网膜亮氨酸拉链基因的表达量;100㊁1000μg ㊃L -1BPS 暴露组斑马鱼幼鱼多种视蛋白基因(紫外敏感视蛋白㊁蓝光敏感视蛋白和绿光敏感视蛋白)表达量增加;苏木精-伊红染色结果显示不同浓度BPS 暴露会导致斑马鱼幼鱼视网膜及视网膜核层中神经节细胞层㊁内核层和外核层厚度显著降低;且对体长㊁头宽与眼睛直径数据的比较及皮尔逊相关性分析表明,BPS 诱导15dpf 的斑马鱼幼鱼出现小眼现象㊂综上所述,BPS 可能通过干扰视黄酸代谢影响斑马鱼早期视网膜发育,其对视觉系统的潜在健康风险需引起人们的广泛关注㊂关键词:双酚S ;斑马鱼;视觉毒性;视黄酸文章编号:1673-5897(2023)6-177-10㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:AEffects of Bisphenol S on Early Visual Development of Zebrafish LarvaeYang Yixin 1,Dong Wenbin 2,Liu Wenmin 3,*,Zhang Xiaona 1,#1.College of Marine Life Sciences,Ocean University of China,Qingdao 266003,China2.Qingdao Qicheng Environmental Technology Co.,Ltd,Qingdao 266041,China3.Linyi University,Linyi 276005,ChinaReceived 4July 2023㊀㊀accepted 7September 2023Abstract :The plastic additive bisphenol S (BPS)has been widely used in various industrial and household products,and frequently detected in environmental and human samples.For the past few years,increasing concern has been focused on the visual toxicity of BPS.Here,after zebrafish embryos were exposed to BPS (1,10,100,and 1000μg ㊃L -1)for 15days,retinal histology and expression of genes involved in retinoic acid metabolism and op -sin genes were examined to investigate the effect of BPS on the early visual development of larval zebrafish.The results showed that exposure to 10,100and 1000μg ㊃L -1BPS inhibited the expression of genes related to retinoic178㊀生态毒理学报第18卷acid synthesis and the expression of neural retina leucine zipper gene(nrl)that related to photoreceptor cell development,while the expression of opsin genes(zfblue,zfuv and zfgr)was increased in100μg㊃L-1and1000μg㊃L-1BPS groups.The results of hematoxylin-eosin staining showed that the thickness of the retina,the ganglion cell layer,the inner nuclear layer,and the outer nuclear layer was significantly decreased by different doses of BPS. In addition,BPS also induced small eyes in15-dpf zebrafish larvae,based on Pearson correlation analysis of the body length,the head width,and the eye diameter.In summary,our study suggested that BPS probably affected early retinal development of zebrafish by interfering with retinoic acid metabolism,and its potential health risk to the visual system should arouse extensive attention.Keywords:bisphenol S;zebrafish;visual toxicity;retinoic acid㊀㊀双酚S(bisphenol S,BPS)作为双酚A(bisphenol A,BPA)的结构类似物已被广泛使用,在地表水㊁湖泊[1]㊁沉积物[2]㊁洗发水等日用品[3]以及尿液[4]和血液等多种介质中被检出,其检出浓度和检出率呈逐年上升趋势[5]㊂调查发现BPS在我国流溪河中含量高达65μg㊃L-1[6],且辽宁地区孕妇血清中BPS平均浓度已达1.24μg㊃L-1[7-8]㊂视网膜是胚胎-发生期中枢神经系统的延伸,极易受环境因素的影响[9-10]㊂已有研究表明,BPA㊁四溴双酚A和四溴双酚S具有潜在的视网膜发育毒性,对人类早期视网膜发育表现出类似的不利影响[11-12],因而我们推测BPS极有可能存在与其相似的视网膜发育毒性㊂实验室前期研究表明BPS长期暴露斑马鱼会使成年斑马鱼的眼动反应(optokinetic response, OKR)受损,并降低其视觉追踪能力[13];同时BPS还会导致斑马鱼幼鱼趋光反应减弱[14]㊂正常的OKR 依赖于发育成熟的完整视网膜,而BPS很有可能通过影响斑马鱼幼鱼的视网膜发育导致其OKR受损㊂Lobo等[15]的研究指出视觉功能OKR的损伤与光感受器视锥和视杆细胞变性及眼内视黄酸(retinoic acid,RA)类物质含量降低有关㊂感光细胞是高度特化的感觉神经元,课题组前期研究表明BPS能够造成感光细胞视锥细胞DNA损伤和结构损伤,但其是否干扰了视网膜发育期感光细胞的发育尚未见报道㊂在眼中,眼中发色团与感光细胞中的视蛋白共价结合,在光激发过程中形成视觉色素,从而启动视觉转导级联反应,即视觉的起始㊂RA除了与视觉功能密切相关外,也是脊椎动物视觉系统尤其是光感受器发育过程中的重要信号分子[16-17],RA代谢通路扰乱会显著影响生物的视觉功能[18],如将视黄醛代谢为RA的视黄醛脱氢酶(retinal dehydrogenase, RALDH)突变后会导致严重的小眼症[19]㊂已有研究表明BPA暴露母体后会增加雄性小鼠肝脏中全反式视黄酸含量并上调了RA合成相关基因的表达,导致维甲酸信号通路异常[20]㊂因而,BPS是否会通过影响视黄酸信号通路并干扰感光细胞发育导致幼年斑马鱼视觉行为出现障碍需进一步探究㊂综上,本文首先检测了1㊁10㊁100和1000μg㊃L-1BPS暴露15d对不同发育阶段斑马鱼幼鱼眼睛大小的影响㊂随后,采用组织切片方法观察幼鱼视网膜及其各层结构变化,并在分子水平进一步检测了斑马鱼幼鱼RA代谢㊁视蛋白基因表达量变化,旨在探究BPS对早期视网膜发育的影响㊂1㊀材料与方法(Materials and methods)1.1㊀材料斑马鱼品系为Tuebingen(Tu)系,成年斑马鱼已在实验室内繁殖饲养一年以上㊂饲养条件如下: DO(7.0ʃ0.1)mg㊃L-1,pH(7.8ʃ0.2),水温(27ʃ1)ħ,光暗比为14h(L)ʒ10h(D),每天早晚2次喂食适量新孵化的丰年虾㊂雌雄斑马鱼以1ʒ2的比例混合,次日开灯刺激其追逐产卵,收集健康的受精卵,清洗后用于暴露实验㊂BPS纯度ȡ98%,购自Sigma-Aldrich(上海,中国)㊂暴露液配制使用二甲基亚砜(DMSO,分析纯,购自北京索莱宝公司,中国)作为助溶剂,储备液浓度为0.01mg㊃L-1和1mg㊃L-1㊂麻醉剂MS-222(纯度ȡ98%)㊁甲基纤维素均购自Sigma-Aldrich(上海,中国)㊂1.2㊀双酚S暴露实验实验采用半静态暴露方法,设置溶剂对照组(DMSO,体积比0.002%)和浓度为1㊁10㊁100和1000μg㊃L-1的BPS暴露组,每个暴露组设置3个烧杯㊂暴露至受精后12h(12hpf)挑取死卵,每天更换2/3的暴露溶液㊂待受精卵孵化24h后开始喂食草履虫,自受精后10d(10dpf)起开始喂食新孵化的丰年虾(Artemia),暴露至15dpf后取样㊂第6期杨怡欣等:双酚S对斑马鱼幼鱼早期视觉发育的影响179㊀1.3㊀斑马鱼幼鱼体长㊁体质量㊁头宽和眼睛直径测量不同浓度BPS暴露斑马鱼胚胎至5㊁7和15dpf后,每组取20条于10%中性福尔马林固定液中固定24h后光学显微镜下观察,CCD拍照后采用Image J软件测量横轴方向眼睛长度㊁身体长度(沿体轴测量从头宽最前端到尾巴最后端的体长)和纵轴方向眼睛长度㊁头宽(图1),每组取30条幼鱼置于1.5mL离心管中后称重,每组取6个平行样品㊂图1㊀斑马鱼幼鱼头宽㊁眼睛直径测量示意图[21]Fig.1㊀Arrows indicate locations of the measurements of the diameter of eye and the width of head[21]1.4㊀石蜡切片的制备随机取各组斑马鱼幼鱼若干,对其固定后乙醇梯度洗脱,石蜡包埋常规切片制片,使用苏木精-伊红染色,用中性树胶封片㊂光学显微镜下观察并拍照,选择有代表性的显微照片分析各暴露组斑马鱼幼鱼视网膜组织学变化,并用Image J软件测量各组眼睛各层结构:视网膜色素上皮(retinal pigmented epithelium,RPE)㊁外核层(outer nuclear layer,ONL)㊁内核层(inner nuclear layer,INL)㊁内丛状层(inner plexiform layer,IPL)㊁神经节细胞层(ganglion cell layer,GCL)㊁视网膜(包括RPE㊁ONL㊁INL㊁IPL和GCL)的厚度,每组选取7个鱼的眼睛,每个眼睛选取4个切片,每个眼睛选取视网膜中央部位测5处㊂1.5㊀Real-time RT-PCRTrizol(美国Invitrogen公司)法提取斑马鱼幼鱼总RNA后,使用微量分光光度计(美国Thermo公司,NanoDrop2000c)检测RNA样品的OD230㊁OD260㊁OD280和RNA浓度,并使用琼脂糖凝胶电泳检测提取RNA的质量㊂按PrimeScript TM RT Reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒(日本TaKaRa公司)说明对等量的质量合格的RNA进行反转录㊂琼脂糖为Biowest公司产品;焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)㊁溴化乙啶(ethidium bromide,EB)为Sigma公司产品㊂根据Genebank已发表的基因序列,利用引物设计软件Primer Premier5.0software(PREMIER Bio-soft Int.Palo Alto,USA)按照实时定量PCR的引物设计原则设计目的基因的特异性引物㊂引物序列见表1㊂RT-PCR按照SYBR Premix Ex Taq TMⅡKit 试剂盒(日本TaKaRa公司)说明,使用荧光定量PCR仪(德国Eppendorf公司,Eppendorf MasterCycler®ep RealPlex4)进行㊂反应程序设置为:95ħ30s;95ħ表1㊀荧光定量引物序列Table1㊀Primer sequences for the genes基因GeneGenBank号GenBank No.引物序列(5 ~3 )Primer sequence(5 ~3 ) elfαNM_200009F:TGCCAGTGTTGCCTTCGTCR:AATCTTCCATCCCTTGAACCAGβ-actin BC045846F:GTTTTCCCCTCCATTGTTGR:GTAGAAGGTGTGATGCCAGAT rbp4NM-130920F:CAGCAACTTCGCCGTCCAACAR:AACAGCCCAACAGGGTCTTTCTTG crbp1a NM-199528F:CGATGTGAACACTGGCAGGATGAAR:AGTCCACCGTAGTTTGGCACTTTC rdh1NM-198069F:CTCATCGCTGCTGTCTGGTTCTTCR:GCCGCTGTCACATCCCGTTATC raldh2AF-339837F:TGAACTGCCAGGAGAGGTGAAGAAR:GCCGCTCACAGAATCATGCCAT crabp1a NM-182858F:TCAAGACCTCCACCACTGTCCGR:TTCTGCCATCCACCGTCTCCTC crabp2a NM-182859F:GGACCACCAACGTCACCTTCACR:GTCTGTTACCCAGCGAGGAAAGC rarαa NM-131406F:AGGCTTCGGTCCGCTAACAGAR:CCGTCTCAGCATCGTCCATCTCTA crx NM_152940F:CCCGTACCTTTCTCCCATGACCAR:CCAACGACGCAGTGCTGTATCC otx2NM_131251.1F:CCTCTATCTCGCCGCTGTCAGAR:TCCAGACGCTTGAGTGTAGGTCAT rx2NM_131226.2F:CACAGACGCAACAGAACCACCTTR:AACTCGAACTTCAGGCAGGTTGAC nrl NM_001040331.1F:TCCACCACCCACACCATCCAATR:ACGCTCTTCCACACCGCACT zfrho L11014F:GTACGTCACCATCGAGCACAAGAAR:GAACACCATGAAGAGGTCGGCAAT zfblue AF109372F:TTCGGTTCCTCGGTAGCGTTCTR:CACCACAGCAAGAGACCACAAACT zfred EH435011F:CCCAGCACAAGAAACTCCGACAGR:TGTAGCCCACAAGTGAGCAGTAGA zfgr BC060896F:GCCGAGAAGGAAGTGTCCAGAATGR:AAGCAGGCGAAGAACGTGTAAGG zfuv AF109373F:TGGTTGTTGTGATGGTTGGCTCTTR:GGCGGTAATCCTTGTTTGGCTCAT180㊀生态毒理学报第18卷5s,60ħ30s,40cycles;扩增后使用2%的琼脂糖凝胶对产物进行电泳检测,从而进一步确定扩增片段的特异性和长度㊂以β-actin和elf-α为内参基因计算目的基因的相对表达量㊂1.6㊀统计学分析应用SPSS(version19.0;SPSS Inc.,Chicago,IL, USA)软件对数据进行统计学分析㊂数据均以平均数ʃ标准差形式表示,采用One-Way ANOV A和Tukey s multiple range test检验各暴露组与对照组之间的统计学差异,P<0.05㊁P<0.01表示差异显著(用*㊁**标记)㊂2㊀结果(Results)2.1㊀双酚S短期暴露对斑马鱼体长㊁体质量和眼睛大小的影响不同浓度的BPS暴露斑马鱼胚胎至5dpf和7 dpf后,与溶剂对照组相比,各暴露组幼鱼的体长均没有显著性的变化,但暴露15dpf后,100μg㊃L-1暴露组斑马鱼的体长出现显著下降(图2(a))㊂经称量后发现,在各个暴露时间点,各暴露组幼鱼的体质量均没有显著性变化(图2(b))㊂空白对照组与溶剂对照组相比,均无显著性的变化㊂暴露15dpf后,与溶剂对照组相比,10㊁100和1000μg㊃L-1暴露组X和图2㊀不同浓度的双酚S(BPS)暴露斑马鱼胚胎至5㊁7和15dpf后对斑马鱼幼鱼形态的影响注:(a)对斑马鱼幼鱼体长的影响;(b)对斑马鱼幼鱼体质量的影响;(c)对斑马鱼幼鱼头宽的影响;(d)对斑马鱼幼鱼眼睛横向直径X的影响;(e)对斑马鱼幼鱼眼睛纵向直径Y的影响;SC表示二甲基亚砜(DMSO)溶剂对照;n=20;*表示P<0.05,**表示P<0.01㊂Fig.2㊀Effects on morphology in zebrafish larvae exposed to different concentrations ofbisphenol S(BPS)from embryos to5,7and15dpfNote:(a)Length,(b)Weight,(c)Head width of larvae,(d),(e)The diameter of eye;SC stands for solutioncontrol of dimethyl sulfoxide(DMSO);n=20,*P<0.05,**P<0.01.第6期杨怡欣等:双酚S对斑马鱼幼鱼早期视觉发育的影响181㊀Y的长度均显著减少(图2(d)和(e)),且100μg㊃L-1暴露组的头宽也显著减少(图2(c))㊂相关性分析发现,15dpf斑马鱼幼鱼眼睛的大小与头宽㊁体长均显著相关(表2),对体长㊁头宽与眼睛直径数据的比较表明10μg㊃L-1和1000μg㊃L-1BPS诱导15dpf的斑马鱼幼鱼产生了小眼㊂2.2㊀双酚S暴露对斑马鱼幼鱼视网膜结构的影响如图3(a)~(e)所示,溶剂对照组和各暴露组斑马鱼幼鱼视网膜结构完整,各核层排布规则紧密㊂对视网膜及各核层定量结果表明(图3(f)),与溶剂对照组相比10μg㊃L-1组GCL厚度显著减少了7.24%; 100μg㊃L-1和1000μg㊃L-1组INL厚度分别显著降低7.92%和14.86%;1000μg㊃L-1组ONL厚度显著降低了13.95%,且该组视网膜总厚度显著降低了6.03%㊂2.3㊀双酚S暴露对斑马鱼幼鱼视黄酸信号通路的影响与溶剂对照组相比,不同浓度的BPS暴露斑马鱼胚胎至15dpf后,10㊁100和1000μg㊃L-1暴露组视黄醇结合蛋白基因(rbp4)的表达量显著上调;10μg㊃L-1组中Ⅰ型细胞视黄醇结合蛋白基因(crbp1a)被显著上调;视黄醛脱氢酶基因(raldh2)的表达量在100μg㊃L-1暴露组出现显著上调,且该组视黄醇脱氢酶基因(rdh1)的表达量出现显著下调;1μg㊃L-1暴露组视黄酸结合蛋白基因Ⅰ(crabp1a)的表达显著上调,其余暴露组中视黄酸结合蛋白基因Ⅱ(crabp2a)均出现了显著性的上调;而视黄酸受体α(rarαa)的表达量在各暴露组均无显著性的变化(图4)㊂2.4㊀双酚S暴露对斑马鱼幼鱼视觉发育相关基因的影响使用不同浓度的BPS暴露斑马鱼受精卵至15d后,与溶剂对照组相比,10μg㊃L-1和100μg㊃L-1组神经视网膜亮氨酸拉链(nrl)的表达被显著下调,其他与感光细胞发育相关基因表达无显著变化㊂除最低浓度1μg㊃L-1暴露组外,其他各暴露组紫外敏感视蛋白(zfuv)的表达量均显著上调(P<0.01),10㊁100和1000μg㊃L-1暴露组蓝光敏感视蛋白(zfblue)的表达量也出现显著上调;10μg㊃L-1和1000μg㊃L-1暴露组绿光敏感视蛋白(zfgr)的表达量显著上调(P<0.01),但是1μg㊃L-1和100μg㊃L-1暴露组无显著性变化;各暴露组视紫红质视蛋白(zfrho)和红光敏感视蛋白(zfred)的表达量均无显著性变化(图5)㊂3㊀讨论(Discussion)课题组前期研究表明,100μg㊃L-1BPS能够降低斑马鱼幼鱼的趋光性和视觉追踪能力,损伤其视觉功能[22]㊂视网膜发育障碍可能直接影响视觉功能,组织病理学分析表明,BPS于发育早期暴露15d对斑马鱼幼鱼视网膜结构并无明显损伤,但低浓度组(10μg㊃L-1)GCL㊁高浓度组ONL及INL厚度均显著降低㊂GCL主要由视网膜神经节细胞组成,该细胞是连接视网膜和大脑视觉中心的重要视网膜神经元[23],可整合来自光感受器的信息㊂GCL厚度的减小会导致眼睛或视觉处理中心功能障碍㊂大量研究表明,视黄酸类物质对维持脊椎动物眼睛正常发育至关重要[24]㊂眼睛是动物体内维生素A含量最高的部位,也是其活性调控中心,缺乏维生素A的大鼠子代表现出包括小眼在内的多种眼部缺陷[25]㊂本研究结果发现,低浓度(10μg㊃L-1)及高浓度的BPS暴露导致15dpf斑马鱼幼鱼眼睛横向直径X和纵向直径Y均显著减小,出现小眼㊂在斑马鱼胚胎发育过程中,视黄醇与视黄醇结合蛋白结表2㊀BPS暴露后斑马鱼的头宽㊁体长和眼睛直径之间的皮尔逊相关性分析Table2㊀Pearson s correlation analysis of head width,body length and eye diameter in zebrafish exposed to BPS测量部位Measuring part眼睛直径-XDiameter-X眼睛直径-YDiameter-Y体长Body length5dpf7dpf15dpf5dpf7dpf15dpf5dpf7dpf15dpf头宽Head width0.461**0.341*0.350*0.2650.332*0.752**0.1040.0850.316*眼睛直径-XDiameter-X 0.553**0.2230.445**0.111-0.0880.872**眼睛直径-YDiameter-Y 0.1510.0030.398**注:数据为皮尔逊相关系数;n=50;*表示P<0.05,**表示P<0.01㊂Note:Data in the figure are Pearson s correlation coefficients;n=50;*P<0.05,**P<0.01.182㊀生态毒理学报第18卷图3㊀不同浓度BPS暴露斑马鱼胚胎至15dpf对幼鱼视网膜结构及厚度的影响注:(a)溶剂对照组;(b)1μg㊃L-1BPS暴露组;(c)10μg㊃L-1BPS暴露组;(d)100μg㊃L-1BPS暴露组;(e)1000μg㊃L-1BPS暴露组;(f)不同浓度BPS对15dpf幼鱼视网膜及各核层厚度的影响;GCL表示神经节细胞层,IPL表示内丛状层,INL表示内核层,ONL表示外核层,RPE表示视网膜色素上皮层;标尺为50μm;n=10;*表示P<0.05,**表示P<0.01㊂Fig.3㊀Histopathological analysis of larval zebrafish retina structure in the solvent control and different concentrations of BPS groups Note:(a)The solvent control group;(b)1μg㊃L-1BPS treated group;(c)10μg㊃L-1BPS treated group;(d)100μg㊃L-1BPS treated group;(e)1000μg㊃L-1BPS treated group;(f)Thickness of retina and nuclear layers of zebrafish larvae;GCL stands for ganglion cell layer,IPL stands for inner plexiform layer,INL stands for inner nuclear layer,ONL stands for outer nuclear layer,and RPE stands for retinal pigmented epithelium;scale bar is50μm;n=10;*P<0.05,**P<0.01.图4㊀不同浓度(1㊁10㊁100和1000μg㊃L-1)BPS暴露斑马鱼胚胎至15dpf对幼鱼视黄酸信号通路相关基因表达的影响注:n=6;*表示P<0.05,**表示P<0.01㊂Fig.4㊀Effects on the expression of retinoid signaling-related genes in zebrafish larvaeexposed to1,10,100,and1000μg㊃L-1BPS from embryos to15dpfNote:n=6;*P<0.05,**P<0.01.第6期杨怡欣等:双酚S 对斑马鱼幼鱼早期视觉发育的影响183㊀图5㊀不同浓度(1㊁10㊁100和1000μg ㊃L -1)BPS 暴露斑马鱼胚胎至15dpf 对幼鱼眼睛发育(crx ㊁otx 2㊁rx 2和nrl )和视蛋白相关基因(zfred ㊁zfgr ㊁zfrho ㊁zfblue 和zfuv )表达的影响注:n =6;*表示P <0.05,**表示P <0.01㊂Fig.5㊀Effects on the expression of eye development -related genes (crx,otx2,rx2and nrl )and opsin genes (zfred,zfgr,zfrho,zfblue,and zfuv )in zebrafish larvae exposed to 1,10,100and 1000μg ㊃L -1BPS from embryos to 15dpfNote:n =6;*P <0.05,**P <0.01.合,通过血液运输至眼部等靶器官㊂眼中的视黄醇由Ⅰ型细胞视黄醇结合蛋白运输至靶细胞,在视黄醇脱氢酶的催化下转化为视黄醛,该反应为RA 生成中的限速步骤,而过量视黄醛则在RALDH 催化下不可逆地氧化为RA ㊂本研究中100μg ㊃L -1BPS 暴露组rbp4和crbp1a 表达显著上调㊁rdh1表达显著下调,表明BPS 导致幼鱼眼中视黄醛生成过程受损,可能导致视黄醇累积㊁RA 生成减少㊂虽然100μg ㊃L -1BPS 暴露导致斑马鱼幼鱼raldh2基因表达量显著上调,但课题组相关研究结果发现该浓度BPS 导致幼鱼眼中RA 含量显著降低(未发表)㊂Begemann 等[26]研究发现,RA 可通过作用于raldh2启动子进而负反馈调节该基因的表达[27-28]㊂本研究高浓度BPS 暴露组raldh2表达量显著上调,可能是由于RA 不足的负反馈作用所致㊂胞内的RA 被视黄酸结合蛋白(cellular retinoic acid binding protein,CRABP)运输至细胞核后,将与视黄酸受体(retinoic acid receptors/retinoid X recep -tors,RARs/RXRs)结合,可启动与眼睛发育相关的特定基因的转录㊂Sharma 等[29]发现CRABPs 可以调节RA 与其核受体RAR 结合,从而在靶基因的转录启动中发挥重要作用㊂斑马鱼具有2种CRABP 异构体(CRABP Ⅰ和CRABP Ⅱ),CRABP Ⅰ主要负责运送细胞色素P450家族酶解的RA ;当RA 与CRABP Ⅱ结合后,将被转运至细胞核,以驱动RARs/RXRs 介导的RA 靶向基因表达[30]㊂在大多数动物中,维甲酸类化合物无法从头合成,需从外界摄取并在需要时输送至靶器官[25]㊂本研究中,BPS 暴露显著上调crabp2a 表达量,可能是由于RA 生成不足产生的补偿性反应,需要更多的RA 转运到细胞核中,从而与RARs 结合来调节目标基因转录[31]㊂RA 是脊椎动物视觉系统中光感受器发育的重要信号分子[32],RA 缺失会导致包括视网膜发育障碍[33-34]㊁OKR 减弱等视觉损伤,是本研究中高浓度组视网膜核层变薄的可能原因㊂与视黄醛共价结合的视蛋白是由ONL 处的光感受器合成的光敏蛋白质,是脊椎动物光感受器中视觉色素的重要组成部分[35],不同的视蛋白决定视色素的光谱敏感性㊂本研究中,低浓度(10μg ㊃L -1)及高浓度BPS 显著上调了zfblue ㊁zfuv 和zfgr 基因表达量,增强了对蓝光㊁紫外和绿光的敏感性㊂接触多溴联苯醚[36]和BPS [13]等持久性有毒物质会改变光感受器视蛋白基因的转录,从而导致视觉行为改变㊂且本研究与Qiu 等[22]的研究结果一致,即BPS 会上调绿锥和紫外锥等视锥视蛋白基因的表达㊂这些结果表明,为了提高对光的敏锐度,斑马鱼对眼部光感受器中视黄醛供应减少和RA 信号传导的干扰可能存在补偿性反应㊂本研究中otx2㊁crx 和rx2在15dpf 的基因转录水平无显著性变化,推测是由于它们主要在光感受器的早期发育中发挥其主要作用[37-38]㊂本研究还发现,低浓度(10μg ㊃L -1)及高浓度(100μg ㊃L -1)BPS 处理会下调nrl 的转录水平㊂敲184㊀生态毒理学报第18卷除该基因的斑马鱼在幼年时缺乏视杆细胞,并且有过量的紫外锥[39]㊂因此nrl下调表明BPS暴露致使视杆细胞发育受阻,推测是ONL厚度降低,视蛋白zfuv显著上调的原因之一㊂已有研究报道了BPS对鱼类的视觉毒性,但其对视网膜早期发育的影响研究还较为缺乏㊂本研究中,我们发现10㊁100和1000μg㊃L-1BPS抑制了RA的合成并下调了感光细胞发育相关基因的表达,减小了视网膜核层中GCL㊁INL和ONL的厚度,导致斑马鱼视网膜早期发育障碍,诱导15dpf 斑马鱼幼鱼出现小眼现象㊂100μg㊃L-1BPS暴露组中斑马鱼幼鱼可能通过上调相应视蛋白基因表达,增强对蓝光㊁紫外和绿光的敏感性而对上述发育障碍进行补偿调节㊂综上,本研究表明BPS短期暴露即会对早期视网膜发育产生毒性,完善的视觉功能对鱼类的觅食[40-41]㊁避敌[42]和求偶[43]等行为至关重要,因而BPS的早期发育视觉毒性可能对鱼类的生存繁衍构成严重威胁㊂且随着BPS的广泛使用,婴幼儿的暴露风险不断增加,所造成的潜在健康问题如视网膜发育不良等的风险也不容忽视㊂通信作者简介:刘文敏(1987 ),女,博士,讲师,主要研究方向为生态毒理学㊂共同通信作者简介:张晓娜(1986 ),女,博士,副教授,主要研究方向为环境污染物的毒理与健康效应㊂参考文献(References):[1]㊀Yan Z Y,Liu Y H,Yan K,et al.Bisphenol analogues insurface water and sediment from the shallow Chinesefreshwater lakes:Occurrence,distribution,source appor-tionment,and ecological and human health risk[J].Chemosphere,2017,184:318-328[2]㊀Jin H B,Zhu L Y.Occurrence and partitioning of bisphe-nol analogues in water and sediment from Liaohe RiverBasin and Taihu Lake,China[J].Water Research,2016, 103:343-351[3]㊀Wu L H,Zhang X M,Wang F,et al.Occurrence of bis-phenol S in the environment and implications for humanexposure:A short review[J].The Science of the TotalEnvironment,2018,615:87-98[4]㊀Liao C Y,Liu F,Alomirah H,et al.Bisphenol S in urinefrom the United States and seven Asian countries:Occur-rence and human exposures[J].Environmental Science&Technology,2012,46(12):6860-6866[5]㊀Rochester J R,Bolden A L.Bisphenol S and F:A sys-tematic review and comparison of the hormonal activityof bisphenol A substitutes[J].Environmental Health 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2018国自然-生命科学部及医学科学部名单三七自毒物质降解菌的特性和作用机制研究黄荣韶DEELA蛋白介导赤霉素调节山药块茎膨大的分子机理王爱勤广西巴马小型猪2型糖尿病易感性相关LncRNA的筛选及机制研究兰干球自我构念影响心理理论加工的ERP研究：基于中国-东盟国家的跨文化比较蒋钦广西长寿人群饮食、肠道菌群和代谢物特征凝练与数据平台初建李全阳卵形鲳鲹SIGIRR通过TLRs-MyD88信号通路对巨噬细胞炎症应答的影响与机制研究韦友传鸡传染性支气管炎病毒多表位嵌合病毒样颗粒的构建及其免疫应答机制研究磨美兰甘蔗尾青贮核心发酵菌群和代谢物演替规律及其对水牛瘤胃细菌多样性的影响邹彩霞基于定量磷酸化蛋白质组学在水牛精子发生过程的分子机制研究张明小分子化合物在水牛原始卵泡体外激活中的作用及其分子机制的研究杨素芳KDM6B和Xist双基因表达调控对牛体细胞核重编程中X 染色体重塑影响机理的研究韦精卫Nanos2维持水牛精原干细胞干性特征机制的研究杨小淦应用基因捕获高通量测序精准鉴定影响水牛产奶性状的关键基因研究刘庆友寄生蜂定位致瘿害虫的化学机制研究——以孟氏胯姬小蜂为例郑霞林过氧化氢与一氧化氮互作对桉树耐铝性的调控作用及其机理滕维超沿海纬度梯度分布红树科植物对温度变化的水力结构和功能响应蒋国凤短氟碳低聚物定向接枝纤维素的合成机理及其构效关系研究朱红祥具有生物活性的3-蒈烯衍生物的合成及光异构研究段文贵心材化过程中木质部薄壁细胞代谢活性与心材成分生成机制符韵林番茄抗细菌性髓部坏死病遗传规律的研究及分子标记筛选王先裕番茄伴生植物的筛选及混栽促生组合番茄根际及内生微生物群落解析杨尚东芒果FT基因在成花过程中的分子机制研究罗聪咪唑啉酮类除草剂在水生微宇宙系统中对映选择性环境行为和毒性效应谭辉华乙烯调控罗汉果性别的细胞学及分子遗传研究周琼甘蔗体细胞融合育种中杂合体细胞再生植株的分子机制李素丽microRNA调控铝诱导花生根尖细胞程序性死亡发生的分子机制何龙飞水稻可塑性基因RPL1调节水稻株高的分子机制研究张翠翠中国原始被子植物瘿螨总科区系与分布格局机制研究王国全珍贵乡土树种与桉树混交修复土壤质量的效应及机理研究温远光Landscape and population genomics of endangered&nb Kim Shan We 共生真菌对Euops属卷叶象甲幼虫发育的营养功能及分子机制研究李晓琼红树植物生物钟预测环境和潮汐变化能力对其光合的贡献及机制研究朱俊杰高巢被捕食压力下北热带石灰岩森林鸟类的繁殖行为与策略蒋爱伍bE2-bW1复合体调控甘蔗黑穗病菌丝状生长的机制陈保善十字花科黑腐病菌小RNA分子伴侣蛋白Hfq的作用机理研究唐东阶水稻条斑病菌III型效应子XopN致病机理研究黄胜一个新的双组份信号转导系统感受子基因抑制III型分泌系统的信号途径研究姜伟十字花科黑腐病菌全局性转录调控因子HpaR1与Clp共同调控致病生化因子表达之模式研陆光涛冯军功能化纳米复合材料hCEs SERS探针的构建及在血清与细胞中检测羧酸酯酶活性的越南槐根内生真菌生态功能及其与宿主药材品质相关性研究姚裕群基于甘蔗生产全程机械化的肥料氮利用与土壤氮迁移研究韦剑锋潘丽霞三联吡啶类金属配合物、靶点DNA与DNA拓扑异构酶结合方式及三元复合物结构基础的研松香基分子印迹膜的结构调控及定向分离三七活性成分三七素的研究黄钦基于表型性状和ISSR标记的苹婆遗传多样性分析及核心种质构建周婧用晶格Boltzmann方法研究功能性微气泡生成机制何冰一种双吡嗪基脲衍生物通过ERK/Slug/vimentin/BCRP信号轴逆转表阿霉素耐药的研究陈家念中国吟螽属修订（直翅目：螽斯科：蛩螽亚科）边迅猫儿山小鲵生活史不同阶段的生境选择研究黄华苑生境破碎化对白头叶猴肠道寄生虫的影响及其行为适应周岐海中亚热带石灰岩常绿落叶阔叶混交林植物功能性状分异及其对环境变化响应的研究姜勇两种青牛胆属植物中抑制小胶质细胞活化成分的发现及其初步作用机制研究廖海兵王任翔边缘鳞盖蕨复合体种 (Microlepia marginata complex) 的网状盐藻类胡萝卜素合成调控相关的转录因子基因的作用分析尚常花蛋白纳米疫苗 VP6-Ferritin 高效免疫的结构基础研究王丹喀斯特地貌生境隔离对洞穴鱼类物种形成和分布格局的作用机制杨剑不同施肥措施下甘蔗田土壤温室气体排放过程机理及其调控因素李卓亭火干扰对大兴安岭森林更新结构和地上生物量动态的影响蔡文华喀斯特不同生境类型树种水力特征及其权衡关系研究刘艳艳岩溶植物根系对水环境变化的形态可塑性响应及其水分再分配的生态效应研究黄玉清淡水刚毛藻目的系统分类学研究赵志娟海洋生物来源天然小分子生物碱抗HIV-1机制研究周波长链非编码RNA LINC00857介导非小细胞肺癌耐药的机制研究王丽惠微环境CAFs源性外泌体调控非小细胞肺癌EGFR-TKI耐药及其机制阳洁靶向耐药肺癌的高选择性共价Bmx抑制剂的设计、合成及其生物活性研究何林洪circRNA-miRNA-p38MAPK通路调控网络对缺血性脑卒中及其中医证候的影响与机制研究苏莉留兰香香蜂草苷对肝纤维化内质网应激--自噬通路的调控作用机制林兴基于NF-κB信号通路探索青蒿琥酯对伴糖尿病牙周炎炎症反应及成骨调控的效应和机制研究农晓琳氯化两面针碱基于miR-125b-2-3p/IER3调控轴抗HCC作用的机制研究党裔武多源信息下基于贝叶斯网络的综合性医院门诊量不确定性分析与预测黄代政miR-132-RB1/E2F1信号通路与肝癌发生发展的分子流行病学研究容敏华我国HIV-1肺储存库的准种遗传多样性和细胞嗜性研究宁传艺黄东萍基于壮族出生队列的孕早期环境雌激素污染物联合暴露与胎儿婴儿发育情况的关系研究TNFR-RIPK1/RIPK3信号通路介导铅致神经细胞程序性坏死的机制研究李少军PP2Ac甲基化调控脂质自噬在苯并芘促进非酒精性脂肪性肝病中的作用研究李习艺炎症小体信号通路诱导的细胞焦亡在锰致机体认知损害中的作用邹云锋自噬在职业锰暴露致心脏毒性中的作用及机制研究杨晓波慢性低水平镉暴露经由ICAM-1和VCAM-1糖基化修饰促进血管内皮炎症的研究钟秋安miR-3942-5p在结肠癌中的功能机制研究及其在泛癌中的诊断和预后评估戴盛明增强Ⅱ型光敏剂介导的光动力抗白色念珠菌作用与机制研究黄力毅ICOS/ICOSL通路调控Th9分化介导日本血吸虫病肝纤维化的分子机制战廷正环状RNAcirc_103595/miR-185-3p/PLK1信号轴对肝癌不全消融后残余癌增殖侵袭的调控杨红多模态MRI对2型糖尿病小型巴马猪胰腺病变的病理对照研究及临床应用龙莉玲miR-106b-5p启动子甲基化状态介导MAPK/ERK信号通路调控腰椎间盘退变机制的研究江华EB病毒编码潜伏膜蛋白LMP2A通过ITGα6β4/ACSL4路径抵抗鼻咽癌细胞铁死亡温文胜MiR-3162-5p通过激活Ras信号通路促进宫颈鳞癌细胞EMT 的作用及机制研究陈军莹潜在抑癌基因LAMC3和LAMA2调控细胞自噬参与卵巢癌耐药的机制研究尹富强新生抗原neoantigen介导溶瘤病毒治疗复发性卵巢癌的应用及机制研究王琪OY-TES-1/miR-326协同调控PD-L1促胶质瘤免疫逃逸的机制初探罗彬SPINK4调控结肠癌细胞铁死亡的作用机制研究胡榜利冯振博hsa_circRNA_104515竞争性结合miR-1303调控PLIN1在肝细胞癌发生发展中的作用及机制HMGA1介导lncRNA-LINC01615增强THBS2表达及其在肝癌转移中的作用与机制研究唐博刘博白介素24定点整合自体诱导多潜能干细胞来源的间充质干细胞对子宫内膜癌的生长抑制红桂木凝集素扩增移植诱导的记忆干性T细胞抗肝癌研究周素芳RBM38结合并促进LncRNA-GAS5稳定逆转肝癌索拉非尼耐药的机制研究叶甲舟何宝玉长链非编码RNALOC553103通过ROCK1-RhoA/ROCK 信号通路调控细胞骨架重构促进鼻咽癌转高糖诱导肝细胞外泌体中miR-132差异表达促进EMT介导的胰腺癌转移的分子机制秦雯陈洁CirR-387与let-7d-5p竞争性调节GALNT1经EGFR/E-cadherin通路调控肝细胞癌EMT的机制广西HBV/AFB1双暴露女性原发性肝细胞癌早期预警模型的建立及相关分子机制的研究韩创业RNF125通过泛素化修饰PD-L1促进肿瘤免疫的分子机制研究吴飞翔基于UPLC-MS/MS联合MRM的靶向与非靶向代谢组学方法研究蛇伤中毒标志物廖明王威线粒体ATP敏感性钾通道和与线粒体自噬对急性心肌梗死大鼠心肌细胞的影响与机制研究淫羊藿苷经Notch通路调控大鼠ASCs促进超长随意皮瓣存活的机制研究梁至洁抑制PD-L1+中性粒细胞对脓毒症治疗的价值探索张森ERK抑制剂经由线粒体动力学-自噬途径促进心肺复苏后神经细胞生存研究陈蒙华弱酸性富钙磷离子环境下单核细胞来源外泌体的miRNA表达变化及其靶细胞效应研究廖红兵周诺lncRNA和MicroRNA调控胚胎内皮祖细胞Notch、BMP、Wnt 信号通路参与牵张成骨血管发生Notch信号通路在树鼩耳蜗感觉前体细胞增殖和分化中的调控作用谢利红宋星慧基于mTOR通路探讨外泌体介导树突状细胞活化在系统性红斑狼疮中的作用机制研究&nbs雷玲系统性硬化症中IL-35诱导iTr35细胞分化导致Treg/ Th17细胞失衡及纤维化病变的孔德燕黑色素纳米颗粒通过上调Iduna的表达促进间充质干细胞在缺血条件下的存活并增强其治刘斯佳基于石墨相氮化碳纳米片的双基因协同输送系统用于小鼠胚胎神经干细胞定向诱导分化G蛋白偶联受体MC1R抑制α-Syn聚集及细胞间传递的分子机制研究肖友生秦超内皮细胞膜微粒通过LncRNA MIAT调控神经元Beclin-1和Caspase-3 加重脑缺认知相关遗传变异及其与环境的交互作用对长寿人群认知功能的影响彭均华LncRNA NR_120526结合转录因子ILF2/3调控血红蛋白F合成的机制研究何云燕血栓弹力图评估遗传性异常纤维蛋白原血症患者凝血功能的价值研究闫婕应燕萍抗阻运动下调miR-92a-3p介导内皮细胞HMOX1/MAPKs/NF-κB预防导管相关性血栓形成的机制研究GLP-1受体激动剂通过IRS-1/PI3K/Akt信号通路调节骨代谢何玉玲基于静息态功能磁共振的急性甲亢肌病大脑活动变化及其分子机制研究罗佐杰PDK1调控破骨细胞在骨质疏松症发病中的分子机制研究宗少晖lnc-XLOC作为ceRNA参与miR-155调控脊柱结核椎间盘破坏过程中的作用机制研究詹新立可控释CGRP的硼硅酸盐生物活性支架促进骨缺损修复的作用机制研究李兵新型一氧化氮响应型纳米缓释微粒对骨性关节炎作用的研究靳攀陆真慧PHLPP1调节TNF信号通路在眼镜蛇毒神经生长因子（NGF）成软骨诱导中的作用及其机制山楂叶总黄酮调控微环境促进脊髓损伤后神经再生的分子机制研究曾高峰氧化应激介导的Nrf2/mTOR/NF-κB通路对氯胺酮相关性膀胱炎的影响和机制以及褪黑素的保护作用研究米华NF-κB/miR-375/CTGF信号介导咖啡因所致子代骨发育异常的血管发生机制罗瀚文HOXA10通过上调E-cadherin改善子宫内膜容受性的作用及机制研究杨一华极化的巨噬细胞通过NLRP3炎症小体调控肝纤维化的机制罗薇膜联蛋白A1在抗肝纤维化中的作用机制范俊华粪菌移植对滤泡辅助性T细胞和滤泡调节性T细胞调控在炎症性肠病中的作用研究吕小平FGF21调控ATF6/eIF2α/CHOP信号通路介导内质网应激肝损伤的分子机制研究郭超黄荣杰miR-155通过SHIP-1/p53MAPK/STAT3介导Th17细胞分化在盐敏感性高血压左室肥厚中的作曾晓聪环状RNAmmu_circ_0000021介导miR-143-3p靶向调控NPY 在心肌缺血再灌注微循环障碍的邱诗林IRF8/PD-L1通路在烟草暴露树突状细胞调控T淋巴细胞介导肺部炎症中的作用及机制研究烟草烟雾暴露下Tim-3调控CD4+T淋巴细胞介导COPD/肺气肿发生的作用及机制研究段敏超何志义中性粒细胞胞外陷阱（NETs）通过上调单核细胞PI3K-δ/Akt通路活性增加烟草烟雾暴露诱发的糖皮质激素抵抗?张景鸿基于ROS-NLRP3炎性小体/细胞焦亡途径研究活性维生素D3干预中性粒细胞性哮喘的作用基于单细胞测序及限时饲喂研究骨髓生物钟及概日节律王弘非神经性ACh在胆碱能M3受体调控的尿路上皮稳态增殖中的作用及机制研究易贤林接头连接蛋白在成年小鼠脑内神经发生中的作用机制研究刘媛媛HIV-1感染通过激活pDCs引起ILC2s损耗及机制研究叶力基于“络病”理论探讨壮骨方通过H型血管和成骨偶联干预糖尿病性骨质疏松的机制李双蕾参附注射液对连续灌注联合控制性通气保存供肺保护作用的机制研究莫安胜ciRS-7/miR-7/mTOR/p70S6K信号通路介导神经元自噬导致大鼠复苏后脑损伤的机制及参邓海霞天然牛磺酸对肝硬化门静脉高压抑制作用量子力学研究邓鑫秦刚基于IFITM1/Wnt/β-catenin信号通路调控骨肉瘤细胞恶性增殖探讨抑瘤汤抗骨肉瘤的机制复方扶芳藤合剂对小鼠单个核细胞亚群活化与分化的影响研究肖健基于IL-31—TRPV1轴的蛇床子素抗AD慢性瘙痒作用机制研究伍冠一基于GLUT4靶点的壮药“勾瓢更”抗Ⅱ型糖尿病药效物质基础及作用机制研究卢汝梅基于影响TLR4-NLRP3炎症小体信号通路对总丹参酮治疗肺炎作用机制研究高红伟基于G蛋白偶联受体相关通路的隐丹参酮抗血小板聚集机制研究刘振杰基于肝脏糖异生AMPK信号通路阐释三叶苷纠正2型糖尿病糖代谢紊乱的分子机制赵立春邱华白花香莲解毒颗粒调控Treg细胞Furin/TGFβ1正反馈环路促进慢乙肝HBeAg血清学转换的机制研究从LncBANCR介导ERK/mTOR调控自噬探讨推拿对SNL大鼠的镇痛效应机制卢栋明基于线粒体自噬探讨青光安对青光眼模型RGCs保护作用的机制研究姚小磊基于“微生物-肠-脑轴”探讨安神定志灵调控脑神经递质及免疫状态的机制研究孙继超基于“肺-肠轴”探讨壮医三十六荡坎蛤散治疗儿童哮喘缓解期的作用机制李伟伟王兵基于STAT3/TGF-β1/Smads信号通路调控EMT探讨大黄灵仙颗粒干预肝内胆管结石形成机制研究朱闽前列消汤干预自身免疫性前列腺炎IL-6-JAK2-STAT3信号通路调控CD4+T细胞凋亡及分化基于Erbin调控NF-κB信号通路研究安肠汤治疗溃疡性结炎的抗炎作用机制邓松华大黄煎剂作用于肠道菌群调节LPS/TLR4通路对MHE神经保护作用的机制研究付蕾长链非编码RNA对缺血性中风中经络不同证候的影响及功能机制研究古联健脾益气方通过IL-6/STAT3炎症信号通路抑制肝癌细胞Vimentin过度表达的机制研究卓少元陈延强基于“脾为之卫”理论从肠道微生态研究历节胶囊治疗胶原诱导性关节炎小鼠的作用机庞学丰基于Notch调控PI3K/Akt/mTOR信号通路调节T细胞糖代谢探讨寒痹康汤治疗类风湿关节炎麦门冬汤通过SDF-1/CXCR4轴对肺纤维化大鼠BMSCs迁移及归巢的影响刘锐黄连解毒汤调控SHR内质网应激通路的分子机制研究岳桂华陈峭基于钙离子振荡介导下的内质网应激-自噬反应探讨“以俞调枢”法对Cajal间质细胞的孟立锋内质网应激通路IRE1α-XBP1诱导腹膜间皮细胞自噬在EMT中的发生机制及健脾益气方的干预效应吕建林基于肝细胞lncRNA-miRNA-mRNA调控网络和“核-线粒体”信号传递探讨解毒化瘀颗粒拮基于自噬—NLRP3炎症体途径探讨芪七连胶囊保护SHR血管内皮损伤的效应机制研究罗远基于Rho/Rock信号通路探讨温肺降浊方靶向VaD大鼠突触损伤修复的分子机制胡跃强唐友明基于miR-584调控的内质网应激-细胞自噬途径探讨安胃汤干预胃黏膜肠上皮化生机制研基于神经血管单元探讨“三焦次第治疗”对脑缺血损伤大鼠Wnt/β-catenin信号通路的调控机制唐农李晓红ARHGEF-7在慢性应激肝郁脾虚证大鼠模型海马、胃组织RhoA/Rac1/CDC42/PAKs细胞骨架夏猛基于外泌体的功能特点以及胶质—神经细胞的相互作用关系探讨加味逍遥散治疗肝郁脾禽呼肠孤病毒σC蛋白抗肿瘤作用及其分子机制的研究黄莉基于代谢组和蛋白组学对大鼠射精机理脑神经物质基础的研究覃喜军真菌促进濒危药用植物青天葵种子萌发作用的研究谭小明广西特有濒危地方品种“瑶蚕”的生物学性状与进化起源研究张桂征纺锤体组装检查点介导胚胎染色体嵌合自我校正机制研究桂宝恒miR-483-5p作为乙肝病毒双突变(1762T,1764A)株感染者肝癌高危标记物的前瞻性研究方钟燎羟基羧酸催化蒎烯水合/乙酯化反应机理研究孟中磊炭疽病胁迫香蕉中磷脂酸代谢关键酶基因表达对其生成转化的调控机制研究孙健葡萄转录因子VlNAC60应答高温胁迫的功能及调控机制郭荣荣光调控广西毛葡萄酚类物质代谢机理研究成果SlWRKY1调控番茄抗南方根结线虫防卫反应的分子机制研究陆秀红葡萄霜霉菌无毒基因AvrRpv1参与的菌株毒力变异分子机制研究尹玲新型抑菌活性物质DMTS作用于胶孢炭疽菌麦角固醇生物合成的机制唐利华普通野生稻抗褐飞虱基因Bph33(t)的克隆及育种利用张月雄王泽平甘蔗抗梢腐病氮代谢和系统获得性抗性途径关键组分γ-谷氨酰转移酶基因SoGGT1克隆及功能鉴定基于 CRISPR-Cas9 技术的广西地方花生优良品种油酸含量改良研究贺梁琼小粒野生稻抗白背飞虱新基因WBPH9的克隆与抗虫机理分析郭嗣斌一个广谱持久抗稻瘟病基因pi-DY的克隆和功能分析高利军水稻东兰墨米种皮花青素合成关键基因BP3的图位克隆及功能研究杨行海伯克氏固氮菌GXS16与甘蔗根系高效联合固氮的生理和分子基础研究李长宁粉垄栽培木薯的肥料养分利用效率机制及其环境影响效应申章佑蔗叶与蔗叶生物炭还田下其C、N协同归还研究刘昔辉糖厂滤泥还田对广西红壤蔗区土壤有机碳库和温室气体排放的影响朱晓晖粉垄耕作对甘蔗土壤碳固定和温室气体排放的影响及机制黄金生霉变甘蔗病原菌节菱孢菌株产毒能力评价及产毒调节机理研究莫磊兴线粒体自噬NIX和Pink1信号交互作用对索拉非尼治疗肝癌的影响及干预研究张国染料木黄酮通过TTTY18/ miR-95/ SGK1环路干预结直肠癌细胞增殖凋亡的作秦俭Atg5介导树突状细胞自噬在烟草烟雾暴露下肺部炎症中的作用及机制的研究邝良鉴澳洲坚果种质资源的分子遗传多样性研究蔡元保基于miRNA和蛋白质组的桑寄生顽拗性种子脱水敏感性分子机制研究潘丽梅三倍体罗汉果种子败育分子机理研究韦荣昌草果种子休眠解除关键蛋白的挖掘及基因功能研究潘春柳南方石漠化区植被修复的微地形效应及其适应性管理策略研究吕仕洪东兴金花茶和同域分布的近缘广布种长尾毛蕊茶生殖生态学特性比较研究韦霄基于稳定同位素技术研究喀斯特季节性雨林代表性植物水分利用策略黄甫昭广义石山苣苔属（苦苣苔科）系统发育重建和分类学修订温放自然选择和遗传漂变对喀斯特特有铁甲秋海棠复合群物种分化的影响董莉娜中国冷水花属（荨麻科）分类修订和系统学研究韦毅刚苦苣苔科吊石苣苔属的分类学研究许为斌中国典型喀斯特天坑土壤微生物分布格局及其驱动机制蒲高忠RSK4靶向PI3K/AKT通路调控ACTN4在乳腺癌化疗耐药中的机制研究杨华伟应用时间系列代谢组学研究肝细胞肝癌患者手术前后血清代谢物变化及潜在标志物识别黎远冬缺氧条件下miR-210-5p调控SPON2介导肝癌TAM细胞M2型极化参与耐药的机制研究罗小玲用于肝癌早期诊断的多通道纸基微流控生物传感器的研究陈真诚西番莲酸性多糖改善2型糖尿病糖脂代谢紊乱的机制研究李霞基于miR-378b-p110α-PI3K/Akt通路甲基阿魏酸改善糖脂代谢抗ALD的机制研究李丽异槲皮苷介导miRNA-29调控靶基因改善胰岛素抵抗的作用机制黄桂红多靶点复合杯芳烃金纳米粒在阿尔茨海默症的诊断治疗作用及分子机制研究莫靖欣三株西沙软珊瑚共附生真菌抗肿瘤活性成分发现及其作用机制研究李云秋基于TLC和iTRAQ技术进行地蚕中抗金黄色葡萄球菌环肽的发现和其作用机制研究梁成钦李清初基于miR-21调控NF-κB信号通路介导肾缺血再灌注诱导的凋亡和炎症探讨桂枝去桂加茯苓白术汤的肾保护作用机制的研周燕园基于PPARγ/TGF-β1/Samds通路探讨鼠李柠檬素改善多囊卵巢综合征(PCOS)大鼠卵巢纤维化的分子机制麝香酮和适配体级联修饰多烯紫杉醇脑靶向递送系统抗胶质瘤作用及机制的研究齐娜抑癌基因CMTM4在肝细胞癌中的作用及机制研究谭盛葵PP2A介导MYC相关锌指蛋白在肝细胞恶性转化中的作用机制研究朱小年发育相关印记基因表观遗传学改变介导孕期PEs暴露与妊娠结局吕元明IL-33/ST2通路调控CD8+T和免疫抑制相关细胞的功能抗软组织肉瘤的作用和机制陈火英阻断VEGF/VEGFR-2信号通路逆转TAMs极化在乳腺癌T细胞免疫中的作用及机制研究何少忠lncRNA Loc554202通过调控染色质状态促进脊索瘤发生和进展的机制研究夏学巍张学梅m6A甲基转移酶METTL3调控TXNIP对结直肠癌生物学特征的影响和机制研究KDM5B促进胃癌侵袭、转移的作用及机制研究王振冉PAIP1-mTOR正反馈环路促进肝癌发生郑剑锋卵巢癌产生的IgG在维持卵巢癌干细胞生物学行为中的作用及其机制研究廖沁园表观遗传介导IRF7相关lncRNA FTX抑制非小细胞肺癌发展的作用及机制研究杜振宗长链非编码RNA XLOC_012366在表观遗传学介导的肺癌转移抑制中的机制研究宋剑非Nrf2基因修饰的脂肪间充质干细胞对硬皮病的治疗作用及机制研究罗婧莹闫建国帕金森病中CDK5磷酸化依赖的C9orf72泛素化降解介导alpha-synuclein清除障碍和神经贺亮米诺环素通过Notch信号通路调控小胶质细胞极化在脊髓缺血后延迟性瘫痪中作用的研究王勇基于HMGB1-TLR4介导的NF-κB信号通路探讨毛蕊异黄酮在脑缺血再灌注损伤中的保护机制不同人胰淀素聚集程度通过TLR4/MyD88介导调节性T细胞免疫机制张晓溪细胞焦亡在糖尿病肾病足细胞损伤中的机制研究周素娴姚军无抗冻剂超快速冷冻兔睾丸/附睾精子对ICSI胚胎及子代印记基因。

2020年第3期有机氟工业Organo - Fluorine Industry• 45•新型6 :2氟调聚磺酸生态毒理研究进展盛南1戴家银’郭勇2(1.中国科学院动物研究所，中国科学院动物生态与保护生物学重点实验室，北京100101;2.中国科学院上海有机化学研究所，中国科学院有机氟化学重点实验室，上海200032)摘要：随着全氟辛基磺酸（perfluorooctanesulfonic acid，PF0S)被限制生产和使用，6 :2氟调聚横酸（6 :2 fluorotelomer 811«'〇11心，6:2 1^八，(：6?,3(^(^2303出作为替代品被广泛用于电镀和氟聚物乳化过程。

目前针对6:2 1^^的研究仍处在起步阶段，综述了现有的相关报导，从环境分布、生物累积、生物转化和毒性效应4个方面对已有研究进行总结，并围绕目前存 在的问题及未来的研究方向进行了讨论和展望,以期为6 :2 FTSA的环境污染及安全性评估提供参考。

关键词:6:2氟调聚磺酸;环境行为;生物累积;生物转化;毒性效应〇刖目长链全氟及多氟烧基化合物(押-31111{)〇1>»{111011〇- alkyl substances，PFASs)是一类以烧基链为骨架，氢 原子被氟原子部分或全部取代的有机化合物。

PFASs 分子中含有高能C一F键，因此具有表面张力小、黏 度低以及疏水、疏油的特性，被广泛应用于建筑、消 防、化工、机械和航天等领域，具有不可或缺性[1]。

2015年，瑞典化学品管理局（Swedish Chemicals Agency，KEMI)在工业产品中鉴定出2 060种 PFASs,并由此推测目前已在全球投人使用的PFASs 已超过3 000种12]。

近年来的研究发现，PFASs具 有环境持久性、长距离迁移性和生物累积性[3<,可 引起实验动物肝脏毒性、内分泌干扰效应、免疫毒性 和生殖发育毒性等毒性效应[6_8]，且与多种人体健 康问题和疾病存在一定的关联性W[8M3]。

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第18卷第3期2023年6月V ol.18,No.3Jun.2023㊀㊀基金项目:国家重点研发项目子课题(2021YFC3201005);安徽省高校省级自然科学研究项目-创新团队(2022AH010019);国家自然科学基金资助项目(21677001).㊀㊀第一作者:张颖(1998 ),女,硕士研究生,研究方向为生态毒理学,E -mail:*******************㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:**************DOI:10.7524/AJE.1673-5897.20221026001张颖,张瑾,周娜娜,等.3种增塑剂对发光菌Q67联合毒性作用定量评估[J].生态毒理学报,2023,18(3):465-477Zhang Y ,Zhang J,Zhou N N,et al.Quantitative evaluation of combined toxicity interactions of three plasticizers on phtobacterium Q67[J].Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(3):465-477(in Chinese)3种增塑剂对发光菌Q67联合毒性作用定量评估张颖1,张瑾1,2,拾,周娜娜1,陈如荔1,申慧彦1,21.安徽建筑大学环境与能源工程学院,合肥2306012.安徽省水污染控制与废水资源化重点实验室,合肥230601收稿日期:2022-10-26㊀㊀录用日期:2022-12-24摘要:增塑剂(plasticizers,PLAs)是工业生产中广泛使用的高分子材料助剂,伴随着主产品的使用而进入环境中,很可能会对环境中的生物甚至人类的健康产生危害㊂因此,以3种常见的PLAs :双酚A(bisphenol A,BPA)㊁双酚S(bisphenol S,BPS)和三丁氧基乙基磷酸酯(tris(2-butoxyethyl)phosphate,TBEP)为研究对象,运用直接均分和均匀设计射线法分别设计二元和三元混合物体系,应用时间微板毒性分析方法系统测定3种污染物及其混合物体系对淡水发光菌青海弧菌(Vibrio qinghaiensis sp.-Q67,Q67)的毒性,应用浓度加和(concentration addition,CA)分析混合物的毒性相互作用,采用绝对残差(deviation from CA model,dCA)定量评估毒性相互作用强度,并结合热图法分析相互作用强度变化规律㊂采用电镜扫描分析Q67细胞形态,二苯胺显色法和考马斯亮蓝法测定Q67细胞的DNA 和可溶性蛋白质大分子的泄露情况来探究3种PLAs 及其混合物可能的毒性作用机理㊂结果表明,BPA ㊁BPS ㊁TBEP 对Q67均具有明显的急性毒性,且急性毒性均大于长期毒性;以半数效应浓度负对数值为毒性指标,3种PLAs 在同一暴露时间的毒性顺序:BPA>BPS>TBEP ;混合物体系BPA -BPS 呈现协同作用,而BPS -TBEP ㊁BPA -TBEP ㊁BPA -BPS -TBEP 呈现拮抗作用,且相互作用强度均受暴露时间和混合物浓度的影响;BPA -BPS -R4射线的协同作用强度最强,dCA 绝对值为0.411,BPA -BPS -TBEP -R1射线的拮抗作用最明显,dCA 绝对值为0.670;3种PLAs 及其混合物对Q67的作用主要通过破坏细胞的结构和形态,使其DNA 和可溶性蛋白质大量流失,造成细胞大量死亡㊂关键词:增塑剂;青海弧菌;拮抗作用;协同作用;时间依赖性,热图文章编号:1673-5897(2023)3-465-13㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:AQuantitative Evaluation of Combined Toxicity Interactions of Three Plasti-cizers on Phtobacterium Q67Zhang Ying 1,Zhang Jin 1,2,*,Zhou Nana 1,Chen Ruli 1,Shen Huiyan 1,21.College of Environment and Energy Engineering,Anhui Jianzhu University,Hefei 230601,China2.Key Laboratory of Water Pollution Control and Wastewater Resource of Anhui Province,Hefei 230601,ChinaReceived 26October 2022㊀㊀accepted 24December 2022Abstract :Plasticizers (PLAs)are widely used in industrial production as additives to polymeric materials,which enter the environment along with the main product and are likely to be hazardous to organisms in the environment and even to human health.Therefore,three common PLAs,bisphenol A (BPA),bisphenol S (BPS)and tris(2-bu -466㊀生态毒理学报第18卷toxyethyl)phosphate(TBEP),were selected as research objects and their binary and ternary mixtures were designed by direct equipartition and uniform design ray methods,respectively.The toxicity of the three contaminants and their mixture systems to a freshwater luminescent bacterium Vibrio qinghaiensis sp.-Q67(Q67)was systematically determined by the time-dependent microplate toxicity analysis(t-MTA).The concentration addition model(CA) was applied to analyze the toxic interactions of mixtures and the deviation from CA model(dCA)combined with the heatmap method used to analyze the intensity and variation of toxic interactions.To investigate the possible mechanisms of toxic effects of three PLAs and their mixtures,the cell morphology of Q67was analyzed by scan-ning electron microscope,and the leakage of DNA as well as soluble protein macromolecules from Q67cells were determined by diphenylamine colorimetry and the Coomassie Brilliant Blue methods,respectively.The results showed that BPA,BPS and TBEP were all of acute toxicity to Q67,and the acute toxicity was stronger than theirlong-term toxicity.By selecting the negative logarithm of median effect concentration(pEC50)as the toxicity index, the toxicity order of the three PLAs was:BPA>BPS>TBEP in the same exposure time.The mixture system BPA-BPS showed synergistic effects,while BPS-TBEP,BPA-TBEP and BPA-BPS-TBEP showed antagonistic effects whose interaction strength was influenced by exposure time and concentration.The strongest synergistic effect dis-played in BPA-BPS-R4ray with the maximum absolute value of dCA(0.411),whereas the strongest antagonistic effect showed in BPA-BPS-TBEP-R1ray with an absolute dCA value of0.670.The effects of the three PLAs and their mixtures on Q67were mainly through the destruction of the structure and morphology of the cells,causing massive loss of their DNA and soluble proteins,resulting in massive cell death.Keywords:plasticizer;Vibrio qinghaiensis sp.-Q67;antagonism;synergism;time-dependence;heatmap㊀㊀增塑剂(plasticizers,PLAs)是工业生产中广泛使用的高分子材料助剂,是一类重要的化工产品添加剂,作为助剂普遍应用于塑料制品㊁混凝土㊁泥灰㊁水泥㊁石膏㊁化妆品及清洗剂等材料中[1]㊂在长期使用与储存过程中,这些PLAs进入环境中,随环境介质发生迁移,不仅污染了环境,还有可能危害生物与人体健康㊂陈寒嫣[2]的研究表明磷酸三苯酯㊁三丁氧基乙基磷酸酯(tris(2-butoxyethyl)phosphate,TBEP)和磷酸三(1,3-二氯丙基)酯3种磷酸酯类PLAs即使在低浓度下,也会导致斑马鱼凋亡途径下游基因Cas3㊁Cas9的表达增加,从而诱发凋亡相关蛋白的凋亡途径㊂Xu等[3]研究发现邻苯二甲酸酯类增塑剂可能会使非洲爪蟾胚胎发育异常㊁死亡率升高㊂因此,PLAs作为新兴有机污染物所可能带来的潜在风险引起了广泛关注㊂双酚A(bisphenol A,BPA)㊁双酚S(bisphenol S, BPS)㊁TBEP和邻苯二甲酸二(2-乙基己)酯(bis(2-eth-ylhexyl)phthalate,DEHP)是生活中常用的PLAs,其中BPA是一种常见的环境雌激素,常作为化妆品㊁食品的包装材料以及其他产品的PLAs[4]㊂然而,有研究者发现BPA对斑马鱼的繁殖具有显著的抑制效应,长期接触BPA可对其繁殖性能及后代品质产生一定的影响[5],BPA还可引起甲状腺激素水平变化㊁肝脏机能变化㊁生育能力下降㊁流产等[6]㊂BPS 是目前最常用的BPA替代物,在塑料制品包装等领域得到了广泛的应用[7]㊂BPS和BPA的结构相似,已有研究显示BPS有类似BPA的作用,对动物的生殖㊁免疫㊁神经和代谢都有毒性[8-9]㊂BPS能影响幼鼠的取食和幼仔的早期发育[10-11]㊂刘倩等[12]的研究表明BPS暴露导致斑马鱼仔鱼视网膜受损,随着BPS浓度的增加,BPS对斑马鱼仔的毒性作用也将显著增加㊂TBEP作为常用有机磷酸酯类的PLAs 广泛添加于家具㊁清漆㊁塑料㊁纺织品和电子材料等工业产品中[13]㊂在中国北京(308.1ng㊃L-1)和加拿大安大略省(约10μg㊃L-1)的废水处理厂中的曾检测出较高浓度的TBEP[14-15]㊂TBEP广泛存在于环境中,然而TBEP对生物体有一定的内分泌干扰㊁神经毒性等,甚至含量很低时都会对环境和生态系统的稳定性有负面影响[16]㊂蔡凤森[17]进行的急性毒性试验以鲤鱼为指示性生物,探究TBEP毒性,TBEP的LC50为10.04mg㊃L-1㊂以上研究表明,系统开展PLAs的环境安全性研究具有重要的实际环境意义㊂目前关于PLAs的单一毒性研究已有报道[18],但有关PLAs对生物的联合毒性研究报道较少㊂因此,本文拟以3种PLAs(BPA㊁BPS和TBEP)为研究第3期张颖等:3种增塑剂对发光菌Q67联合毒性作用定量评估467㊀对象,应用直接均分射线法(direct equipartition ray, EquRay)和均匀设计射线法(uniform design ray,UD-Ray)分别设计3种PLAs的二元混合体系(BPA-BPS㊁BPS-TBEP㊁BPA-TBEP)和三元混合物体系(BPA-BPS-TBEP),每个混合体系分别设计5条不同浓度配比的射线(R1㊁R2㊁R3㊁R4㊁R5),以青海弧菌(Vibrio qinghaiensis sp.-Q67,Q67)为指示性生物,采用时间微板毒性分析法(time-dependent microplate toxicity analysis,t-MTA),测定不同暴露时间(0.25㊁2㊁4㊁8和12h)Q67的发光值,采用浓度加和(concentra-tion addition,CA)模型和绝对残差(deviation from CA model,dCA)模型进行混合物毒性相互作用的定性与定量分析,所得结果可为PLAs毒性风险评估提供一定的理论与数据参考㊂1㊀材料与方法(Materials and methods)1.1㊀材料与仪器实验所用菌种为青海弧菌Q67,从北京滨松光子技术股份有限公司采购,菌种的培养与保存参照文献[19]㊂3种增塑剂BPA㊁BPS㊁TBEP,纯度均>99%,均购于国药集团化学试剂有限公司,其基本理化性质列于表1㊂3种试剂的储备液均采用Milli-Q水配制,保存于4ħ冰箱中,备用㊂本实验过程中所用到主要实验仪器有Synery2 Multi-Mode酶标仪(美国伯腾仪器有限公司)㊁UV-2600i紫外可见分光光度计和AURIGA冷场发射扫描电子显微镜(德国ZEISS公司)等㊂1.2㊀微板毒性分析法3种PLAs及其混合物对Q67的毒性测定采用t-MTA法[20]㊂按预实验的稀释因子设置12个浓度梯度,配制好的各浓度100μL加入到标准的白色不透明微板中,最终在每个微孔中加入100μL处于对数生长期的Q67菌液使得每孔总体积为200μL,置于(22ʃ1)ħ培养箱中,在不同暴露时间(0.25㊁2㊁4㊁8和12h)取出,用酶标仪测定Q67的发光值数据㊂为减少实验误差,每个实验组均设置3个平行样减少误差,详细过程见文献[20]㊂表1㊀3种增塑剂的基本理化性质及Weibull函数的拟合参数Table1㊀Basic physicochemical properties and fitting parameters of the Weibull function for three plasticizers化合物Name分子式MolecularformulaCAS号CASnumber分子量Molecularweight储备液浓度/(mol㊃L-1)Stockconcentration/(mol㊃L-1)时间/hTime/hαβRMSE r EC50/(mol㊃L-1)pEC50双酚A(BPA)Bisphenol A(BPA)C15H16O280-05-7228.298.76E-050.257.59 1.550.0330.99287.36E-06 5.132 6.80 1.430.0420.98549.74E-06 5.014 6.21 1.390.0420.9796 1.86E-05 4.738 6.52 1.490.0590.9586 2.39E-05 4.62127.69 1.770.0410.9785 2.81E-05 4.55双酚S(BPS)Bisphenol S(BPS)C12H10O4S80-09-1250.27 4.79E-030.258.11 2.110.0410.98959.61E-05 4.0227.32 2.060.0350.9946 1.86E-04 3.7348.19 2.420.0460.9920 2.91E-04 3.5488.08 2.530.0500.9901 4.59E-04 3.34128.76 2.720.0770.9825 4.41E-04 3.36三丁氧基乙基磷酸酯(TBEH)Tris(2-butoxyethyl) phosphate(TBEH)C18H39O7P78-51-3398.47 5.00E-030.2510.50 3.150.0250.9979 3.55E-04 3.4528.99 2.820.0510.9902 4.81E-04 3.3248.67 2.680.0420.9933 4.25E-04 3.37810.46 3.310.0470.9925 5.36E-04 3.271211.83 3.820.0490.9920 6.41E-04 3.19注:RMSE表示均方根误差,r表示相关系数㊂Note:RMSE stands for root mean square error;r represents the correlation coefficient.468㊀生态毒理学报第18卷1.3㊀毒性机理探究为了探究3种PLAs及其混合物作用后Q67细胞发生的变化,采用电镜扫描分析Q67细胞形态,二苯胺显色法和考马斯亮蓝法测定Q67细胞的DNA和可溶性蛋白质大分子的泄露情况㊂受药物作用,菌细胞形态可能会发生改变㊂通过扫描电镜观察其微观机构,能够直观地观察到细胞在药物作用下的形态变化,具体操作过程见文献[21-22]㊂在菌细胞正常生长的情况下,蛋白质和DNA等大分子物质贯穿于整个细胞膜和细胞质中,DNA和蛋白质等大分子物质的外溢表明胞膜完整性遭到了破坏[23]㊂菌液中蛋白质溶出量和DNA溶出量的测定方法具体见参考文献[24-27]㊂1.4㊀混合物的实验设计为有效地考察混合物随浓度和时间的毒性变化规律,实验采用直接均分射线法(EquRay)[28]设计了3个二元混合物体系(BPA-BPS㊁BPA-TBEP㊁BPS-TBEP),应用均匀设计射线法(UD-Ray)[29]设计了一个三元混合体系(BPA-BPS-TBEP),每个混合物体系均安排了5条不同浓度比的射线(R1㊁R2㊁R3㊁R4㊁R5),各组分浓度比(pi )见表2㊂1.5㊀浓度-效应曲线拟合Weibull函数能较好地拟合在不同暴露时间点的S型-浓度-效应关系[30],表达式见式(1):Weibull函数㊀E=1-exp(-exp(α+βlog10(c)))(1)式中:E表示效应(0ɤEɤ1),c表示单一化合物或者混合物浓度,α和β是模型参数㊂1.6㊀混合物毒性相互作用分析1.6.1㊀浓度加和(CA)模型CA模型常用来评估污染间的联合毒性相互作用㊂实验观测数据与CA预测结果间的偏差表示混合物存在相互作用(协同或拮抗)[31-33]㊂CA模型公式如下:n i=1c i ECx,i=1(2)式中:c i表示混合物产生某一效应x时组分i的浓度,ECx,i表示混合物中第i个组分单独存在时产生效应(E)为x时所需要的浓度㊂1.6.2㊀绝对残差(dCA)模型dCA模型基于CA模型衍生而来,可用来定量评估混合物体系的联合毒性作用强弱,dCA>0㊁dCA <0和dCA=0时,分别表示拮抗作用㊁协同作用和加和作用,dCA的绝对值越小,毒性相互作用越弱,反之则越强[34]㊂dCA模型公式如式(3)所示:dCA=EOBS-E PRE,CA(3)式中:EPRE,CA为CA预测效应,EOBS为实验观测效应㊂2㊀结果与讨论(Results and discussion)2.1㊀3种PLAs对Q67的毒性3种PLAs(BPA㊁BPS㊁TBEP)对Q67的毒性数据均采用Weibull函数有效拟合(r>0.9,RMSE<0.1),且其拟合相关结果及Weibull函数所用的参数如表1所示,单个PLAs的拟合曲线(CRCs)绘于图1㊂由图1可知,3种PLAs对Q67的毒性呈现出良好的浓度-效应关系,随着BPA㊁BPS和TBEP浓度的增大,对Q67的毒性均增大,即3种PLAs对Q67具有浓度依赖毒性㊂此外,BPA㊁BPS和TBEP 对Q67具有明显的急性毒性,也具有时间依赖毒性,即随着暴露时间的延长,其对Q67的毒性呈现逐渐减小的趋势㊂BPA和BPS的毒性具有明显时间依赖性,随着暴露时间的延长,毒性明显减小,而TBEP的时间依赖毒性则不明显㊂不同时间点下,3种PLAs的毒性大小顺序不同,以12h为例,3种PLAs的毒性顺序为:BPA(pEC50=4.55)>BPS(pEC50 =3.36)>TBEP(pEC50=3.19)㊂表2㊀混合物体系中各物质组分构成及浓度比(pi)Table2㊀Composition and concentration ratio of each component in mixture system(pi)第3期张颖等:3种增塑剂对发光菌Q67联合毒性作用定量评估469㊀2.2㊀3种PLAs 二元混合体系对Q67的毒性为了更清晰地表述出污染物随时间和组分浓度比的改变,其毒性大小变化规律,采用pEC 50热图来表征,其颜色渐变程度可直接反映出污染物毒性大小变化情况,绘制结果见图2,随着绿色的加深,毒性逐渐增强,即pEC 50值增大㊂结合表2,由图2(a)可知,除12h 外在其他相同暴露时间点下,从R1到R5混合射线,绿色整体上呈现变浅的趋势,即BPA -BPS 混合物对Q67具有明显的浓度比依赖毒性㊂此外,在BPA -BPS 混合物体系中,R1㊁R2㊁R3混合射线在0.25~12h 暴露时间段和R4㊁R5混合射线在0.25~8h 暴露时间段,绿色随着实验时间的增长而逐渐变浅,说明这5条射线整体上对Q67时间依赖毒性较为明显㊂由图2(b)可知BPS -TBEP 二元混合物体系同条混合射线对Q67表征毒性大小的绿色无明显的渐变规律,说明BPS -TBEP 的毒性与暴露时间㊁浓度比无明显的相关性㊂由图2(c)可知BPA -TBEP 二元混合物表现具有明显的浓度比依赖毒性,即在pEC 50热图中表征混合物对Q67毒性大小的绿色从混合射线R1到R5呈现逐渐变浅的规律,表明BPA -TBEP 二元混合物对Q67的毒性随着TBEP 所占浓度比的增大而逐渐减弱㊂随着暴露时间的延长,只有R1㊁R2和R4混合射线绿色逐渐变浅,即说明R1㊁R2和R4混合射线对Q67具有明显的时间依赖毒性,而R3和R5则不具备此特性㊂2.3㊀3种PLAs 二元混合体系毒性相互作用定量评估结合CA 和dCA 这2种模型,采用dCA 热图定量分析混合物的毒性相互作用强度,其颜色渐变情况可以直接表现出污染物相互作用强度随浓度和时间因素的变化规律㊂陈如荔等[35]也表明,热图在表现相互作用强度上有较大优势㊂协同和拮抗作用分别用红色和蓝色表示,加和用白色表示㊂红色/蓝色越深,dCA 绝对值越大,即混合物毒性相互作用强度越大㊂BPA -BPS ㊁BPS -TBEP ㊁BPA -TBEP 二元混合物协同和拮抗作用强度绘制结果如图3所示㊂图1㊀3种增塑剂(PLAs )对Q67的浓度-效应图Fig.1㊀The concentration -response curves of three plasticizers (PLAs)onQ67图2㊀BPA-BPS ㊁BPS-TBEP 和BPA-TBEP 混合物体系各射线pEC 50热图Fig.2㊀The heatmap of pEC 50for each ray of BPA -BPS,BPS -TBEP and BPA -TBEP mixture system470㊀生态毒理学报第18卷图3㊀3组二元混合物体系各射线的dCA 热图Fig.3㊀The dCA heatmap for each ray of three binary mixture systems第3期张颖等:3种增塑剂对发光菌Q67联合毒性作用定量评估471㊀㊀㊀由图3(a)可知,在BPA-BPS混合物体系中,R1和R2混合射线在暴露时间4~12h段呈现协同作用,R3㊁R4和R5混合射线在暴露时间2~12h呈现协同作用,且表征协同作用的红色随着暴露时间的延长而加深㊂此外,BPA-BPS二元混合物的dCA值受暴露时间和混合物浓度的影响,当混合物浓度相同时,R1~R5混合射线的红色均随着实验时间的延长而逐渐加深,即dCA绝对值随着暴露时间的延长而缓慢增大,即暴露时间越长,协同作用强度越大㊂暴露时间相同时,R1~R5混合射线的红色随着混合物浓度的增加而先加深后变浅,dCA绝对值随着混合物浓度的增加而先增大后减小,即协同作用强度先增强后减弱㊂R4射线的协同作用强度最大,其混合物浓度为2.84E-4mol㊃L-1,在暴露时间为12h时,dCA绝对值的最大值为0.411㊂由图3(b)可知,BPS-TBEP二元混合物存在明显的拮抗作用,且R1㊁R2和R3混合射线随着暴露时间的延长,表征拮抗作用的蓝色逐渐变浅㊂BPS-TBEP混合物的dCA值也受暴露时间和混合物浓度的影响㊂在同一浓度作用下,随着暴露时间的延长, R1~R3混合射线蓝色均呈现逐渐变浅的变化趋势,这说明dCA值随着暴露时间的延长而缓慢减小,即拮抗作用强度随着暴露时间的延长而不断减弱;而R4和R5混合射线则很明显不呈现这种规律,蓝色无明显的渐变规律,即拮抗作用强度无明显的变化规律㊂同一暴露时间,5条混合射线蓝色均随着浓度的增大而先加深后变浅,说明dCA值随着浓度的增加而先增大后减小,即拮抗作用强度先增强后减弱㊂在BPS-TBEP混合物中,R1射线的拮抗作用强度最大,其混合物浓度为3.52E-4mol㊃L-1,在暴露时间为0.25h时,dCA绝对值的最大值为0.521㊂由图3(c)可知BPA-TBEP二元混合物R1和R2射线0.25~12h仅表现出加和作用,R3㊁R5射线在0.25~4h㊁8~12h和R4射线在0.25~12h则呈现拮抗作用㊂BPA-TBEP混合物的dCA值受暴露时间和混合物浓度的影响㊂在同一浓度作用下,随着暴露时间的延长,R1~R3混合射线蓝色变化不明显,而R4和R5均为由深到浅再变深的变化趋势,即拮抗作用强度随着暴露时间的延长出现先增强后减弱,最后再增强的变化规律㊂同一暴露时间点下, 5条混合射线蓝色均随着浓度的增大变浅,即拮抗作用强度逐渐减弱(dCA值逐渐减小)㊂BPA-TBEP 混合物中,R5射线在混合物体系浓度为7.78E-4mol㊃L-1㊁暴露时间为12h的拮抗作用强度最大,其dCA绝对值为0.404㊂除了暴露时间和污染物浓度外,组分浓度比对混合物毒性相互作用的影响也尤为重要㊂结合表2,从组分比看,随着组分中BPA的浓度占比降低,BPS的升高,图3(a)中R1~R5射线的红色部分整体呈现增强趋势,即协同作用强度逐渐增强㊂图3 (b)中R1~R5射线的蓝色部分整体呈现减弱趋势,即随着组分中BPS的浓度占比降低,TBEP的升高,拮抗作用强度逐渐减弱㊂在图3(c)中,R1~R5射线的蓝色部分整体呈现增强趋势,即随着组分中BPA 的降低,TBEP的升高,拮抗作用强度逐渐增强㊂2.4㊀3种PLAs三元混合体系对Q67的毒性BPA-BPS-TBEP三元混合物的混合射线的毒性大小变化规律可用pEC50热图表示,结果如图4所示㊂结合表2,由图4可知,5条混合射线(R1~R5)在0.25~12h对Q67的时间和浓度比依赖毒性整体上来说都较为明显㊂混合射线R1到R5,表征混合物对Q67毒性大小的绿色总体呈现逐渐变浅的规律,即随着组分浓度比的改变,毒性逐渐减弱㊂在0.25~12h时间段,R1~R3射线,绿色整体上逐渐变浅,pEC50值呈现逐渐减小的规律,即R1㊁R2和R3对Q67的毒性逐渐减弱㊂在0.25~8h时间段, R4和R5混合射线与前3条射线毒性变化规律类似,但在8~12h时间段不存在该特性㊂R1~R5的毒性整体上与暴露时间呈现负相关关系,即时间依赖毒性比较明显㊂R1~R5混合射线的绿色在相同时间点(0.25~8h)逐渐变浅,而8~12h相同时间点则无此特点,但R1~R5从整体上看呈现时间依赖毒性㊂图4㊀三元混合物体系各射线pEC50热图Fig.4㊀The heatmap of pEC50for each ray of theternary mixture system472㊀生态毒理学报第18卷2.5㊀3种PLAs 三元混合体系毒性相互作用定量评估㊀㊀dCA 热图的颜色渐变情况可以很明显地表述出拮抗作用强度随浓度和时间因素的变化规律[36]:随着蓝色越深,拮抗作用增强,即dCA 绝对值增大㊂由图5可知,BPA -BPS -TBEP 混合体系存在明显的拮抗作用㊂R1㊁R2和R3混合射线在0.25~12h ㊁R4和R5混合射线在8~12h 时间段都表现出了拮抗作用㊂同时还可得知,BPA -BPS -TBEP 三元混合物的dCA 值受暴露时间和混合物浓度的影响㊂浓度相同时,R1至R5混合射线中表征毒性大小的蓝色渐变情况与暴露时间呈正相关关系,这说明dCA 值随着暴露时间的延长而增大,即拮抗作用强度随着暴露时间的延长而不断增强㊂同一暴露时间点下,R1~R5混合射线蓝色均随着浓度的增大而先加深后变浅,这说明dCA 值随着混合物浓度的增加而先增大后减小,即拮抗作用强度随着混合物浓度图5㊀BPA-BPS-TBEP 混合物体系各射线的dCA 热图Fig.5㊀The dCA heatmap for each ray of BPA -BPS -TBEP mixture systems第3期张颖等:3种增塑剂对发光菌Q67联合毒性作用定量评估473㊀的增大而先增强后减弱㊂与其他混合射线相比,R1射线的拮抗作用强度最大,其混合物浓度为1.37E-3 mol㊃L-1,在暴露时间为12h时,dCA绝对值的最大值为0.670㊂2.6㊀3种PLAs混合物对Q67的毒性作用机理由于混合物的毒性作用机理往往由单个组分的毒性作用机理决定,并且相同组分构成的混合物毒性机理差异性不大[37],故仅选取了协同/拮抗作用强度较大的部分混合射线作用Q67,然后对其进行细胞形态前后的对比分析,采用二苯胺显色法和考马斯亮蓝法对协同/拮抗作用强度较大的部分混合射线进行Q67细胞DNA溶出量的测定和可溶性蛋白溶出量的测定㊂2.6.1㊀3种PLAs及其混合物对Q67的细胞结构的影响㊀㊀3种PLAs(BPA㊁BPS㊁TBEP)及其混合物代表射线(EC50-12h浓度)作用前后对Q67细胞形态的影响,采用电镜扫描进行观察㊂电镜扫描结果如图6所示,其中3个二元混合物体系选择BPA-BPS-R4和BPS-TBEP-R3,1个三元混合物体系选择了BPA-BPS-TBEP-R1作为代表,3种PLAs(BPA㊁BPS㊁TBEP)和它们的混合物代表射线对Q67细胞有一定的损伤㊂由空白对照组可知,正常Q67细胞形态为弧形杆状㊁外形丰满㊁表面平滑㊁边缘平坦㊁结构完整㊂但BPA㊁BPS和TBEP作用Q67菌体12h后,部分Q67菌体细胞弧杆状外形破裂,每个细胞结构间界限不清晰,细胞间出现粘连,有些菌体之间有粘连现象,细胞膜变得粗糙不平,这表明3种PLAs对Q67的细胞壁及细胞膜有影响,BPA和BPS作用Q67,使细胞拉长,出现粘连,但仍能维持正常形态㊂TBEP 导致Q67不能维持正常的形态,菌细胞发生凹陷㊁融合㊂3种PLAs的二元和三元混合物也对Q67的细胞有一定的损伤,Q67细胞在混合物代表射线作用后形态发生改变,开始出现菌体结构破裂,且细胞间出现不同程度的融合现象,细胞结构间界限不清晰㊂这表明3种PLAs(BPA㊁BPS和TBEP)的二元和三元混合物均可作用于Q67的细胞壁和细胞膜,破坏了它的菌体,导致它不能维持正常的细胞的形状㊂值得注意的是,BPS-TBEP和BPA-BPS-TBEP对Q67图6㊀3种PLAs及其混合物代表射线对Q67细胞形态的影响Fig.6㊀Effects of representative rays of three PLAs and their mixtures on the morphology of Q67cells474㊀生态毒理学报第18卷的破坏情况更倾向于单个物质TBEP,即菌细胞表面粗糙㊁凹陷,结构间界限不清㊂结合表2可知, TBEP在2条代表射线中组分占比较高,对菌的影响较大㊂2.6.2㊀3种PLAs及其混合物代表射线对Q67的DNA溶出量的影响㊀㊀3种PLAs(BPA㊁BPS和TBEP)及其混合物代表射线(BPA-BPS-R4㊁BPS-TBEP-R3和BPA-BPS-TBEP-R1)在EC50-12h浓度下对Q67细胞DNA溶出量的影响结果如图7所示㊂由图7可知,在3种PLAs(BPA㊁BPS和TBEP)及其混合物代表射线(BPA-BPS-R4㊁BPS-TBEP-R3和BPA-BPS-TBEP-R1)对Q67作用后,其DNA释放量与空白对照组相比有所提高,即Q67菌体细胞结构被3种PLAs及其混合物射线作用破坏后,细胞内大分子DNA外流,这说明了BPA㊁BPS和TBEP 及其混合物代表射线破坏了细胞膜的完整性,DNA 大分子的流失会破坏细胞的新陈代谢,使细胞丧失保护,从而导致菌体的死亡㊂在EC50-12h浓度下,培养液中DNA溶出量具有差别,但总体差别不明显,其中具有协同作用的BPA-BPS-R4混合射线的DNA溶出量最少,为46.62μg㊃mL-1㊂2.6.3㊀3种PLAs及其混合物代表射线对Q67的可溶性蛋白溶出量的影响㊀㊀采用考马斯亮蓝法测定3种PLAs(BPA㊁BPS 和TBEP)及其混合物代表射线及其混合物代表射线(BPA-BPS-R4㊁BPS-TBEP-R3和BPA-BPS-TBEP-R1)在EC50-12h浓度时作用于Q67前后的可溶性蛋白溶出量的变化,结果如图8所示㊂由图8可知,在BPA㊁BPS㊁TBEP㊁BPA-BPS-R4㊁BPS-TBEP-R3和BPA-BPS-TBEP-R1作用后,培养液中的可溶性蛋白溶出含量均有所提升,即Q67菌体细胞结构被药物作用破坏后,细胞内大分子可溶性蛋白外流㊂实验组中的Q67细胞DNA溶出量比空白对照组的可溶性蛋白溶出量多,这说明BPA㊁BPS和TBEP及其混合物代表射线破坏了细胞膜的完整性,大量的可溶性蛋白质流失,破坏了细胞的新陈代谢,使细胞丧失了保护作用,最后导致了菌体的死亡㊂在EC50-12h 浓度条件下,在药物作用后,DNA在培养液中的溶出量存在差异,其中具有协同作用BPA-BPS-R4的可溶性蛋白溶出含量最少,为25.41μg㊃mL-1,具有拮抗作用的BPA-BPS-TBEP-R1三元混合射线的可溶性蛋白溶出含量相对最多,为141.51μg㊃mL-1㊂图7㊀3种PLAs及其混合物代表射线对Q67的DNA溶出量的影响Fig.7㊀Effects of representative rays of three PLAs and their mixtures on DNA solubilisation fromQ67图8㊀3种PLAs及其混合物代表射线对Q67的可溶性蛋白溶出量的影响Fig.8㊀Effects of representative rays of three PLAs and their mixtures on the soluble proteolysis of Q67㊀㊀综上所述:(1)3种PLAs(BPA㊁BPS㊁TBEP)对Q67的毒性表现出较好的浓度-效应关系,对Q67具有浓度依赖毒性和时间依赖毒性,且3种PLAs的急性毒性均大于长期毒性,其中BPA和BPS的毒性具有明显时间依赖性,而TBEP的时间依赖毒性则不明显㊂3种PLAs在不同暴露时间的毒性大小不同,毒性大小顺序:BPA>BPS>TBEP㊂。

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第18卷第2期2023年4月V ol.18,No.2Apr.2023㊀㊀基金项目:国家自然科学基金面上项目(21876180);广东省基础与应用基础研究基金自然科学基金杰出青年项目(2022B1515020030);广州大学百人计划引进人才科研启动项目㊀㊀第一作者:张伟(1982 ),女,博士,副教授,研究方向为环境污染物的生态毒理学㊁环境过程-暴露机制-生态健康㊁去除技术原理与应用,E -mail:***************.cn㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:***************.cnDOI:10.7524/AJE.1673-5897.20220704001张伟,叶紫君,黄莉萍,等.砷甜菜碱的合成途径和代谢过程[J].生态毒理学报,2023,18(2):188-197Zhang W,Ye Z J,Huang L P,et al.Biosynthesis pathways and metabolic processes of arsenobetaine [J].Asian Journal of Ecotoxicology,2023,18(2):188-197(in Chinese)砷甜菜碱的合成途径和代谢过程张伟*,叶紫君,黄莉萍,赵芊瑜广州大学环境科学与工程学院,广州510006收稿日期:2022-07-04㊀㊀录用日期:2022-09-17摘要:砷污染问题引起全球高度关注,在中国㊁南亚和东南亚等地尤为严重㊂砷通过食物链传递对生态系统以及人类健康造成潜在危害㊂研究发现海洋鱼类具有独特的高砷甜菜碱(arsenobetaine,AsB)富集能力,人类通过摄食海洋鱼类会摄取大量的AsB ,可能造成潜在的健康危害㊂然而,AsB 在不同生物体内的生物转化(合成和降解)过程尚不清楚㊂本文对已知和推测的AsB 合成和降解过程进行综述,探究海洋生物体内高AsB 富集原因和可能的合成途径,哺乳动物体内的AsB 代谢过程,以及环境中微生物在AsB 降解过程中发挥的作用,加深我们对AsB 沿食物链传递和代谢过程的认识,为防治砷污染,降低砷污染对生态与人体健康的风险提供理论依据,促进砷生态毒理学的发展㊂关键词:砷甜菜碱;海洋生物;哺乳动物;生物转化;合成;降解文章编号:1673-5897(2023)2-188-10㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:ABiosynthesis Pathways and Metabolic Processes of ArsenobetaineZhang Wei *,Ye Zijun,Huang Liping,Zhao QianyuSchool of Environmental Science and Engineering,Guangzhou University,Guangzhou 510006,ChinaReceived 4July 2022㊀㊀accepted 17September 2022Abstract :Arsenic pollution,a serious environmental problem especially in China,South Asia and Southeast Asia,has aroused great concern worldwide.Arsenic is transmitted through the food chain and results in potential risk to the ecosystems and human health.It has been reported that marine fish have a unique enrichment capacity of high concentration of arsenobetaine (AsB),and human uptake a large amount of AsB through consumption of marine fish.However,the process of AsB biotransformation (biosynthesis and degradation)in different organisms is not clear.In this review,the biosynthetic and degradation processes of AsB were summarized to explore the reasons of high AsB enrichment in marine organisms and possible synthetic pathways.We also reviewed the potential AsB metabolic processes in mammals,and the involvement of microorganisms in AsB degradation was also included.All these information should provide a theoretical basis for understanding the transmission and metabolism process of AsB along the food chain,and promote the development of arsenic ecotoxicology.Better understand -第2期张伟等:砷甜菜碱的合成途径和代谢过程189㊀ing of the biosynthetic and metabolic process of AsB not only supply fundamental information in making strate-gies to prevent and control arsenic pollution,but also in reducing the risk of arsenic pollution to the ecology and human health.Keywords:arsenobetaine;marine organisms;mammal;biotransformation;synthesis;degradation㊀㊀重金属污染是目前世界范围内最严重的环境问题之一㊂多种重金属在美国有毒物质与疾病登记署和环境保护局颁布的危害物质名录(The Priority List of Hazardous Substances)上名列前茅,其中砷(arse-nic,As)位于环境污染物的首位(https://www.atsdr. /spl/index.html)㊂砷是一种天然存在的有毒类金属元素,是危害最严重的环境污染物之一,几乎存在于所有的环境介质中㊂美国毒物和疾病登记署(ATSDR)将其列为对人类健康危害最大的有毒物质,世界卫生组织(WHO)也将其列为引起全球重大公共卫生关注的化学物质㊂砷具有高毒性㊁致畸㊁致癌等危害㊂据报道,印度和孟加拉等国多处地区均发现与砷污染有关的大面积长期中毒事件,当地居民备受砷中毒疾病的折磨与煎熬[1-2]㊂2013年,据国际权威期刊报道,砷污染对约2000万中国人造成健康危害,对中国砷污染提出预警[3]㊂据世界卫生组织报道,目前全球至少有5000多万人口正面临着地方性砷中毒的威胁,提醒公众警惕砷中毒㊂砷污染是我国近海最严重的环境问题之一,各种来源的砷通过陆地径流㊁大气沉降㊁排污口和海洋倾废等途径汇入海洋㊂不同来源的砷汇入海洋生态系统,进入海洋食物链,传递至海洋鱼类,最终对人类健康构成严重威胁,导致砷对海洋生态系统的污染成为一个重要的国际性健康和环境问题[4]㊂海洋的承载力是有限的,当污染物排放超过海洋环境承载力时,就会引发海洋生态环境安全问题㊂砷污染影响着全球115个国家,已经在中国㊁南亚和东南亚(如巴基斯坦㊁孟加拉国㊁尼泊尔和印度)等地成为严重的环境问题,而这一区域刚好位于 南海-印度洋 ,它是中国 21世纪海上丝绸之路 重要战略区域㊂砷在海洋环境中存在着多种化学形态,已经鉴定了20多种不同的无机和有机形态砷,前者包括三价砷(arsenite,As(III))和五价砷(arsenate,As(Ⅴ)),后者包括一甲基砷酸(monomethylarsonic acid,MMA)㊁二甲基砷酸(dimethylarsinic acid,DMA)㊁砷甜菜碱(arsenobetaine,AsB)和砷胆碱(arsenocholine,AsC)等㊂无机砷具有剧毒,甲基砷(MMA和DMA)毒性减弱,而AsB和AsC毒性极小或无毒[5]㊂海产品是人类砷摄入的主要来源[6]㊂在西班牙的一项研究中,发现大多数人接触砷的途径是海产品,这种来源占砷暴露总量的96%[7]㊂AsB主要通过砷在鱼类㊁软体动物和甲壳类动物等海洋生物中代谢而形成[8-9]㊂AsB是海产品中砷的主要存在形式,通常占鱼类总砷的90%以上[10-12]㊂海产品中的总砷(AsB>90%)浓度可能比食品中的砷限值(50ng ∙g-1)高出200倍[13]㊂通过食用海产品,人类摄入大量的AsB,从而AsB进入人类食物链[14-17]㊂根据联合国粮食及农业组织(粮农组织)发布的‘世界渔业和水产养殖状况“,2016年鱼类总产量高于往年,人类直接消费了151亿t[18]㊂因此,通过消费鱼类, AsB是人类摄入的主要砷化合物㊂AsB被认为是海洋食物链中砷代谢的最终产物,是海洋生态系统中砷循环的终点,是人类摄入的主要砷形态,但对其生物合成和降解的机理认识仍然缺乏[6,19-27]㊂一方面,从解毒的角度,从低等微生物到海洋鱼类,许多酶在剧毒的无机砷向无毒的AsB生物转化中发挥重要作用㊂尽管已经提出了关于其生物合成途径的各种推测,海洋生物中AsB的合成途径尚不清楚[14,28]㊂另一方面,从食品安全的角度,AsB在哺乳动物和人体内是否会降解为毒性更强的无机砷,AsB对人体是否会产生毒性危害呢?这些问题仍不清楚㊂因此,海产品中AsB的合成途径以及人类从海产品中摄入AsB的降解过程仍有待挖掘,最终是否会导致生态和健康风险仍有待深入探究㊂本文对AsB在海产品和哺乳动物体内的生物转化(合成和降解)过程进行了综述,有助于了解AsB的潜在生态和健康风险,从而加深我们对AsB 在海产品和哺乳动物中的毒理循环的认识㊂剖析它们对认识AsB从海洋鱼类到哺乳动物的传递规律,特别在人类体内的代谢过程具有重要意义,而且为解决海产品砷污染以及造成的人类健康危害问题提供相应的理论支持,为最终采取防范措施,防控生态和人体砷暴露具有重要的现实指导意义㊂本综述为砷在毒理学和环境化学领域的进一步研究提供了有益的资源㊂190㊀生态毒理学报第18卷1㊀海洋生物体内高砷甜菜碱富集原因和可能的合成途径(Causes and possible synthetic pathways ofhigh arsenobetaine in marine organisms)1.1㊀海洋生物体内高砷甜菜碱富集原因(Causes of high arsenobetaine in marine organisms)海产品的质量状况一直为社会大众所关注㊂海洋鱼类体内总砷浓度(1~1000μg㊃g-1)比淡水鱼类总砷浓度(<1μg㊃g-1)高1~3个数量级,表现出较高的砷富集能力[8,28-29]㊂我们对我国沿海野生海洋鱼类砷含量进行了由北至南的大范围调查,评估了中国沿海野生鱼类砷富集状况,发现中国沿海部分海洋底栖鱼类短吻红舌鳎(Cynoglossus joyneri)和孔虾虎鱼(Trypauchen vagina)肌肉组织中砷含量严重超标,其中湛江的孔虾虎鱼肌肉组织中砷含量超过我国制定的安全标准30倍之多,长期摄食会对人体健康造成潜在危害,揭示中国沿海海洋鱼类体内存在高砷富集状况㊂海洋鱼类具有高砷富集现象,AsB 是海洋鱼类体内主要的砷存在形态,占总砷的90%以上[29-35]㊂AsB同样是海洋甲壳类和软体动物组织中主要的砷存在形态,占总砷的50%~95%[30]㊂AsB在其他海洋生物,比如多毛类㊁甲壳类㊁双壳类㊁腹足类㊁头足类,同样占总砷的大部分[36]㊂因此, AsB是海洋生物体内主要的存在形态㊂AsB在海洋生物体内高累积的原因到底是什么?首先,砷的生物累积随着盐度的增加而增加,研究发现贝类动物可以有效从海水中吸收AsB,而虾和鱼等高等动物只可从食物中(包括浮游植物等)积累AsB[37-38]㊂远洋鱼类中发现总砷随盐度增加的趋势,主要以AsB形式存在,表明盐度与AsB的吸收和累积密切相关[17,37]㊂阿拉伯湾西部的对虾(Penae-us semiisulcatus)和长须鱼(Arius thalassinus)中总砷和AsB含量相对较高,可能是由于海湾西部相对较高的盐度所致[39]㊂AsB的滞留取决于周围水的盐度,表明AsB可以部分替代重要的细胞渗透物甜菜碱(一种渗透压调节代谢物)[29,40]㊂我们发现海洋鱼类中AsB含量与环境盐度显著正相关,盐度可以控制砷的迁移,是关键控制因子,可能由于AsB是甜菜碱的结构类似物,可帮助海洋鱼类抵抗高盐海水的胁迫[29]㊂因此,盐度与海洋生物体内AsB的累积密切相关㊂虽然AsB含量与环境盐度有关系,而盐度调控鱼类砷生物转化机制研究匮乏㊂现有研究大多局限于对海洋和淡水鱼类砷不同形态与盐度野外调查现象的描述,而对规律与调控机制的认识尚不足㊂第二,通过研究砷沿着不同食物链传递过程,植食性食物链(大型海藻石莼(Ulva lactuca)㊁龙须菜(Gracilaria lemaneiformis)和粗江蓠(Gracilaria gigas) 黄斑篮子鱼(Siganus fuscescens))㊁肉食性食物链(沙蚕(Nereis succinea)㊁牡蛎(Saccostrea cucul-lata)和蛤(Asaphis violascens) 鲈鱼(Lateolabrax ja-ponicus))和海洋底栖食物链(沉积物 沙蚕(N.suc-cinea)和蛤(A.violascens) 诸氏鲻虾虎鱼(Mugil-ogobius chulae))㊂发现砷在沿这3类食物链传递过程中,食物中的无机砷较难被鱼体吸收,并且它们在鱼体(黄斑篮子鱼㊁鲈鱼和诸氏鲻虾虎鱼)组织中被生物转化成有机砷而不是直接累积;然而,食物中的AsB可以直接通过鱼体消化器官的上皮细胞膜,容易被鱼体吸收,而且是砷在鱼体组织中最终的存储形式㊂因此,不同形态砷沿食物链传递过程中,AsB 比无机砷更容易沿食物链传递和吸收,AsB的生物可利用性比无机砷高[33,41]㊂我们运用放射性同位素(73As)示踪技术和先进理论模型-药代动力学模型(PBPK),研究了砷在海洋鱼类体内的生物转运过程,通过PBPK模拟发现,交换率(k)(水到鳃)比k(水到肠道)低2倍,而且血液与鳃之间有最高的交换率,表明鳃不是主要的吸收器官㊂k(血液到肠道) (2.69d-1)是k(肠道到血液)(0.0039d-1)的700倍,表明AsB更容易分布于肠道,肠道是主要的吸收器官㊂同时,在暴露过程中,肠道中As(Ⅴ)(38.8%~ 45.1%)是主要形态,而在净化过程中AsB(81.7%~ 96.0%)成为主要形态,而且AsB在肠道中的含量比在肝脏中高,表明肠道是无机砷转化为AsB的主要代谢器官㊂肠道是砷的主要吸收和转化合成AsB 的器官㊂肠道吸收的不同形态砷,由血液转运至头㊁鳃㊁肝脏㊁肌肉各组织,最终主要以AsB形式贮存于靶器官肌肉组织中㊂因此,解析了肠道中合成的AsB和肌肉中存储的AsB是海洋鱼类高砷富集的主要原因[42]㊂罗非鱼(Oreochromis mossambicus)肠道菌能够促进鱼类砷代谢,分离并鉴定出影响鱼类砷代谢的关键肠道菌嗜麦芽寡养单胞菌(Stenotroph-omonas maltophilia SCSIOOM),其能合成AsB,而且betIBA调控S.maltophilia SCSIOOM体内AsB的合成[43]㊂同时,我们解析了AsB和As(Ⅴ)在海洋鱼类不同组织器官之间显著的生物转运差异,精确揭示了AsB的吸收㊁肝肠循环㊁存储和排泄过程,As(Ⅴ)表现出快速通过肠道膜㊁快速转运和排出的能力,而AsB通过肠道膜的能力较弱,被缓慢吸收并最终储第2期张伟等:砷甜菜碱的合成途径和代谢过程191㊀存在肌肉中[44]㊂综上所述,海洋生物,特别是海洋鱼类具有高AsB 富集能力,主要归因于AsB 的累积与环境盐度密切相关,食物中AsB 比无机砷更容易沿食物链传递和吸收,肠道是砷的主要吸收和转化合成AsB 的器官,AsB 穿过肠道膜的能力较弱,缓慢吸收,循环和存储在肌肉组织中,生物转化和转运对AsB 的富集起决定性作用㊂因此,无机砷在肠道中合成AsB ,食物中和合成的AsB 缓慢穿过肠道膜,缓慢循环以及高的肌肉存储速率是导致海洋鱼类高AsB 富集的主要原因(图1)㊂然而,AsB 的合成细节和途径尚未完全解析㊂图1㊀海洋鱼类高AsB 富集原因示意图注:AsB 表示砷甜菜碱,MMA 表示一甲基砷,DMA 表示二甲基砷㊂Fig.1㊀Schematic diagram of causes of high AsB concentrations in marine fishNote:AsB means arsenobetaine,MMA means monomethylarsonic acid,and DMA means dimethylarsinic acid.1.2㊀海洋生物体内砷甜菜碱可能的合成途径(Pos -sible synthesis pathways of arsenobetaine in marine or -ganisms)目前关于AsB 合成的过程主要依赖于潜在的生物合成前体和中间体的检测[45]㊂在不同生物体内,AsB 有几种可能的合成途径:(1)从二甲基化砷糖(DMAsSs)或三甲基化砷糖(TMAsSs)合成AsB ㊂据推测,DMAsSs 通过二甲基砷钠乙醇(DMAE)和二甲基砷钠乙酸(DMAA)转化为AsB ,而TMAsSs 直接转化为AsB [46]㊂(2)从AsC 转化为AsB ㊂沉积物中的微生物可以将AsC 转化为AsB[47],微生物枯草杆菌(B.subtilis )也可以将AsC 转化为AsB [1],AsC 是AsB的关键前体[48]㊂在水生动物中只发现微量的AsC [49-50],这表明它主要作为一种代谢中间物存在㊂AsC 是AsB 的代谢前体,接种标记AsC 后,在水生鱼类和贻贝中迅速吸收并转化为AsB [51-54]㊂(3)DMAE 和AsC 共同决定AsB 的合成㊂DMAE 作为中间体,甲基化生成AsC ,然后氧化生成AsB ㊂另外,DMAE 可能被氧化形成DMAA ,然后甲基化形成AsB [55]㊂此外,三甲基二氧砷基核糖苷可以定量转化为AsC ,而AsC 又可以定量转化为AsB [50,56]㊂(4)假设AsB 由DMA III ㊁2-氧酸㊁糖基酸和丙酮酸合成,从而形成DMAA 和AsB [14,46]㊂AsB 也由DMA III 合成,DMAA 的前体(可能由乙醛酸或丙酮酸合成),然后在海洋生物中甲基化形成AsB [57]㊂因此,通过已有研究发现,在水生生物体内AsB 最有可能来源于AsC ㊂微生物可能参与AsB 的合成㊂已有研究报道了海洋和土壤细菌对AsB 的代谢[56,58-60]㊂AsB 是由海洋沉积物中砷糖的微生物降解形成的,导致中间产物(如DMAE),随后可能被食腐动物和食草动物消耗,导致AsB 的合成[50,61]㊂细菌假单胞菌(Pseud -omonas sp.)在海洋生物中可将二甲基胂基醋酸盐转192㊀生态毒理学报第18卷化为AsB[62]㊂在生物体中发现的砷形态,二甲基砷核糖苷㊁硫砷核糖苷和三甲基砷核糖苷的降解也可能形成AsB[63-64]㊂因此,AsB合成的可能生物转化途径(图2),其中一些关键中间体㊁关键合成蛋白和基因尚未确定,微生物可能在AsB合成过程中发挥重要的作用,仍有待深入探究㊂图2㊀已知和推测的AsB合成和降解过程注:DMAE表示二甲基砷钠乙醇,AsC表示砷胆碱,DMAsSs表示二甲基化砷糖,TMAsSs表示三甲基化砷糖,DMAA表示二甲基砷钠乙酸,TMA表示四甲基砷,TMAO表示氧化三甲胺㊂Fig.2㊀Known and presumed processes of AsB synthesis and degradationNote:DMAE means dimethylarsinoylethanol,AsC means arsenocholine,DMAsSs means dimethylated arsenosugars,TMAsSs means trimethylated arsenosugars,DMAA means dimethylarsinoyl acetic acid,TMA means tetramethyl arsine,and TMAO means trimethylarsine oxide.2㊀哺乳动物体内的砷甜菜碱代谢过程(Arsenobe-taine metabolism processes in mammals)目前,海产品中的AsB在哺乳动物中的转化仍存在争议㊂关于人体中AsB的吸收和代谢仍了解尚少[51]㊂尽管无机砷在哺乳动物中的生物分布㊁生物转化和毒性已被广泛研究,但对AsB在哺乳动物中的生物转化知之甚少[65-66]㊂人体中几个关于砷代谢的基本假设如下㊂(1)哺乳动物体内没有形成AsB㊂在小鼠和人类体内几乎没有AsB的生成[66-67]㊂(2)哺乳动物体内形成AsB㊂在无AsB的饮食中,3/5的志愿者的尿液中检测到AsB,AsB浓度范围为0.2~12μg㊃L-1㊂AsB累积的可能原因有2个:组织中累积的AsB释放缓慢和从大米中摄取的无机砷形成AsB[68]㊂(3)哺乳动物体内吸收的AsB排泄得快和完全,且形态无改变㊂通过口服给药后,AsB通过胃肠道被有效地吸收,大部分通过尿液被排泄,而且形态没有发生变化[69-70]㊂经口摄入的AsB,在小鼠㊁大鼠和兔子的胃肠道中几乎完全吸收,但在体内不经代谢以尿液排出,98.5%AsB在2d内被排出体外[70]㊂小鼠㊁大鼠㊁兔子和仓鼠口服AsB后,在它们体内不代谢,但几乎完全从胃肠道吸收,并通过尿液不加改变地排出[71-72]㊂人体摄入AsB不会增加尿液中无机砷㊁MMA或DMA的浓度,支持AsB没有代谢㊁通过尿液排泄的假设[73]㊂志愿者只食用含有AsB的海产品,之后他们的排泄物(粪便和尿液)样本中只检测到AsB[68,74]㊂摄入的AsB快速通过尿液排泄出人体外,而且形态没有改变,从而减轻健康危害[15-17]㊂(4)在哺乳动物体内,AsB是否会降解为毒性更强的甲基砷和无机砷(图2)?也有研究报道少量的AsB发生了代谢[75-76]㊂每天给大鼠注射AsB,7个月后,AsB部分代谢为四甲基铵(TeMA)和氧化三甲胺(TMAO)[76]㊂AsB在有氧系统中与人类粪便一起共存7d后,降解为DMAA㊁DMA和TMAO[60]㊂AsB处理大鼠4d后,其尿液中检测到TeMA㊁AsB和TMAO,推测这一降解过程可能是由大鼠盲肠中的肠道微生物介导的[77]㊂我们最新的研究发现,小鼠长期暴露AsB,可导致AsB和As(Ⅴ)在小鼠组织中积累㊂AsB在吸收前被降解为As(Ⅴ),然后通过血液循环运输到其他组织㊂虽然吸收和生物转化受肠道微生物的调控,但aqp7㊁sam和as3mt基因以及去甲基化和甲基化过程在小鼠肠道组织中存在㊂基因㊁微生物组和代谢组学分析表明,葡萄球菌(Staph-ylococcus)和真杆菌(Blautia)㊁花生四烯酸㊁胆碱和鞘氨醇参与了小鼠肠道中AsB向As(Ⅴ)的降解㊂因此,长期食用AsB会增加小鼠体内As(Ⅴ)含量㊂通过食用海鱼长期摄入AsB可能对人类健康造成潜在危害[78]㊂因此,我们的研究结果引起了人们对人第2期张伟等:砷甜菜碱的合成途径和代谢过程193㊀类从海鱼中长期摄入砷的健康危害的高度关注㊂为水产品安全和人类健康风险提供了早期预警㊂未来的研究亟待探究消费海洋食物如何增加甲基砷和无机砷的负担㊂小鼠体内的微生物组成与人体内的差异很大,可能对AsB在人体内的降解过程有影响㊂因此,人体微生物在AsB生物降解过程中的作用有待进一步研究㊂需要注意的是,人类本身可能没有将AsB降解的能力,但是肠道微生物可能在这个过程中发挥着重要的作用㊂AsB可以在人类胃肠道中被微生物转化,DMA和TMAO是主要的降解产物[79]㊂在模拟胃肠消化过程中MMA和DMA的去甲基化被发现[80]㊂人类食用海产品中的AsB,可被微生物降解为毒性较高的砷形态[59]㊂人肠道中的微生物可以将AsB转化为各种甲基化的砷化合物,从而潜在地形成有毒的代谢产物㊂在与肠道菌群进行体外温育后,有氧肠道细菌在7d后将AsB分解为DMA㊁DMAA和TMAO,但降解的AsB在30d后会再次出现在样品中,研究表明人类肠道内存在能够降解AsB的微生物,然而,转化所需的时间比生理肠道的通过时间长得多,因此,在体内尚未观察到[60]㊂因此,哺乳动物和人类肠道中的微生物在AsB的降解过程中发挥了重要的作用㊂3㊀环境中微生物在砷甜菜碱降解过程中发挥的作用(The role of environmental microorganisms in the degradation of arsenobetaine)AsB的微生物转化不限于哺乳动物和人类微生物群㊂环境细菌在环境中AsB及其代谢产物的循环中起关键作用㊂在海洋生态系统中,已经进行了许多有关微生物AsB降解的研究[81]㊂Hanaoka等[82]研究AsB在海洋环境中的命运,来自海洋沉积物的微生物首先将AsB降解为TMAO,然后降解为MMA或As(Ⅴ)㊂在海洋环境中,微生物多样性是降解AsB的关键,好氧微生物促进了AsB向TMAO 的转化,而当消化系统中的微生物在液体培养物中培养时,AsB代谢为DMA和DMAA,而不是TMAO,表明存在不同的AsB降解途径,其取决于微生物群落的组成[59,83]㊂在混合了海洋沉积物的ZoBell介质中,发现了AsB降解为TMAO,并进一步转化为As(Ⅴ)的过程[84]㊂AsB也被降解为TMAO㊁DMA和As(Ⅴ)㊂DMAA被证明是AsB降解为DMA的中间产物[59,85]㊂AsB在数小时内转化,最初转化为二甲基胂基醋酸盐,然后转化为DMA[85]㊂在海洋微生物混合培养的作用下,已检测到AsB的生物转化[58]㊂基于不同中间体的形成,提出了不同降解AsB途径[85]㊂AsB降解为无机砷有2种途径(TMAO或DMAA)㊂不同的AsB降解途径取决于微生物群落的组成[27]㊂已从土壤和水中分离出去甲基化微生物[48,83,86-87]㊂因此,环境微生物在AsB的降解过程中同样发挥了重要作用㊂AsB的合成和降解是一个复杂的过程,而且受到众多基因的调控㊂从目前砷代谢相关基因的研究结果来看,As3MT㊁PNP㊁GSTM1㊁GSTT1和MTHFR 等基因的多态性都与砷代谢有一定的相关性㊂砷暴露后转录活性的改变导致基因表达的显著变化,表明基因对砷代谢存在不同的调控途径[88],比如As3MT基因对砷代谢存在不同调控方式[89]㊂因此,如果要彻底研究清楚AsB的合成和降解过程,利用当前和未来的宏基因组学㊁元转录组学㊁宏蛋白质组学和代谢组学方法破译微生物砷生物转化过程,将提高我们对微生物如何促进AsB生物转化过程的理解[90]㊂因此,关于AsB的生物转化过程,包括甲基化㊁AsB合成和降解AsB,应用基因组学方法,特别是相关酶和基因的鉴定,尚有很多亟待探索的未知过程㊂4㊀结语和展望(Conclusion and outlook)由于砷在环境中普遍存在及其与各种人类疾病的关系,引起了全球对其公共卫生影响的关注㊂本综述重点讨论了AsB的生物转化(合成和降解)过程,对于深入了解AsB在环境中的命运及评估其对人体健康的风险至关重要㊂同时,了解影响AsB转化过程是制定降低砷暴露健康风险的关键策略㊂该研究领域未来的研究趋势主要集中在以下几个方面:(1)需要深入研究AsB的环境命运和代谢途径,开发先进的分析技术,用以对各种砷化合物之间的转化进行全方面的研究;(2)确定微生物和非生物介导的AsB合成和降解过程;(3)AsB降解为无机砷会增加其毒性,更多研究应着眼于转化动力学,以更好地理解环境中的砷循环;(4)海洋生物可以将有毒的无机砷转化为无毒的AsB,但其合成途径尚不清楚;微生物在AsB的降解过程中发挥重要作用,但其分子转化机制尚不清楚,因此,利用基因组学方法深入研究AsB的合成和降解过程至关重要㊂因此,了解AsB在海洋生物㊁哺乳动物和人类组织中的合成和降解有助于控制其在环境中的迁移循环过程,对于防控砷污染和降低人类健康危害至194㊀生态毒理学报第18卷关重要㊂将砷的环境行为研究经验,用于预测环境如何改变砷㊂相应的,砷的生物转化如何改变环境?总之,AsB的来源㊁生物合成㊁降解和命运需要继续深入探究,才能更全面解析AsB的合成途径和代谢过程㊂参考文献(References):[1]㊀Acharyya S K,Chakraborty P,Lahiri S,et al.Arsenic poi-soning in the Ganges delta[J].Nature,1999,401(6753):545-547[2]㊀Stokstad 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生态毒理学研究的新进展生态毒理学是环境科学中的一个重要领域，主要研究环境污染对生态系统及生物体的影响，包括污染物的生物毒性、生物累积、生物转化和突变等内容。

自20世纪以来，随着环境问题的加重，生态毒理学一直受到广泛的关注和研究。

近年来，随着科技水平的提高，生态毒理学研究获得了新的进展，受到了越来越多的关注和重视。

一、基于OMICS技术的生态毒理学研究OMICS技术是一种高通量、高灵敏度的综合分析技术，包括基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学等。

基于OMICS技术的生态毒理学研究可以全面、深入地了解污染物与生物体彼此之间的相互作用机制。

例如，通过基因组学研究发现，某些污染物会影响鱼类的性腺发育和生殖能力，蛋白质组学研究发现，某些污染物可以影响肝脏和肾脏的代谢过程。

OMICS技术的发展为生态毒理学研究提供了更加全面和深入的研究方法。

二、新型污染物的生态毒理学研究近年来，一些新型污染物，如纳米材料、微塑料、微银等，不断出现并加剧了环境的污染程度。

这些新型污染物对生态系统和生物体的毒性和行为影响尚未完全了解。

因此，对这些新型污染物的生态毒理学研究具有重要意义。

例如，某些研究表明，微塑料会对生物体的生长、繁殖和行为产生负面影响。

新型污染物的生态毒理学研究，将有助于防止和减缓其对环境和生态系统的不良影响。

三、环境因素对污染物毒性的影响环境因素在影响污染物毒性方面起着至关重要的作用，例如，气候条件、水质状况、生境和季节变化等。

相同的污染物，在不同的环境条件下，其毒性表现不同。

因此，研究环境因素对污染物毒性的影响，对预测和评估环境污染的不同情况及其对生态系统和生物体的影响具有重要意义。

例如，针对富集的污染物物种和形态进行研究，有助于更好地预测和评估生态系统中的化学和生物效应，以及对人类健康的潜在健康风险。

四、多重暴露对生态毒理学的影响生物体可能同时暴露于多种污染物，如化学物质、重金属、放射性物质等，这些暴露可能具有协同作用，从而产生更大的毒性作用。

生态毒理学报Asian Journal of Ecotoxicology第18卷第5期2023年10月V ol.18,No.5Oct.2023㊀㊀基金项目:国家自然科学基金面上项目(51978001);安徽省高等学校科学研究重大项目(2023AH040122);安徽未来技术研究院企业合作项目(2023qyhz01);安徽省高校协同创新项目(GXXT -2021-057)㊀㊀第一作者:陶开燕(1996 ),女,硕士研究生,研究方向为生态毒理学,E -mail:*****************㊀㊀*通信作者(Corresponding author ),E -mail:****************㊀㊀#共同通信作者(Co -corresponding author ),E -mail:*******************.cnDOI:10.7524/AJE.1673-5897.20221121002陶开燕,徐晓平,杨晓凡,等.聚苯乙烯纳米塑料和溴酸盐对萼花臂尾轮虫的联合毒性作用[J].生态毒理学报,2023,18(5):236-245Tao K Y ,Xu X P,Yang X F,et bined toxicity of polystyrene nanoplastics and bromate to rotifer Brachionus calyciflorus [J].Asian Journal of Eco -toxicology,2023,18(5):236-245(in Chinese)聚苯乙烯纳米塑料和溴酸盐对萼花臂尾轮虫的联合毒性作用陶开燕1,徐晓平1,2,*,杨晓凡1,#,陈涛1,李彬彬1,李锦程11.安徽工程大学建筑工程学院,芜湖2410002.皖江流域退化生态系统的恢复与重建省部协同创新中心,芜湖241000收稿日期:2022-11-21㊀㊀录用日期:2023-02-19摘要:聚苯乙烯纳米塑料(polystyrene nanoplastics,PSNPs)和溴酸盐(BrO -3)广泛存在于水环境中,会对水生生物产生不利影响㊂为了探究PSNPs 和溴酸钠(NaBrO 3)共存条件下对轮虫的联合毒性效应,以萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflorus )为受试生物,探究了PSNPs (0.001㊁0.1mg ㊃L -1)㊁NaBrO 3(0.001㊁0.1mg ㊃L -1)以及它们的联合作用对轮虫生命表参数㊁种群增长㊁个体及卵大小的影响㊂PSNPs 和NaBrO 3单一及联合暴露显著影响萼花臂尾轮虫的生命表参数,其中,内禀增长率是最为灵敏的参数㊂0.1mg ㊃L -1PSNPs 和0.001㊁0.1mg ㊃L -1NaBrO 3联合暴露使轮虫个体显著减小,0.001mg ㊃L -1PSNPs 和0.001㊁0.1mg ㊃L -1NaBrO 3联合暴露使轮虫的卵体积显著增大㊂PSNPs 和NaBrO 3联合作用对轮虫种群增长的抑制产生协同效应,0.001㊁0.1mg ㊃L -1PSNPs 与0.001mg ㊃L -1NaBrO 3联合作用对轮虫个体的抑制表现出拮抗作用,0.001㊁0.1mg ㊃L -1NaBrO 3能够降低0.1mg ㊃L -1PSNPs 对轮虫净生殖率的抑制作用㊂结果表明,PSNPs 和NaBrO 3联合作用对轮虫产生了复杂的毒性效应,且联合毒性效应与PSNPs ㊁NaBrO 3的浓度配比有关㊂关键词:聚苯乙烯纳米塑料;溴酸盐;萼花臂尾轮虫;联合毒性作用;生命表参数;种群增长;个体及卵大小文章编号:1673-5897(2023)5-236-10㊀㊀中图分类号:X171.5㊀㊀文献标识码:ACombined Toxicity of Polystyrene Nanoplastics and Bromate to Rotifer Brachionus calyciflorusTao Kaiyan 1,Xu Xiaoping 1,2,*,Yang Xiaofan 1,#,Chen Tao 1,Li Binbin 1,Li Jincheng 11.College of Civil Engineering and Architecture,Anhui Polytechnic University,Wuhu 241000,China2.Collaborative Innovation Center of Recovery and Reconstruction of Degraded Ecosystem in Wanjiang City Belt,Wuhu 241000,ChinaReceived 21November 2022㊀㊀accepted 19February 2023Abstract :Polystyrene nanoplastics (PSNPs)and bromate (BrO -3)exist widely in aquatic environment,which canadversely affect aquatic organisms.In order to explore the combined toxic effects of PSNPs and sodium bromate (NaBrO 3)on rotifers,the effects of PSNPs (0.001,0.1mg ㊃L -1),NaBrO 3(0.001,0.1mg ㊃L -1)and their combined actions on life -table parameters,population growth,body and egg size of rotifers Brachionus calyciflorus were in -第5期陶开燕等:聚苯乙烯纳米塑料和溴酸盐对萼花臂尾轮虫的联合毒性作用237㊀vestigated in this study.The results showed that the single and combined exposure of PSNPs and NaBrO3signifi-cantly affected the life-table parameters of Brachionus calyciflorus,in which intrinsic rate of population increase was the most sensitive parameter.The combined exposure of0.1mg㊃L-1PSNPs and0.001,0.1mg㊃L-1NaBrO3 significantly reduced the size of the rotifer body,and the combined exposure of0.001mg㊃L-1PSNPs and0.001, 0.1mg㊃L-1NaBrO3significantly increased the egg size of the rotifers.PSNPs and NaBrO3had a synergistic effect on the inhibition of the population growth of rotifers.0.001,0.1mg㊃L-1PSNPs and0.001mg㊃L-1NaBrO3showed an antagonistic effect on the inhibition of the body size of rotifers.0.001,0.1mg㊃L-1NaBrO3could reduce the in-hibitory effect of0.1mg㊃L-1PSNPs on the net reproductive rate of rotifers.The results showed that the combina-tion of PSNPs and NaBrO3produced complex toxic effects on rotifers,and the combined toxic effects depend onthe concentration ratio of PSNPs and NaBrO3.Keywords:polystyrene nanoplastics;bromate;Brachionus calyciflorus;combined toxic effect;life-table parame-ters;population growth;body and egg size㊀㊀塑料制品由于便捷和经济得到了广泛的使用,然而塑料的大量使用㊁不当处置和难降解造成了大量的塑料垃圾[1]㊂研究表明,全球每年大约有4.80ˑ106~1.27ˑ107t塑料垃圾排入到水环境中[2]㊂这些进入到水体中的塑料在水解㊁光降解和生物分解等作用下会形成粒径更小的塑料微粒,其中,粒径ɤ100nm的塑料微粒被称为纳米塑料(nanoplastics, NPs)[3]㊂NPs在水体中分布广泛,种类繁多[4]且易被贻贝㊁蚤状溞㊁轮虫等水生生物误食或吸附于生物体表面[5-7],并通过食物链进行传递,进而影响水生生物的生理代谢㊁生长发育和繁殖等过程[8-10]㊂此外,NPs具有粒径小㊁比表面积大㊁疏水性强等特点,容易吸附和转移水环境中的其他物质形成复合污染物[11-12],造成不可预知的生态风险㊂聚苯乙烯(PS)是需求量最大的聚合物之一,在水环境中被广泛检出[13-14]㊂目前,已有的研究表明,PSNPs的长期暴露显著降低海水青鳉(Oryzias melastigma)的子代孵化率,造成胚胎发育畸形[15],PSNPs可以作为水杨酸乙基己酯(EHS)的载体,促进EHS在斑马鱼(Danio re-rio)体内的生物积累及其向后代的转移[16]㊂溴酸盐(BrO-3)经常在自然水体和处理水中被检出㊂美国地下水和地表水中溴酸盐浓度分别为2.6μg㊃L-1和204.6μg㊃L-1[17],英国受化学品生产厂长期泄露影响的地下水中溴酸盐浓度则达到了2mg㊃L-1[18],我国沈阳㊁上海两地地表水中溴酸盐浓度分别为6.96μg㊃L-1和33.2μg㊃L-1[19]㊂我国新修订的‘生活饮用水卫生标准“(GB5749 2022)[20]中规定了溴酸盐限值为10μg㊃L-1㊂溴酸盐在水中的溶解度和热稳定性高,会在水环境中长期存在并富集,对水中生物造成影响㊂研究发现,溴酸盐对大型溞(Daphnia magna)48h㊁96h的LC50为55.3mg㊃L-1和46.8mg㊃L-1,对萼花臂尾轮虫(Brachionus calyciflo-rus)24h的LC50为365.29mg㊃L-1,还抑制萼花臂尾轮虫的游泳速度,降低其净繁殖率㊁种群增长率,缩短寿命[21-22]㊂轮虫是淡水浮游动物群落的重要类群,在维持水生态系统正常的物质循环和能量流动中发挥着重要作用,其中,萼花臂尾轮虫具有分布广泛㊁世代周期短㊁易培养和对毒物敏感等特点,是开展水生态毒理学研究的模式生物[23]㊂鉴于环境中PSNPs与溴酸盐的污染现象日益严重,两者共存时的相互作用很可能对轮虫等重要浮游生物产生复杂的毒性效应,影响水生态系统生物群落结构的稳定㊂本研究以萼花臂尾轮虫为受试生物,从存活㊁繁殖㊁种群增长及形态变化等多个方面研究了低浓度PSNPs和NaBrO3对其的联合毒性效应,结果可为探明PSNPs与NaBrO3共存条件下对轮虫类浮游生物的影响提供参考,同时为水环境中复合污染物的生态风险评价和控制提供理论支持㊂1㊀材料与方法(Materials and methods)1.1㊀轮虫的采集与培养实验所用的萼花臂尾轮虫采自芜湖市汀棠湖㊂采样后,随机挑选非混交雌体置于实验室(25ʃ1)ħ的恒温光照培养箱中进行单克隆培养,光照强度为100lx,光暗比为14hʒ10h,在实验室的培养时间超过6个月㊂使用美国环境保护局(US EPA)配方[24]配制轮虫培养液,斜生四链藻(Tetradesmus obliquus)为轮虫唯一食物来源㊂斜生四链藻采用HB-4培养液培养,待其处于指数增长期时进行离心浓缩收集,238㊀生态毒理学报第18卷储存于4ħ下保存备用,投喂密度为2.0ˑ106cells㊃mL-1㊂实验开始前,将一定数量的轮虫置于(25ʃ1)ħ的恒温培养箱内进行预培养,此过程中,每12h悬浮一次沉淀于试管底部的藻类食物,每24h更换一次轮虫培养液并投喂新的食物,同时通过去除一部分轮虫个体使种群始终处于指数增长期,预培养时间为1周㊂1.2㊀测试液的配制实验所用的聚苯乙烯微球(粒径为0.05~0.1μm,2.5%m/V,CAS:9003-53-6)购自上海阿拉丁生化科技股份有限公司,原液在4ħ下避光保存㊂表征结果显示,该聚苯乙烯纳米塑料平均粒径为(83.34ʃ0.60)nm,Zeta电位为(26.20ʃ0.46)mV,且呈较为规则的球形,分散效果良好(图1)㊂NaBrO3(分析纯,99.8%)购自国药集团化学试剂有限公司㊂实验开始前,用蒸馏水配制100mg㊃L-1的PSNPs母液和1000mg㊃L-1的NaBrO3母液,并置于4ħ下保存㊂为了减小PSNPs的聚集作用,每次使用前进行30min的超声处理,并每24h配制一次测试液㊂结合溴酸盐的实际环境检测浓度及水质标准中规定的限值等因素,设置测试液的浓度为PSNPs:0.001mg㊃L-1(低浓度,L)㊁0.1mg㊃L-1(高浓度,H),NaBrO3:0.001mg㊃L-1(低浓度,L)㊁0.1mg㊃L-1(高浓度,H),参考杨越等[25]不同毒性比联合毒性实验的设计思路,设置了PSNPs-NaBrO3相同浓度比和不同浓度比的联合处理组,探究联合毒性作用中2种污染物的浓度配比对毒性效应的影响,测试液(PSNPs-NaBrO3)的组成及浓度见表1㊂1.3㊀生命表实验实验开始时,从完成预培养的轮虫中随机吸取若干个带卵的非混交雌体,置于和预培养条件相同的小玻璃杯中进行培养,并每隔2h把孵化出的轮虫幼体取出用于生命表实验㊂实验在24孔培养板中进行,每个孔中放入一只幼体(龄长<2h),并加入0.5mL测试液(含有2.0ˑ106cells㊃mL-1斜生四链藻),每个浓度设置3组重复,将培养板置于(25ʃ1)ħ㊁无光照的恒温培养箱中进行实验㊂实验开始12h后的48h内,每4h观察一次㊁48h之后每8h观察一次轮虫的存活及产卵情况,记录轮虫母体的存活情况及产生的幼体数量,并移出所产幼体㊂实验期间每24h更换一次测试液并投喂新的斜生四链藻,实验至母体全部死亡为止㊂基于实验记录,参照Xue等[26]的方法计算轮虫主要发育阶段的历时,包括幼年期(JP,指从幼体孵出到其产出第一枚卵所经历的时间);胚胎发育时间(ED,指从卵的产出到幼体孵出所经历的时间);生殖期(RP,从第一枚卵产出到最后一枚卵产出所经历的时间);生殖后期(PP,从轮虫产出最后一枚卵到其死亡所经历的时间)㊂生命表参数的定义和计算方法参照Ge等[27]的方法,特定年龄存活率(l x)为X年龄组开始时存活个体百分数;特定年龄繁殖率(m x)为X年龄组平均每个个体所产的后代数;生命期望(e)为各轮虫个体出生时能存活多久的估计值;净生殖率(R)为种群经过一个世代后的净增长率,R0=ðl x㊃m x;世代时间(T)为轮虫完成一个世代所经历的时间,T=ðl x㊃m x㊃xR;平均寿命(LS)为所有个体平均存活时间的观察值;内禀增长率(rm)为种群在特定实验条件下图1㊀聚苯乙烯纳米塑料(PSNPs)的形貌Fig.1㊀Morphology of polystyrene nanoplastics(PSNPs)表1㊀实验测试液PSNPs-NaBrO3的浓度组成Table1㊀The concentration composition of the experimental test solution PSNPs-NaBrO30-0L-0H-00-L0-H L-L L-H H-L H-H PSNPs/(mg㊃L-1)00.0010.1000.0010.0010.10.1 NaBrO3/(mg㊃L-1)0000.0010.10.0010.10.0010.1第5期陶开燕等:聚苯乙烯纳米塑料和溴酸盐对萼花臂尾轮虫的联合毒性作用239㊀的最大增长率,先根据方程rm =ln RT粗略计算,再根据方程ðnx=0e-r m㊃x l x㊃m x=1在Excel中试算求得种群内禀增长率的精确值㊂1.4㊀种群增长实验从预培养好的试管中随机取10只龄长<2h的轮虫幼体,将其置于5mL刻度试管中,加入5mL 测试液(含有2.0ˑ106cells㊃mL-1斜生四链藻),每个浓度设置3组重复,置于(25ʃ1)ħ㊁无光照的恒温培养箱中进行群体累积培养㊂实验期间,每12h悬浮一次沉积于试管底部的藻类食物,每24h更换一次测试液;72h后,分别计数存活轮虫的携卵雌体数㊁不携卵雌体数㊁混交雌体数和休眠卵数㊂轮虫种群增长率(r)的计算公式为:r=ln Nt-ln N0t,式中:N0㊁N t分别为实验开始时和实验进行到第t 天时的种群密度,t为时间,本研究中t=3㊂计算种群中携卵雌体数与不携卵雌体数的比值(OF/NOF),混交雌体数与总雌体数的比值(MR)㊂1.5㊀轮虫个体大小和卵体积实验从预培养好的烧杯中随机取30只龄长<2h的轮虫幼体,将其置于10mL刻度试管中,加入10mL 测试液(含有2.0ˑ106cells㊃mL-1斜生四链藻),每个浓度设置3组重复,置于(25ʃ1)ħ㊁无光照的恒温培养箱中进行培养㊂实验开始8h后每2h观察一次轮虫,待轮虫携带第一枚卵后取出,用5%甲醛固定㊂采用蔡康光学(XSP-8CC)显微装置和图像采集系统对固定的轮虫进行拍照并进行测量㊂根据萼花臂尾轮虫的形态学特征,本实验采用Fu等[28]和Ciros-Pérez 等[29]的方法,测量轮虫的背甲宽度㊁背甲长度㊁卵长径和卵短径4个形态参数,根据Sarma和Rao[30]的公式计算轮虫的个体大小(body size,BS)和卵体积(eggsize,ES):BS=a2ˑb5,ES=π(m2ˑn+n2ˑm)12,式中:a和b分别为背甲长度和背甲宽度,m和n分别为卵长径和卵短径㊂1.6㊀数据统计与分析采用Excel和SPSS21.0对数据进行处理与分析,Origin2019作图,数据以平均值ʃ标准差(MeanʃSD)表示㊂对所得数据进行正态分布检验和方差齐性检验,符合以上条件的数据,采用单因素方差分析和多重比较(LSD)检验各实验组与空白组之间的差异显著性㊂P<0.05表示差异显著㊂2㊀结果(Results)2.1㊀PSNPs和NaBrO3对萼花臂尾轮虫生命表参数的影响㊀㊀生存分析结果表明,H-H处理组的存活率显著高于对照组(P<0.05)㊂繁殖率在对照组和各实验组中没有呈现出显著变化(P>0.05),但L-L㊁L-H㊁H-L㊁H-H处理组均使繁殖率的最高点降低且延长了较高繁殖率的时间(图2)㊂发育阶段的结果表明,与对照组相比,0-H㊁L-L㊁H-L㊁H-H处理组的JP显著延长(P<0.05),H-L处理组的ED显著缩短;0-H㊁L-L㊁H-H处理组的RP 显著延长(P<0.05);0-H处理组的PP显著缩短(P <0.05)(图3)㊂单因素方差分析结果表明,与对照组相比,H-L㊁H-H处理组使e0㊁LS值显著延长(P<0.05),H-0处理组使R值显著降低,L-H处理组使R值显著升高(P<0.05),0-H㊁L-L㊁L-H㊁H-L和H-H处理组显著延长了T(P<0.05),H-0㊁0-L㊁0-H㊁L-L㊁H-L㊁H-H处理组显著降低了rm(P<0.05)(表2)㊂2.2㊀PSNPs和NaBrO3对萼花臂尾轮虫种群增长的影响㊀㊀与对照组相比,0-L㊁0-H㊁L-L㊁L-H㊁H-L和H-H 处理组的r显著降低,所有处理组对轮虫的OF/NOF 均不产生显著影响(图4),所有处理组下均无混交雌体和休眠卵产生㊂2.3㊀PSNPs和NaBrO3对萼花臂尾轮虫个体大小和卵体积的影响㊀㊀与对照组相比,L-0㊁H-0㊁0-L㊁0-H单独处理组及H-H联合处理组均使轮虫个体显著减小,L-L联合处理组使轮虫的卵体积显著增大(图5)㊂3㊀讨论(Discussion)生命表参数能够综合反映轮虫的存活和繁殖情况,且对特定毒物具有不同的敏感性[31]㊂通常情况下,繁殖参数对环境压力和化学药物的敏感性大于存活参数[32]㊂如Rao和Sarma[33]的研究表明,低浓度滴滴涕(DDT)的暴露会使轮虫的R0㊁r m显著降低,却不会影响轮虫的存活率㊂R0㊁r m对不同的毒物也表现出不同的敏感性,研究表明,R对龙须菜抽提液的敏感性大于rm,而对石油水溶性成分来说,rm的敏感性大于R[34-35]㊂本研究中,相对于其他指标而言,rm在多数处理组(6组)中受到毒物单一和联合作用的显著影响,特别是在低浓度组中也与对照组显示出显著差异,而R则只在少数处理组240㊀生态毒理学报第18卷(2组)中显示出差异性,表明PSNPs 和NaBrO 3的单一和联合暴露对r m 的影响更大,r m 比R 0和其他参数更加适合监测PSNPs 和NaBrO 3的单一和联合暴露对轮虫种群的毒性影响㊂图2㊀PSNPs-NaBrO 3暴露下萼花臂尾轮虫的存活率和繁殖率Fig.2㊀Age -specific survivorship and age -specific fecundity of B.calyciflorus exposed to PSNPs -NaBrO 3表2㊀PSNPs-NaBrO 3暴露对萼花臂尾轮虫生命表参数的影响Table 2㊀Effects of PSNPs -NaBrO 3exposure on life -table parameters of B.calyciflorusPSNPs -NaBrO 3处理组PSNPs -NaBrO 3treatmente 0/hR 0T /hr mLS/h 0-0181.56ʃ15.91bc 16.87ʃ2.00bcd 83.33ʃ4.83d 0.0414ʃ0.0012a 173.56ʃ15.90bc L -0180.44ʃ3.67bc 15.78ʃ0.46de 87.49ʃ1.77d 0.0383ʃ0.001ab 172.44ʃ3.67bc H -0175.33ʃ8.51c 14.17ʃ1.22e 86.28ʃ5.41d 0.0362ʃ0.001bc 167.33ʃ8.51c 0-L 190.67ʃ11.51abc 16.00ʃ1.16de 89.59ʃ2.29cd 0.0371ʃ0.002bc 182.67ʃ11.51abc 0-H 194.22ʃ11.67ab 18.90ʃ1.64ab 99.67ʃ0.27ab 0.0358ʃ0.002bc 186.22ʃ11.67ab L -L 198.67ʃ17.32ab 17.92ʃ1.29abcd 98.92ʃ6.06ab 0.0360ʃ0.002bc 185.26ʃ7.96ab L -H 196.48ʃ9.09ab 19.17ʃ0.58a 94.60ʃ4.08bc 0.0388ʃ0.001ab 188.48ʃ9.09ab H -L 203.18ʃ4.62a 16.41ʃ1.11cd 97.52ʃ4.78ab 0.0347ʃ0.003c 195.18ʃ4.62a H -H205.21ʃ5.26a18.48ʃ1.19abc103.06ʃ3.41a0.035ʃ0.002c197.21ʃ5.26a注:e 0㊁R 0㊁T ㊁r m 和LS 为生命期望㊁净生殖率㊁世代时间㊁内禀增长率和平均寿命;表中同一列数据右上角含相同字母表示差异不显著(P >0.05),不同表示差异显著(P <0.05)㊂Note:e 0,R 0,T ,r m and LS represent life expectancy at hatching,net reproductive rate,generation time,intrinsic rate of population increase and aver -age lifespan;the same superscript letters in the same rank represent no significant difference (P >0.05),while the different letters represent significant difference (P <0.05).第5期陶开燕等:聚苯乙烯纳米塑料和溴酸盐对萼花臂尾轮虫的联合毒性作用241㊀图3㊀PSNPs-NaBrO 3暴露对萼花臂尾轮虫发育阶段的影响注:(a)㊁(b)㊁(c)㊁(d)分别为胚胎发育期㊁幼年期㊁生殖期和生殖后期;a ㊁b ㊁c ㊁d 表示不同处理组间存在显著差异(P <0.05);表示平均值,表示中位数,误差棒表示ʃ标准差㊂Fig.3㊀Effects of PSNPs -NaBrO 3exposure on the developmental stages of B.calyciflorusNote:(a),(b),(c)and (d)represent embryonic development,juvenile period,reproductive period and post -reproductive period respectively;a,b,c and d represent significant difference between each group (P<0.05);show meanvalue,show median,error bars indicate ʃSD (n =3).㊀㊀生物种群的所有个体都承担着种群繁衍的任务,生物种群的增长或衰亡是所有个体存活和繁殖的累积表现㊂研究表明,面对外界环境和毒物的压力时,轮虫个体会在繁殖和生存之间进行能量的分配权衡[36]㊂如低温下轮虫寿命的延长要以牺牲繁殖为代价,且温度越低,轮虫所摄取的能量就会越倾向于用来维持自身生命活动[37]㊂而Xu 等[38]研究发现,较高浓度DDT 暴露下,轮虫选择降低繁殖率来实现对毒物的适应㊂本研究中,轮虫的JP 和T 值在多个处理组中被显著延长,而R 0值却没有受到显著影响(除了H -0㊁L -H 组外),表明轮虫受到胁迫后,在不降低后代个数的情况下,推迟了繁殖开始的时间,延长了后代产出的周期,降低了繁殖频次,这直接导致了r m 值的显著降低,轮虫个体对种群增长的贡献在减少,其结果必然增加轮虫种群衰亡的风险㊂然而,值得注意的是,在H -L 和H -H 组中,轮虫的LS 值被显著延长了,而这2组的r m 值是所有处理组中最低的2组,表明在耐受压力下,轮虫试图通过延长寿命增加可能的 繁殖机会 以弥补r m 的降低给种群带来的风险㊂在受污染环境中,生物体会把部分能量用于抵抗污染物的胁迫[39]㊂研究表明,轮虫对微囊藻毒素的抵抗是一个耗能过程,它可以通过减小形态学参数,节约生长能量以抵抗微囊藻毒素的胁迫[40]㊂本研究中,L -0㊁H -0㊁0-L ㊁0-H 和H -H 处理组的BS 均显著减小,表明轮虫减少了用于自身发育的能量来增加对PSNPs 和NaBrO 3单一及联合暴露的抵抗㊂同样,当能量有限时,轮虫的繁殖会在卵大小和产卵量之间进行权衡[41]㊂如食物短缺时,桡足类会产出体积较大但数量较少的卵,以保证后代有较高的存242㊀生态毒理学报第18卷活率,能更好地维持种群的延续[42]㊂本实验中,L -L处理组的r m 显著降低,ES 显著增大,表明轮虫采取降低产卵效率,提高卵质量的对策来增强对低浓度PSNPs 和NaBrO 3联合胁迫的抵抗㊂图4㊀PSNPs-NaBrO 3暴露对萼花臂尾轮虫种群增长的影响注:(a)PSNPs -NaBrO 3暴露3d 后萼花臂尾轮虫的种群增长率;(b)PSNPs -NaBrO 3暴露3d 后种群中携卵雌体数与不携卵雌体数的比值(OF/NOF);a ㊁b ㊁c ㊁d 表示不同处理组间存在显著差异(P <0.05)㊂Fig.4㊀Effects of PSNPs -NaBrO 3exposure on population growth rate of B.calyciflorusNote:(a)Population growth rate of B.calyciflorus after 3d exposure to PSNPs -NaBrO 3;(b)Ratio of the number of carrying females to the number of non -carrying females in the population after 3d exposure of PSNPs -NaBrO 3(OF/NOF);a,b,c and d representsignificant difference between each group (P<0.05).图5㊀PSNPs-NaBrO 3暴露对萼花臂尾轮虫个体及卵大小的影响注:(a)PSNPs -NaBrO 3暴露后萼花臂尾轮虫的个体大小;(b)PSNPs -NaBrO 3暴露后萼花臂尾轮虫的卵大小;a ㊁b ㊁c ㊁d 表示不同处理组间存在显著差异(P <0.05)㊂Fig.5㊀Effects of PSNPs -NaBrO 3exposure on body and egg size of B.calyciflorusNote:(a)Body size of B.calyciflorus after exposure to PSNPs -NaBrO 3;(b)Egg size of B.calyciflorus after exposure to PSNPs -NaBrO 3;a,b,c and d represent significant difference between each group (P <0.05).㊀㊀PSNPs 由于粒径小,比表面积大,容易吸附环境中与之共存的污染物,从而影响共存污染物对生物体的毒性效应,同时PSNPs 与污染物之间可能存在复杂的相互合作,造成难以预料的生物效应㊂通常混合物的生物效应大于单一组分的生物效应㊂有研究发现,高浓度微塑料和氟苯尼考联合作用对河蚬摄食率的抑制远大于两者单独作用的抑制之和[43];微塑料和文拉法辛共存时泥鳅体内超氧化物歧化酶(SOD)活性显著高于单独接触文拉法辛时的活性[44],表明微塑料和共存的污染物之间存在协同作第5期陶开燕等:聚苯乙烯纳米塑料和溴酸盐对萼花臂尾轮虫的联合毒性作用243㊀用㊂本研究中,PSNPs与NaBrO3共存时,所有联合处理组(L-L㊁L-H㊁H-L㊁H-H)的r均受到显著抑制,且抑制效果显著高于各自对应的单独处理组,表明PSNPs与NaBrO3对轮虫r的抑制存在协同作用㊂造成协同毒性效应的原因可能是:轮虫是一种滤食性动物,可以通过摄食使PSNPs进入体内,而PSNPs作为NaBrO3的载体,导致NaBrO3进入到轮虫体内的量增多,污染物的有效浓度增高,对轮虫r 的抑制效果增强㊂或者是PSNPs独特的化学性质改变了细胞膜的通透性,使得NaBrO3更容易进入膜内产生作用㊂然而,不是所有联合作用都会使毒性效应增强㊂研究表明,PS-MPs和罗红霉素(ROX)共同暴露对大型溞的氧化胁迫并没有比单一暴露强[45],阿伏苯宗(A VO)的存在能够减轻PSNPs对斑马鱼的毒性作用[46]㊂本实验中,H-L㊁H-H暴露对r m的抑制作用与H-0㊁0-L㊁0-H单独暴露时无显著差异,呈现出独立作用㊂而L-L㊁H-L暴露对BS的抑制作用与各自对应的单独暴露相比反而减弱了,呈现出拮抗作用㊂此外,NaBrO3的存在降低了0.1mg㊃L-1PSNPs对轮虫R的抑制作用㊂上述情况结合协同效应充分表明,不同浓度PSNPs和NaBrO3以及二者不同的组合方式,对轮虫产生的毒性效应不尽相同,体现出联合毒性效应的复杂性㊂通信作者简介:徐晓平(1979 ),男,博士,教授,主要研究方向为水污染监测与控制㊁生态毒理学㊂共同通信作者简介:杨晓凡(1978 ),男,博士,副教授,主要研究方向为工业污染控制与治理㊂参考文献(References):[1]㊀Xu S,Ma J,Ji R,et al.Microplastics in aquatic environ-ments:Occurrence,accumulation,and biological 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《基因组学与蛋白质组学》课程教学大纲学时：40学分：2.5理论学时：40实验学时：0面向专业：生物科学、生物技术课程代码：B7700005先开课程：生物化学、分子生物学课程性质：必修/选修执笔人：朱新产审定人：第一部分：理论教学部分一、课程的性质、目的和任务《基因组学与蛋白质组学》是随着生物化学、分子生物学、结构生物学、晶体学和计算机技术等的迅猛发展而诞生的，是融合了生物信息学、计算机辅助设计等多学科而发展起来的新兴研究领域。

是当今生命科学研究的热点与前沿领域。

由于基因组学与蛋白质组学学科的边缘性，所以本课程在介绍基因组学与蛋白质组学基本基本技术和原理的同时，兼顾学科发展动向，讲授基因组与蛋白组学中的热点和最新进展，旨在使学生了解现代基因组学与蛋白质组学理论的新进展并为相关学科提供知识和技术。

二、课程的目的与教学要求通过本课程的学习，使学生掌握基因组学与蛋白质组学的基本理论、基础知识、主要研究方法和技术以及生物信息学和现代生物技术在基因组学与蛋白质组学上的应用及典型研究实例，熟悉从事基因组学与蛋白质组学的重要方法和途径。

努力培养学生具有科学思维方式、启发学生科学思维能力和勇于探索，善于思考、分析问题的能力，激发学生的学习热情，并通过学习提高自学能力、独立思考能力以及科研实践能力，为将来从事蛋白质的研究奠定坚实的理论和实践基础。

三、教学内容与课时分配第一篇基因组学第一章绪论（1学时）第一节基因组学的研究对象与任务；第二节基因组学发展的历程；第三节基因组学的分子基础；第四节基因组学的应用前景。

本章重点：1. 基因组学的概念及主要任务；2. 基因组学的研究对象。

本章难点：1.基因组学的应用及发展趋势；2.基因组学与生物的遗传改良、人类健康及生物进化。

建议教学方法：课堂讲授和讨论思考题：查阅有关资料，了解基因组学的应用发展。

第二章人类基因组计划（1学时）第一节人类基因组计划的诞生；第二节人类基因组研究的竞赛；第三节人类基因组测序存在的缺口；第四节人类基因组中的非编码成分；第五节人类基因组的概观；第六节人类基因组多样性计划。

《生态毒理学报》第三届编辑委员会主编：王子健副主编：于云江王春霞王文雄尹大强冯新斌朱永官刘维屏李建中杨旭陈吕军陈景文陈春英吴丰昌张效伟周启星单正军赵宇亮陶澍高志贤袭著革编委：（以姓氏笔画为序）刁晓平于红霞马义兵马梅王玉秋王克坚王效科王菊英石利利吕永龙朱丽岩朱琳朱鲁生刘树深刘薇江敏汝少国任明忠许宜平麦碧姻应光国李发生杨中艺杨维东宋金明张勇张干陈吉平陈会明陈怡平陈家长陈彬罗义金小伟周东美周岩民周炳升周军英林玉锁孟紫强胡建英柯才煥查金苗祝凌燕骆永明秦占芬高愈希聂湘平贾永锋贾晓平徐顺清郭良宏殷浩文黄清辉黄益宗彭双清彭晓春董四君韩博平熊治廷蔡磊明戴家银编辑：侯一宁张慧生态棄理学板A sian Journal o f E co to x i(Shengtai Duli Xuebao) (双月刊，2006年3月创刊）2020年12月第15卷第6期(Bimonthly, Started in 2006) Vol.15 No. 6 Dec. 2020主管中国科学院主办中国科学院生态环境研宄中心主编王子健出版冰北京东黄城根北街16号由P政编码：100717编辑《生态毒理学报》编辑委员会北京2871信箱（北京市海淀区双清路18号）邮政编码：100085电话：************E-mail:***************.cn传真：************网址： 印刷装订北京科信印刷有限公司总发行处北京报刊发行局订购处全国各地邮局Superintended by Chinese Academy of SciencesSponsored by Research Center for Eco-EnvironmentalSciences, Chinese Academy of SciencesEditor-in-Chief Wang ZijianPublished by Science Press16 Donghuangchenggen North Street,Beijing 100717, ChinaEdited by the Editorial Board of A sian Journal ofEcotoxicology, P.O.Box 2871, Beijing 100085, ChinaTel: (86-010)62941072 E-mail:***************.cnFax: (86-010)62941072 Website: Printed by Beijing Kexin Printing Co., Ltd.Distributed by Beijing Bureau for Distribution ofNewspapers and JournalsDomestic issue by All Local Post Offices in ChinaISSN1673-5897 CN11-5470/X 国内邮发代号：2-303国内外公开发行国外发行代号：Q8073 定价：40.00元生态毒理学报第十五卷第六期二〇二〇年十二月辦夺4展杜部。

药物毒理基因组学研究
袁守军;丁林茂
【期刊名称】《中国药理学会通讯》
【年(卷),期】2001(018)003
【总页数】1页(P15)
【作者】袁守军;丁林茂
【作者单位】军事医学科学院放射医学研究所，北京100850;军事医学科学院放射医学研究所，北京100850
【正文语种】中文
【中图分类】R965.3
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5.毒理学研究的新领域——毒理基因组学 [J], 敖琳;曹佳
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