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应用PCR方法检测蜡样芽胞杆菌的研究_王振国

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本研究以 gyr B 基因作为检测蜡样芽胞杆菌 的目的基因 。 gyr B 基因编码 DNA 旋转酶的 B 亚 基 , DNA 旋转酶的 B 亚基(DNA 拓扑异构酶 Ⅱ)具 有高度的特异性[ 6] , 设计合适的 PCR 引物将能够 特异性地扩增出蜡样芽胞杆菌的 gyr B 基因 , 从 而实现与其他芽胞杆菌的区分鉴别 。
苏芸金芽胞杆菌 、蕈状芽胞杆菌(Bacillus mycoides)、产气荚膜梭状芽胞杆 菌(Bacillus clostridium perfringens)及蜡样芽胞杆菌的 16S rRNA 序列
具有高度的同源性(>99 %), 它们之间的序列差 异一般只有 0 ～ 9 个碱基[ 3] 。Ash 和 collins 等发 现蕈状芽胞杆菌与产生呕吐毒素的蜡样芽胞杆菌 的 23S rRNA 序列完全一致 。蜡样芽胞杆菌与苏 芸金芽胞杆菌 、蕈状芽胞杆菌及产气荚膜梭状芽 胞杆菌的 16S rRNA 和 23S rRNA 的间区序列的变 异也很 小 , 不 足以用来 设计 PCR 引物来 区分它 们[ 4-5] 。
DO I :10.13327/j .j jlau.2006.06.021 第 28 卷第 6 期
2006 年 12 月
吉 林 农 业 大 学 学 报 Journal of Jilin Agricultural University
Vol.28 No.6 December 2006
PCR 反应体系 :10 ×PCR 缓冲液 2.5 μL , dNTP 混 合 液 (dATP , dCTP , dGTP , dTTP 浓 度 均 为 10 mmol/ L)2 μL , Ex Taq DNA 聚合酶 (5 U/ μL) 0.2 μL , 模 板 DNA 2 μL , 引 物 (20 μmol/L )各 0.5 μL , ddH2O 补足体积至 25 μL 。PCR 扩增反应 条件 :94 ℃ 5 min →94 ℃ 30 s →56 ℃ 30 s →72 ℃ 1 min →72 ℃5 min , 35 个 循环 。 PCR 扩增反应产 物用 15 g/ L 的琼脂糖凝胶电泳检测 。
2 结果与分析
2.1 蜡样芽胞杆菌计数结果 蜡 样 芽 胞 杆 菌 的 初 始 浓 度 为 9.4 ×
106 cfu/mL 。 2.2 gyr B 基因引物的特异性分析结果
分别用蜡样芽胞杆菌 、绿脓假单孢菌 、苏芸金 芽胞杆菌 、蕈状芽胞杆菌 、产气荚膜梭状芽胞杆 菌 、嗜酸杆菌 、金黄芽胞杆菌 、土壤芽胞杆菌 、枯草 芽胞杆菌对引物进行特异性验证 。 结果表明 , 该 引物对蜡样芽胞杆菌具特异性 , 只有蜡样芽胞杆 菌能产生特异谱带 , 其扩增片段大小为 365 bp , 而 其他菌种均未出现特异谱带(图 1)。 同样 , 用吉 林出入境检验检疫局技术中心生物实验室分离鉴 定的菌种 B.cereus A1 和 B.cereus B1 进行 PCR 扩增也获得同样的结果 , 这表明该引物对蜡样芽 胞杆菌是特异的 。 2.3 蜡样芽胞杆菌检测的灵敏性分析结果
通过比较蜡样芽胞杆菌和相近种的 gyr B 基 因序列 , 用 primer5.0 软件自行设计扩增片段大小 为 365 bp 的特异性引物 :
gyrB-F :ATT GGT GAC ACC GAT CAA ACA ; gyrB-R:TCA TAC GTA TGG ATG TTA TTC 。 引物由大连宝生物工程有限公司合成 。 1.4 仪器设备 高速冷冻 离心机(SIGMA 3K30 , 德国 西格马 公司), PCR 扩 增 仪 (Biometra Tgradient-96 , 德 国 Biometra 公司), 恒温培养箱 , 凝胶成像系统 (Kodak EDAS290 , 美国 柯达 公司), 电泳 仪(SAVANT PS500A , 美国), 微量移液器(BIOHIT , 芬兰)等 。 1.5 蜡样芽胞杆菌的分离 试验样品蘑菇 、桂皮 、腐乳等购于当地市场 , 按照文献[ 7] 方法进行分离鉴定 。 1.6 蜡样芽胞杆菌的计数 将标准蜡样芽胞杆菌菌株接种于 TSAYE 培 养基 ,(30 ±1)℃培养过夜增菌 。在无菌条件下对
基金项目 :科技部资助项目(2003DIA6N002-002-03) 作者简介 :王振国(1965-), 男 , 博士 , 研究员 , 主要从事微生物检验研究 。 收稿日期 :2006-02-08 修回日期 :2006-05-26
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吉 林 农 业 大 学 学 报
2006 年
取 1.0 mL 计数过的不同浓度的蜡样芽胞杆 菌悬液 , 提取 DNA 进行 PCR 检测 , 从而确定其检 测敏 感性 。 结果 显示 , 利用 gyr B 基因 的 引物 gyr B-F 、gyr B-R 对蜡样芽胞杆菌进行检测 , 敏感
第 28 卷 第 6 期
王振国等 :应用 PCR 方法检测蜡样芽胞杆菌的研究
Identification of Bacillus cereus by Gyrase B gene with PCR Method
WANG Zhen-guo1 , LIU He-ping1 , LIU Jin-hua1 , CAI Yang1 , XIAO Cheng-rui1 , et al . (1.Center of Technology , Jilin Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau , Changchun 130062 , China ;2.Chinese Academy of Inspection and Quarantine , Beijing 100025 , China) Abstract :Bacillus cereus is an important species of bacillus genus.It has close relationship in taxonomy with other monly , it is difficult to differentiate it from other Bacillus species.In this study , a PCR method for rapid and specific detection of Bacillus cereus based on the gyr B gene sequences is developed.The result shows that amplification gyr B gene by the PCR method allows faster detection of Bacillus cereus , its detection limit is 9 cfu/mL.This method can be used in healthy food control and Bacillus cereus identification. Key words :Bacillus cereus ;gyr B gene ;PCR detection
TSBYE 培养基(胰蛋白胨大豆酵母提取物肉 汤)[ 8] ,TSAYE 培养基(胰蛋白胨大豆酵母提取物 琼脂),MYP 琼脂培养基(甘露醇卵黄多黏菌素培 养基)[ 7-8] 。Api 50CHB 生化鉴定试剂条购自法国 生物 梅里 埃。 细 菌基 因组 小量 提取 试 剂盒 (MiniBEST Bacterial Genomic DNA Extraction Kit , Ver.2.0)、Ex Taq DNA 聚 合酶 、4 种 dNTP , 10 × buffer 缓冲液等 购自大连宝生 物工程有限 公司 ; 10 ×Loading buffer 和 100 bp DNA Ladder 购自北京 天为时代有限公司 。 1.3 PCR 引物
应用 PCR 方法检测蜡样芽胞杆菌的研究
王振国1 , 刘和平1 , 刘金华1 , 蔡 阳1 , 肖成蕊1 , 罗雁菲1 , 徐宝梁2
(1.吉林出入境检验检疫局技术中心 , 长春 130062 ;2.中国检验检疫科学研究院 , 北京 100025)
摘 要 :采用 PCR 技术 , 通过扩增蜡 样芽胞 杆菌 的 gyr B 基因 来实 现对 蜡样芽 胞杆 菌的快 速检 测 。 结果 表 明 , 以 gyr B 为目的基因设计引物建立的 PCR 检测方法能特异 性地扩增 出蜡样芽胞 杆菌 , 且与其他 芽胞杆 菌 菌株均无交叉反应 , 其检测敏感性可达 9 cfu/ mL , 能够应用 于蜡样芽胞杆菌的鉴定 。 关键词 :蜡样芽胞杆菌 ;gyr B 基因 ;PCR 检测 中图分类号 :S852.616 文献标识码 :A 文章编号 :1000-5684(2006)06-0671-03
增菌液进行 10 倍倍比稀释 。 分别用灭菌的 1 mL 吸管吸取增菌液加入灭菌平皿 , 并做平行样 。然 后向 平 皿 中 倾注 刚 配 制 好 的 MYP 琼 脂 , 置 于 (30 ±1)℃培养过夜 , 进行平板计数 。 1.7 核酸提取
取 0.5 mL 增菌液于 1.5 mL 离心管中 , 再加 入 1 mL 灭菌 的 PBS(0.05 mol/L , pH7.4)混 合 , 9 000 r/min离心 2 min , 弃去上清 。 沉淀再用 PBS 溶液洗涤 3 次 , 然后悬浮于 1 mL 无菌水中 , 用于 DNA 的提取 。分别取 1 mL 上述不同稀释度的蜡 样芽胞杆菌培养液进行 DNA 的提取 , 细菌基因组 提取方法按试剂盒说明进行 。 1.8 PCR 扩增及反应条件
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性可达 到 9 cfu/mL , 其扩 增片 段大 小 为 365 bp (图 2)。
M.100 bp DNA Ladder;1.蜡样芽胞杆 菌 B.cereus ;2.绿 脓 假单 孢 菌 Pseudomonas aeruginosa ;3. 苏 芸 金 芽 胞 杆 菌 B.thuringiensis ;4.蕈状芽胞杆菌 B.mycoides ;5.产气荚 膜 梭状芽胞杆菌 B .clostridium perfringens ;6.嗜酸杆菌 B.acidophilus ;7.金 黄芽胞杆菌 B.saureus ;8.嗜土芽胞 杆菌 B. agrophilis ;9.枯草芽 菌株 蜡样芽胞杆 菌(ATCC27877), 苏芸金 芽胞杆

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实时荧光PCR技术快速检测食品中的蜡样芽孢杆菌

实时荧光PCR技术快速检测食品中的蜡样芽孢杆菌

实时荧光PCR技术快速检测食品中的蜡样芽孢杆菌
马琳琳;刘珍;马腾州;清江;田衍香;丁利
【期刊名称】《理化检验:化学分册》
【年(卷),期】2022(58)12
【摘要】以蜡样芽孢杆菌gyrB基因作为目标基因并设计特异性引物,用95℃预变性5 min、95℃变性15 s、50℃复性30 s、72℃延伸30 s,反应45个循环为反应程序,以蜡样芽孢杆菌DNA为模板进行荧光定量聚合酶链式反应(PCR),提出了食品中蜡样芽孢杆菌快速检测的方法,并对该方法特异性、蜡样芽孢杆菌DNA灵敏度以及活菌检出限进行验证。

结果表明,该引物在分段扩增中可以实现对蜡样芽孢杆菌的快速检测,而且重复性好;以3种非蜡样芽孢杆菌和蜡样芽孢杆菌进行特异性试验,非蜡样芽孢杆菌均没有扩增出曲线,仅蜡样芽孢杆菌扩增出特异性曲线;蜡样芽孢杆菌DNA按10倍稀释法进行灵敏度检测,可达0.01 mg·L^(-1),活菌检出限为8.9×10^(2)CFU·mL^(-1)。

【总页数】5页(P1461-1465)
【作者】马琳琳;刘珍;马腾州;清江;田衍香;丁利
【作者单位】长沙理工大学化学与食品工程学院;长沙和合医学检验实验室有限公司;上海海关工业品与原材料检测技术中心
【正文语种】中文
【中图分类】O657
【相关文献】
1.实时荧光环介导等温扩增技术检测牛乳中的蜡样芽孢杆菌
2.实时荧光定量PCR 法检测蜡样芽孢杆菌
3.应用实时荧光PCR检测致病性蜡样芽孢杆菌
4.餐饮食品中蜡样芽孢杆菌的实时荧光PCR检测方法研究
5.基于实时荧光PCR技术快速检测饲料中的蜡样芽孢杆菌
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荧光PCR检测蜡样芽孢杆菌及溶血素基因应用研究

荧光PCR检测蜡样芽孢杆菌及溶血素基因应用研究


食品等 。资料表 明， ．ｅ ｕ 是北欧最常见的食物 Ｂ ｃｒ ｓ ｅ 中毒致病菌之一 ， Ｊ在我 国 Ｂ ｃｒ ｓ ． ｅ ｕ 引起 的食物 中 ｅ 毒也很 常见 。腹泻型食物 中毒则为多种肠毒素 的 作用结果 ， 因此 ， 除了要监测食物 中蜡样芽孢杆菌 的 数量外 ， 了解其致病性也为极其重要。 目 前对该类蜡 样 芽孢 杆 菌 的检 测 主要采 用 传统 的培 养 、 化 检测 方 生 法 ， 要长 时 间的 选 择性 培养 增 菌 过 程 及 生 化 检测 ， 需 是 一项 费 时费力 的工 作 。为 了 降低 对 蜡 样 芽 孢 杆 菌 的检测 时 间 ， 研究 运 用 荧 光 定 量 Ｐ Ｒ， 立 快 速 检 本 Ｃ 建 测 的方 法 ， 同时 为 了监 测 致 病 蜡 样 芽孢 杆 菌 ， 我们 以 溶血 素 （ Ｂ ） 因和非 溶 血 素 （ Ｈ 基 因为 目的基 Ｈ Ｌ基 Ｎ Ｅ） 因进 行 荧 光 Ｐ Ｒ检 测 ， 现 对 致 病 蜡 样 芽孢 杆 菌 肠 Ｃ 实 毒素 的 监测 。
西ｔ ２ １ 年７月第３ ｉ学 ０ １ ３卷第７ 期
８８ ５
ห้องสมุดไป่ตู้
荧 光 Ｐ Ｒ检测蜡样 芽孢杆菌及溶血 素基 因应 用研究 Ｃ
王 红 唐振柱 黄 彦 孙 贵娟 李 秀桂
５０ ２ ） ３０ ８ （ 西壮族 自治 区疾 病 预防 控制 中心 ， 宁市 广 南
【 摘要 】 目的 建立实时荧光 Ｐ Ｒ检测蜡样 芽孢杆 菌的快速检测方法， Ｃ 为食品中蜡样芽孢杆菌污染的调 查及食物 中毒的快速准确定量检测提供手段 。同时检测 ３ ４株蜡样 芽孢杆菌溶血素基 因， 了解各种食品 中蜡样 芽孢杆 菌 溶血 素基 因分 布情 况 。方法 将 广 西各 地 食 品样 品 蜡 样 芽孢 杆 菌 分 离株 经 纯化 培 养 ， 取 Ｄ Ａ， 提 Ｎ 应 用 荧光 Ｐ Ｒ进 行确认 检 测 ， Ｃ 并检 测 ３ 疑 似蜡 样 芽孢 杆 菌溶 血 素 基 因及 非 溶 血 素基 因。结 果 除 １株 荧光 ４株
应用PCR方法检测蜡样芽胞杆菌的研究_王振国

应用PCR方法检测蜡样芽胞杆菌的研究_王振国


基金项目 :科技部资助项目(2003DIA6N002-002-03) 作者简介 :王振国(1965-), 男 , 博士 , 研究员 , 主要从事微生物检验研究 。 收稿日期 :2006-02-08 修回日期 :2006-05-26
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吉 林 农 业 大 学 学 报
2006 年
PCR 反应体系 :10 ×PCR 缓冲液 2.5 μL , dNTP 混 合 液 (dATP , dCTP , dGTP , dTTP 浓 度 均 为 10 mmol/ L)2 μL , Ex Taq DNA 聚合酶 (5 U/ μL) 0.2 μL , 模 板 DNA 2 μL , 引 物 (20 μmol/L )各 0.5 μL , ddH2O 补足体积至 25 μL 。PCR 扩增反应 条件 :94 ℃ 5 min →94 ℃ 30 s →56 ℃ 30 s →72 ℃ 1 min →72 ℃5 min , 35 个 循环 。 PCR 扩增反应产 物用 15 g/ L 的琼脂糖凝胶电泳检测 。
应用 PCR 方法检测蜡样芽胞杆菌的研究
王振国1 , 刘和平1 , 刘金华1 , 蔡 阳1 , 肖成蕊1 , 罗雁菲1 , 徐宝梁2
(1.吉林出入境检验检疫局技术中心 , 长春 130062 ;2.中国检验检疫科学研究院 , 北京 100025)
摘 要 :采用 PCR 技术 , 通过扩增蜡 样芽胞 杆菌 的 gyr B 基因 来实 现对 蜡样芽 胞杆 菌的快 速检 测 。 结果 表 明 , 以 gyr B 为目的基因设计引物建立的 PCR 检测方法能特异 性地扩增 出蜡样芽胞 杆菌 , 且与其他 芽胞杆 菌 菌株均无交叉反应 , 其检测敏感性可达 9 cfu/ mL , 能够应用 于蜡样芽胞杆菌的鉴定 。 关键词 :蜡样芽胞杆菌 ;gyr B 基因 ;PCR 检测 中图分类号 :S852.616 文献标识码 :A 文章编号 :1000-5684(2006)06-0671-03
餐饮食品中蜡样芽孢杆菌的实时荧光pcr检测方法研究

餐饮食品中蜡样芽孢杆菌的实时荧光pcr检测方法研究

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