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植物乳杆菌AY01 luxS基因表达模式与功能的研究

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植物乳杆菌AY01 luxS基因表达模式与功能的研究摘要：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）是发酵食品中常见的一种益生菌，群体感应（quorum sensing，Qs）是细菌进行信号交流的一种普遍方式，Lb.plantarum是否通过QS介导着其益生特性尚不清楚。

为了探索Lb.plantarum AY01是否通过AI-2/LuxS QS系统介导其对常见食源性病原菌的抑制，首先运用半定量PCR方法，研究了AY01在不同生长阶段luxS基因（合成Qs信号分子AI-2的关键基因）的表达情况；然后，利用牛津杯抑菌法研究了AY01对食源性病原菌肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）0157：H7、单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑菌效果。

研究发现：1）Lb.plantarum AY01 luxS基因在指数早期没有表达，指数中期出现表达，指数末期表达量明显增加，并于稳定中期达到最大值；2）AY01培养上清液对EHEC 0157：H7、L.monocytogenes、S.aureus均有抑茵效果，抑菌效果与；luxS基因表达趋势一致，即随AY01生长时间的增加抑菌呈现增加变化，到稳定期达到最大抑茵效果。

结果表明，Lb.plantarum AY01可能通过AI-2/LuxS QS系统介导其对常见食源性病原菌的抑制。

关键词：植物乳杆菌；luxS基因；表达；抑茵；群体感应乳杆菌（Lactobacillus）是乳酸菌（lactic acidbacteria，LAB）最大的一个属，因其形态呈杆状或球状以及能发酵碳水化合物（主要为葡萄糖）并产生大量乳酸而得名[1]。

作为乳杆菌一个主要的种，植物乳杆菌（Lb.plantarum）具有很多益生功能[2]，其中对病原菌的抑制功能得到了最广泛的研究。

2011年Moslehi-Jenabian等[3]将病原菌单核细胞增生李斯特菌（Listeria mono-cytogenes）与嗜酸乳杆菌（Lb.acidophilus）NCFM共培养，发现L.monocy-togenes生长明显受到影响，而Lb.acidophilusNCFM的生长几乎没有变化，说明Lb.acidophilusNCFM对病原菌L.monocytogenes具有很好的抑菌效果。

Kim等[4]研究发现，Lb. acidophilus A4除了能抑制L.monocyogenes的生长外，对肠出血性大肠杆菌（enterohemorrhagic Escherichia coli，EHEC）0157：H7同样具有抑制功能。

此外，本实验室之前的研究显示，Lb.plantarum，是一种具有广谱抑菌性的乳酸菌，不仅能抑制同种或近亲源关系的细菌，还能抑制大多数病原菌如E.coli、L.mono-cytogenes、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和鼠伤寒沙门氏菌（Sal-monella typhimurium）等菌株[5，6]。

群体感应（quorum sensing，QS）是细菌间通过化学信号分子进行信息传递的一种形式。

根据细菌信号分子种类的不同，QS系统可分为4种代表性的类型：1）革兰氏阳性（G+）细菌中的种内信号通讯使用的语言是寡肽；2）革兰氏阴性fG）细菌利用酰基高丝氨酸内酯作为信号分子实现种内细胞通讯；3）许多革兰氏阴性菌还可以使用扩散信号因子系统来调节多种生物学功能，例如毒力和生物膜形成等[7]；4）不同种的细菌之间也能进行交流，交流所用的语言是AI-2，这种信号分子存在于大多数细菌中，是许多细菌进行种内和种间交流的通用语言[8.9]。

AI-2在细菌体内由LuxS催化合成，LuxS基因广泛存在于G+和G-细菌中，且具有很高的保守性[10]。

代谢学研究发现，LuxS是细菌硫代谢中甲基循环中一个代谢酶，在代谢过程中AI-2作为副产物被合成，所以LuxS肩负着代谢和信号传递的双重功能[11，12]。

AI-2/LuxS QS系统介导乳酸菌发挥益生特性已有一定研究。

Moslehi-Jenabian 等[13]发现luxS基因可能参与某些Lactobacillus的酸适应过程，使细菌可以通过胃肠道而存活下来，并且在肠道微生态系统中可能在细菌与细菌之间的交流中具有一定作用。

Buck等[11]得出AI-2/LuxS QS系统在Lb.acidophilus粘附肠表皮，定植肠道过程中具有重要作用；Lebeer等[14]研究推测AI-2/LuxS QS系统可能与Lactobacillus在动物消化道中的适应性密切相关。

AI-2/LuxS QS系统与LAB抑菌的相关性研究很少。

据报道，一些G+细菌能够通过QS系统激活Lb. plantarum 特异信号途径，增加细菌素（一种具有抑菌作用的多肽）产量[15，16]。

Man等[17，18]不仅发现4种LAB（称为诱导LAB）与Lb. plan-tarum，KLDSl.0391共培养能使Lb.plantarumKLDSl.0391的细胞数增多，同样能显著提高Lb.plantarum KLDSl.0391产生细菌素的能力；以此为基础，通过进一步基因敲除和表达研究，他们建立了AI-2/LuxS QS系统介导Lb. plantarum KLDS-1.0391细菌素产生的模型：诱导LAB作为环境刺激被Lb. plantarum，KLDSl.0391识别，导致Lb.plantarum KLDSl.0391细胞数显著增加，造成LuxS合成的信号分子AI-2的大量积累，当该浓度达到一定阈值时，它能够开启下游调节元件的转录，调控细菌素编码基因合成细菌素。

在前期的研究中，我们从云南石林路南鲜羊奶中，分离鉴定了一株益生效果较好的乳杆菌。

16S rRNA基因测序鉴定其为Lb. plantarum，命名为AY01，并且利用焦磷酸测序策略测定了其全基因组序列[19]。

本研究以Lb. plantarum AY01为实验材料，首先制作它的生长曲线，然后选取跟细菌QS密切相关的指数早期（4.5h）、指数中期（12h）、指数晚期（18h）和稳定中期（27h）4个点为研究对象，应用半定量PCR方法和牛津杯抑菌法分别测定其在这4个点的luxS基因表达水平和对常见食源性病原菌EHEC 0157：H7、L monocytogenes、S.aureus的抑制情况，探讨Lb.plantarum AY01luxS基因表达与抑菌的相关性，为AI-2/LuxS QS系统介导乳杆菌的抑菌关系提供理论依据。

1材料与方法1.1菌株与培养基Lb.pLantarum AY01由本实验室从云南石林路南鲜羊奶中分离获得。

常见食源性病原菌E-HEC 0157：H7、L monocytogenes、S.aureus为本实验室保存菌株。

Lb.plantarum培养用MRS培养基（Oxoid，英国），E.coli用营养肉汤培养基（杭州天河微生物试剂有限公司，中国），L.monocytoge-nes、S.aureus用脑心浸液肉汤培养基（青岛高科园海博生物技术有限公司，中国）培养。

1.2生长曲线和产酸试验首先从-80℃冰箱中取出Lb.plantarumAY01种子液，然后按4‰（V/V）接种于MRS液体培养基中，30℃活化24h后，同样按4‰（V/V）接种到新鲜的MRS 液体培养基中，30℃静止培养。

隔1.5h取样（0～36h），利用分光光度计测定600nm波长处的吸光值（OD6oo），同时利用pH计测定各样品的pH值。

以培养时间为横坐标，OD6oo和pH为纵坐标，制作Lb.plantarum AY01生长曲线和产酸趋势图。

1.3生长阶段luxS基因表达分析1.3.1cDNA第一条链的合成依据Lb.plantarum AY01生长曲线，用RNAprep pure培养细胞/细菌总RNA 提取试剂盒（TIANGEN，中国）提取其指数早期（a点，培养4.5h）、指数中期（b点，培养12h）、指数晚期（c点，培养18h）和稳定中期（d点，培养27h）4点的菌体总RNA，利用琼脂糖凝胶电泳和吸光值测定法分别分析总RNA的完整性、纯度和浓度。

最后，以总RNA为模板，利用mRNA selective PCR kit （TAKARA，日本）进行逆转录反应，生成第一条链cDNA。

1.3.2引物设计选取看家基因16S rRNA基因作为相对半定量的内参照基因。

根据Lb.plantarum AY01全基因组序列[19]，利用引物设计软件Primer Premier5.0（PREMIER Biosoft International，美国），设计扩增16S rRNA和luxS基因的引物（表1）。

引物由上海生工生物有限公司合成。

1.3.3相对半定量测定luxS基因表达以逆转录得到的单链cDNA为模板，按照mlRNA selective PCR kit （TAKARA，日本）说明书进行相对半定量分析。

首先调节内参16S rRNA基因PCR时的cDNA加样量，通过较少循环数PCR扩增（85℃1 min；54.8℃1 min；72℃1min，25个循环），使PCR产物浓度在a、b、c、d 4点相同（利用GeneTools from SynGene软件（Syngene，英国）测定琼脂糖凝胶中PCR产物的浓度），记录a、b、c、d 4点相应的模板cDNA加样量。

然后，按照上一步相同的cDNA 加样数加量，同样利用较少循环数PCR扩增（90℃l min；52.5 ℃1 min；72℃lmin，25个循环）a、b、c、d 4点的luxS基因，最后通过琼脂糖凝胶电泳与GeneTools fromSynGene软件测定和分析luxS基因在a、b、c、d 4点相对表达量。

1.4抑菌试验Lb.plantarum AY01种子液经活化培养后，按40‰ （V/V）接种到新鲜的MRS液体培养基中，30℃静止培养至a、b、c、d 4点，9000r/min离心2min，收集上清液和菌体。

菌体用1mL无菌水悬浮后用细胞破碎仪破碎（程序为“在25℃下，按60%总功率，超声开3.5s，关9s”处理5min）。

上清液和菌体破碎液通过牛津杯法进行抑菌实验：首先，将灭菌好的2%水琼脂倒入直径为90mm的平板中，凝固后，将4个无菌牛津杯垂直放置在同一个平板上；然后，将含有约l.Oxl06cfu/mL食源性病原菌的培养基小心倒人上述平板中，凝固后，用灭菌镊子夹出牛津杯；最后，分别取250μL上清液和菌体破碎液加入到牛津杯孔中，30℃过夜培养后（约15h），用尺子按垂直测量的方法测定抑菌圈直径，取两次垂直测量值的平均数。

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干酪乳杆菌和植物乳杆菌耐药分子机制的研究.docx

干酪乳杆菌和植物乳杆菌耐药分子机制的研究.docx

干酪乳杆菌和植物乳杆菌耐药分子机制的研究一、综述干酪乳杆菌(Lactobacillus CaSei)和植物乳杆菌(Lactobacillus PlantarUm)是两种常见的益生菌,它们在食品、饮料和保健品等领域具有广泛的应用。

然而随着抗生素的广泛使用，这两种益生菌的耐药性问题口益严重。

因此研究干酪乳杆菌和植物乳杆菌耐药分f机制对于保护这些益生菌的生物活性以及指导其合理应用具布.重要意义。

近年来关于T酪乳杆菌和植物乳杆菌耐药性的研究表明，耐药性的形成可能涉及多种因素，如基因突变、环境因素、代谢途径等。

其中基因突变是最主要的原因之一，目前已经发现了许多与干酪乳杆菌和植物乳杆菌耐药相关的基因，这些基因在细菌的生长、繁殖、代谢等方面发挥着关健作用。

此外环境因素也时细菌的耐药性产生影响，如温度、PH值、盐度等环境因子都可能导致细菌的耐药性发生变化。

代谢途径是细菌抗药性的关键环节之一，许多研究表明，干酪乳杆菌和植物乳杆菌的耐药性与其代谢途径密切相关。

例如某些抗生素可以通过干扰细菌的代谢途径来抑制其生长，从而达到抗菌的目的。

因此了解干酪乳杆菌和植物乳杆菌的代谢途径对∙于研究其耐药性具行重要意义。

干酪乳杆菌和植物乳杆菌耐药分子机制的研究对于揭示这两种益生菌的抗药性机制具有重要价值。

未来的研究可以从以卜几个方面展开：进一步揭示与干酪乳杆菌和植物乳杆菌耐药相关的基因及其功能；探讨环境因了时细菌耐药性的影响机制；深入研究细菌代谢途径与抗药性的关系；开发新型抗菌药物或技术以应时细菌耐药性的挑战。

1.1研究背景和意义随着抗生素的广泛应用，耐药细菌已经成为全球公共卫生领域的一大挑战。

干酪乳杆菌(LaClobaCilIUS CaSei)和植物乳杆菌(Lactobacillus PlantarUm)是人类肠道中最常见的两种益生菌，具有调节肠道菌群平衡、促进消化吸收等多种生理功能。

然而近年来这两种益生菌的耐药性问题日益严重，导致其在临床应用中的疗效受到限制。

植物乳杆菌的生理功能和组学研究进展

植物乳杆菌的生理功能和组学研究进展

植物乳杆菌的生理功能和组学研究进展曹承旭，郭晶晶，乌日娜*，岳喜庆*（沈阳农业大学食品学院，辽宁 沈阳110866）摘 要：植物乳杆菌是乳酸杆菌的一种，在自然界中广泛存在，尤其是各类发酵食品中。

植物乳杆菌是人体肠道微生物的一员，由其生产的发酵食品的发酵作用与其对人体的益生作用使得植物乳杆菌逐渐成为基因组学、蛋白质组学、转录组学和代谢组学研究的模式微生物，阐明微生物环境适应性及发挥有益功能等的分子机制。

本文综述了近年来植物乳杆菌的生理功能和组学研究进展，以期为研究者提供借鉴。

关键词：植物乳杆菌；生理功能；基因组学；蛋白质组学；代谢组学；转录组学Advances in Understanding the Physiological Function and Omics of Lactobacillus plantarumCAO Chengxu, GUO Jingjing, WU Rina *, YUE Xiqing *(College of Food Science, Shenyang Agricultural University, Shenyang110866, China)Abstract: Lactobacillus plantarum , a member of the lactic acid bacteria family, is widely found in nature, especially in a variety of fermented foods. Since Lactobacillus plantarum is a member of the human intestinal microflora, the health benefits of fermented foods containing this bacterium have made it a model microorganism in genomic, proteomic, transcriptomic and metabonomic studies to clarify microbial environment adaptability and molecular mechanisms underlying probiotic health benefits. This review summarizes the recent advances in understanding the physiological functions and omics of Lactobacillus plantarum , with the aim of providing useful information for researchers.Keywords: Lactobacillus plantarum ; physiological functions; genomics; proteomics; metabolomics; transcriptomics DOI:10.15922/ki.jdst.2018.01.007中图分类号：TS252.1 文献标志码：A 文章编号：1671-5187（2018）01-0033-07引文格式：曹承旭, 郭晶晶, 乌日娜, 等. 植物乳杆菌的生理功能和组学研究进展[J]. 乳业科学与技术, 2018, 41(1): 33-39. DOI:10.15922/ki.jdst.2018.01.007. CAO Chengxu, GUO Jingjing, WU Rina, et al. Advances in understanding the physiological function and omics of L actobacillus plantarum [J]. Journal of Dairy Science and Technology, 2018, 41(1): 33-39. DOI:10.15922/ki.jdst.2018.01.007. 收稿日期：2017-10-10基金项目：国家自然科学基金面上项目（31471713）；辽宁省高等学校优秀人才支持计划项目（LR2015059）第一作者简介：曹承旭（1991—），女，博士，研究方向为食品生物技术。

植物乳杆菌素研究进展

植物乳杆菌素研究进展

［ !］
， 而细菌
素由基因编码， 可以通过基因工程的手段加以 改 造。其中有些作为发酵菌种的细菌素对动物无毒 副作用， 无抗原性。其抑菌范围广， 可以杀死或抑 制食物中一些腐烂菌和病原菌， 并有一定的热稳定 性， 延长了食品的保质期， 同时不破坏食品的风味
［ "］ 和组织状态 。
一般来说， 羊毛硫抗生素的抑菌谱要比非羊毛硫抗
$% !" &’()*+*,)*- 型 属此型的 K9,#-,<$0$# 抑菌机制仍不甚明了。目 前主要认为 K9,#-,<$0$# 等 +,#-$.$/-$0 型细菌素的靶 细胞是细胞膜， 在一定的膜电位的存在下， 吸附于 感受菌的细胞膜上。侵入膜内形成通透孔道， 可允 许小分子的亲水溶液通过， 导致离子从胞浆 中 流 细胞外水分子流入， 出， 细胞膜去极化及 GEA 泄漏，
［ C］ ［ 1］ 、 K9,#-,<$0$# I 等， 有的属于 类， 如 K9,#-,<$0$# L ［ *3 ］ ［ ** ］ 第二 类， 如 K9,#-,<$0$# BIC 、 K9,#-,<$0$# ? 等。
身免疫性。细菌素不同于青霉素等抗生素， 其为多 肽或蛋白质； 此外， 传统的多肽抗生素是由细胞多 酶复合体催化形成的， 不存在结构基因
［ &］ 。 防腐剂和饲料添加剂已成为研究热点
#" 植物乳杆菌素的抑菌范围
植物乳杆菌 （ "# $%&’(&)*+ ） 属于乳杆菌科中的 乳杆菌 属， 革 兰 氏 阳 性， 最 适 生 长 温 度 为 !3 2 !& 能在 *3 J 生长， "& J 不生长， 兼性厌氧， 在 K@ J， 值 "M & 2 1M & 生长， 最适 K@ 值 ’M & 左右。菌体呈短 杆状， 有时成对或成链状， 不产芽孢； 在 +N? 琼脂培 养基中呈灰白色、 不透明、 圆形、 光滑、 微小细密的
1株植物乳杆菌的抑菌作用及其生物学特性的研究

1株植物乳杆菌的抑菌作用及其生物学特性的研究

1株植物乳杆菌的抑菌作用及其生物学特性的研究洪伟;薛正莲【摘要】植物乳杆菌（ Lactobacillus plantarum）是乳酸杆菌中的一种，常存在于发酵的蔬菜和果汁中。

植物乳杆菌作为人体肠道的益生菌群，具有维持肠道菌群平衡、提高机体免疫力和促进营养物质吸收等多种作用。

研究从市售腌渍蔬菜中分离筛选获得一株植物乳杆菌，以9种菌作为指示菌，采用牛津杯琼脂扩散法检测筛选菌株的抑菌谱大小。

结果表明，该菌株能较强的抑制大肠杆菌、柠檬色葡萄球菌、藤黄微球菌和枯草芽孢杆菌等指示菌。

此外，研究了菌株对温度的稳定性，pH值的耐受性及其酶的敏感性等生物学特性，结果显示该株植物乳杆菌菌株具有良好的热稳定性，酸碱稳定性，并且对3种蛋白酶具有很好的敏感性。

这为今后深入研究与开发植物乳杆菌奠定了基础。

%Lactobacillus plantarum is one kind of lactobacillus often found in fermented vegtable and fruits .It can maintain the balance of bacteria in gastrointestinal tract , enhance body′s immune system and promote nutrient absorption .The L.plantarum was obtained from commercial pickles .The oxford cup agar well diffusion method was used to detect the diameter of bacteriostatic circle , and the re-sults showed that and L.plantarum could produce broad-spectrum antimicrobial substance , which had strongly restraining effect on Escherichia coli, Staphylococcus citreus, Micrococcus luteus and Bacillus subtilis.The biological characteristics of L.plantarum included the effects of heat, pH, enzymes.The results indicated that it had good heat stability and remained activity after incubation at a wide pH.It was sensitive to someproteases , such as proteinase K , pepsinum and trypsinase .This study would make a foundation for further developing the plant lactobacillus .【期刊名称】《生物学杂志》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】4页(P51-54)【关键词】植物乳杆菌;指示菌;抑菌性;生物学特性【作者】洪伟;薛正莲【作者单位】安徽工程大学生物与化学工程学院微生物发酵安徽省工程技术研究中心，芜湖241000; 芜湖职业技术学院生物工程学院，芜湖241003;安徽工程大学生物与化学工程学院微生物发酵安徽省工程技术研究中心，芜湖241000【正文语种】中文【中图分类】Q939.1;TS201.3乳酸菌是益生菌的重要内容，主要包括乳球菌、明串珠菌、片球菌、乳杆菌和肉食杆菌等[1]。