实验4测定细菌生长曲线

测定细菌生长曲线

一、 实验目的

1． 了解细菌生长曲线特征，测定细菌繁殖的代时；

2． 学习液体培养基的配制以及接种方法；

3． 反复练习无菌操作技术；

4． 了解不同细菌，不同接种方法在同一培养基上生长速度的不同；

5． 掌握利用细菌悬液混浊度间接测定细菌生长的方法；

二、 实验原理

将一定量的菌种接种在液体培养基内，在一定的条件下培养，可观察到细菌的生长繁殖有一定规律性，如以细菌活菌数的对数做纵坐标，以培养时间做横坐标，可绘成一条曲线，称为生长曲线。单细胞微生物发酵具有4个阶段，即调整期（迟滞期）、对数期（生长旺盛期）、平衡期（稳定期）、死亡期（衰亡期）。生长曲线可表示细菌从开始生长到死亡的的全过程动态。不同微生物有不同的生长曲线，同一种微生物在不同的培养条件下，其生长曲线也不一样。因此，测定微生物的生长曲线对于了解和掌握微生物的生长规律是很有帮助的。

测定微生物生长曲线的方法很多，有血细胞计数法，平板菌落计数法，称重法和比浊法。本实验才用比浊法，由于细胞悬液的浓度与混浊度成正比，因此，可以利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的菌液的浓度。将所测得的光密度值（OD600）与对应的培养时间做图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线。注意，由于光密度表示的是培养液中的总菌数，包括活菌和死菌，因此所测生长曲线的衰亡期不明显。

从生长曲线我们可以算出细胞每分裂一次所需要的时间，即代时，以G表示，其计算公式为：

G＝（t2-t1）/[(lgW1-lgW2)/lg2]

式中t2和t1为所取对数期两点的时间，W1和W2分别为对应时间测得的细胞含量或OD。

三、 实验器材

大肠杆菌，枯草杆菌菌液及平板；

培养基(100mL/250mL三角瓶×10瓶/大组):牛肉膏蛋白胨葡萄糖培养基；

取液器(5000ul, 1000ul 各一支)，无菌1000ul吸头若干，无菌5000ul吸头若干，比色皿10个及共用参比杯一个，培养箱3台，722s分光光度计；

1 实验内容：计数法测定细胞生长曲线

作者：王卫东 实验日期：2001.10.24-2001.10.31

实验目的：学习细胞计数的方法；熟悉测定生长曲线的基本原理、方法，了解其应用。

实验原理：一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮后贴壁，随后度过长短不一的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期，在达到饱和密度后，细胞停止生长，进入平顶期，然后退化衰老。典型的生长曲线即可分为潜伏期、指数生长期、平顶期及退化衰老四个部分，其中的三个不同生长时相（潜伏期、指数生长期和平顶期）是每个细胞系所共有的特征。通过测定生长曲线，不仅可以了解培养细胞生物学特性的基本参数、测定细胞绝对生长数、判断细胞活力，而且也可用于测定药物等外来因素对细胞生长的影响。本实验采用计数法测定细胞生长曲线，通过连续对细胞计数（通常为7d，一般应每次计数3瓶细胞取平均值），然后以存活细胞数对培养时间作图，即得该种细胞的生长曲线。

仪器、材料和试剂：

1、 仪器：CO2 培养箱、超净工作台、倒置显微镜、血球计数板

2、 材料：培养瓶、试管、吸管、移液管、废液缸、HeLa细胞、盖玻片、酒精 灯

3、 试剂：培养基（含小牛血清）、0.25%胰蛋白酶

实验步骤：

1、 细胞悬液制备：取生长良好接近汇合的HeLa细胞，胰酶消化，再加新鲜培 2 养基制成细胞悬液后计数。

2、 接种：根据细胞计数结果，按每瓶5×104个接种细胞（加3mL培养基，实际接种每瓶5.9×104个）作传代培养（理论上应该每人接种21瓶细胞，每天取3瓶计数，但实际每人只接种7瓶）。

3、 计数：24h后开始作细胞计数，以后每隔24h计数一次，连续计数7天。

4、 绘图：根据计数结果，绘制HeLa细胞生长曲线。

结果与讨论：

1、 细胞计数结果如下：

天数 0 1 2 3 4 5 6 7

细胞数

（万/瓶） 5.9 12 24 66 93 321 318 210

细胞数

实验五 细菌生长曲线的测定

一、 实验目的

1、 了解细菌生长曲线特点及测定原理

2、 学习用比浊法测定细菌的生长曲线

二、 实验原理

大多数细菌的繁殖速率很快，在合适的条件下，一定时期的大肠杆菌细胞每20min分裂一次。将一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期，对数期，稳定期和衰亡期四个阶段。以培养时间为横坐标，以细菌数目的对数或生长速率为纵坐标作图所绘制的曲线称为该细菌的生长曲线。不同的细菌在相同的培养条件下其生长曲线不同，同样的细菌在不同的培养条件下所绘制的生长曲线也不相同。

测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验采用比浊法测定，由于在一定的范围内，微生物细胞浓度与透光度成反比，与光密度（OD值）成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简便。

三、 实验材料

1、 菌种：大肠杆菌

2、 培养基： LB液体培养基/牛肉膏蛋白胨液体培养基

3、 仪器和器具：721分光光度计，比色杯(1cm)，恒温摇床，无菌吸管(5mL)，大试管，三角瓶(250mL)。

四、 实验流程

标记→接种→培养→测定

五、 操作步骤

1、 标记：取11支无菌大试管，用记号笔分别标明培养时间，即0，1.5，3，4，6，8，10，12，14，16和20h。

2、 接种：分别用5mL无菌吸管吸取2.5mL大肠杆菌过夜培养液(培养10~12h)转入盛有60 mL 液体培养基的三角瓶内，混合均匀后分别取5mL混合液加至上述标记的11支无菌大试管中。

3、 培养：将已接种的试管置摇床37℃振荡培养(振荡频率200~250r/min)，分别培养0，1.5，3，4，6，8，10，12，14，16和20h，将标有相应时间的试管取出，立即放4℃贮存，最后一同比浊测定其光密度值。

[精品]细菌生长曲线的测定

细菌生长曲线的测定是细菌学中的一项重要实验。它可以帮助我们了解细菌的生长繁殖规律及其影响因素，为控制细菌繁殖提供理论依据。本次实验将介绍如何通过外观观察、菌落计数及测定细菌生物量的方法，获得细菌在液体培养基中的生长曲线。

实验步骤：

一、准备实验材料和试剂

1、选取一种细菌菌株，本次实验选择了大肠杆菌（Escherichia coli）；

2、配置好液体培养基，一般为普通营养琼脂培养基、肉汤培养基等；

3、消毒好实验室的工作台面及实验仪器；

4、准备好移液管、试管、比色管和加热消毒的线圈镊子等实验用具。

二、制备不同浓度的菌液

1、挑选一根菌棒，从培养基上接入一些带有细菌的菌落，将菌落均匀涂抹于培养基表面；

2、将含有细菌的培养基放置在恒温摇床中，在适宜的温度下进行培养；

3、当细菌生长至一定程度（一般在对数生长期）时，用无菌的移液管，在培养基中取出一定量的菌液；

4、分别将不同体积的菌液加入到含有培养基的试管中，制备成不同浓度的菌液。

三、测定不同浓度菌液对应的OD600值

1、将制备好的不同浓度菌液放入洗涤过的比色管中；

2、由于细菌太小，肉眼观察不能得出其数量的增多或减少，因此需要使用分光光度计在600nm处测量各个浓度的菌液的吸光度（OD）值；

3、重复测量3次，取平均值计算OD600；

4、根据OD600值和菌液中细胞数量的线性关系，可通过OD600值推算出细胞数。

2、每隔2-3个小时，取出一定量的菌液，测量其OD600值，记录下菌液对应时间的值；

3、采用计数培养法，每隔一定时间取出一定体积的菌液，进行菌落数的计数； 4、利用OD600值曲线和菌落数曲线绘制出细菌生长曲线。

实验注意事项：