蛋白酶抑制剂筛选模型24页PPT

大环内酯类抗生素
Macrolide Antibiotics
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大环内酯类抗生素
学习目标：
1、掌握大环内酯类药物的分类和代表药的抗菌
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谱和临床用途。 2、熟悉林可霉素类抗生素、多肽类抗生素的抗 菌谱和临床用途、不良反应。
3、掌握红霉素的不良反应。
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大环内酯类抗生素
按化学结构分为： 14元（碳）大环内酯类:红霉素、罗红霉素……
■厌氧菌感染
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林可霉素类
【不良反应】
胃肠道反应 :胃纳差，恶心、呕吐、胃部不适和腹泻，
以腹泻最多见，发生率为25%，也有假膜性肠炎
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假膜性肠炎:用万古霉素、甲硝唑治疗。
过敏反应: 10% ,偶见皮疹、瘙痒、药疹等
肝毒性:黄疸、血清转氨酶升高 骨髓抑制:白细胞、血小板减少
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伪膜性肠炎 部位：小肠和结肠 急性纤维素渗出性炎症
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② 对金黄色葡萄球菌、肺炎球菌、链球菌的抗 菌活性较弱。 ③ 不良反应发生率较低，有胃肠道反应；
偶可见肝功能异常与外周白细胞下降等。
主要用于呼吸道感染、衣原体引起的泌尿道 感染和宫颈炎等。
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AZITHROMYCIN
主要用于呼吸道感染、衣原体引起的泌 尿道感染和宫颈炎等。
急性咽炎、急性扁桃体炎：化脓性链球菌
肠，甚至危及生命。
该病病情重，治疗不及时病死率高。
由于广谱抗生素和免疫抑制剂的广泛应用，该病发病
率有上升的趋势。
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四环素 土霉素 氯霉素 强力霉素 氨苄青霉素 林可霉素

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.
多肽类
VANCOMYCIN
仅对G+菌有强大杀菌作用

•libraries are available for immediate purchase from established chemical companies, which facilitates rapid validation of highscoring
hits from virtual screening experiments.
通过managefiles界面上传靶标蛋白酶的坐标文档的tacc的磁盘服务器并在submitjob界面选择计算机中的数据库tacc代管的超级计算机的处理中心将对靶标蛋白和小分子配体进行对接计算一个对接计算需要13分钟的处理时间大部分的操作能在812小时完成对接计算的状态可以通过网站查看对denv蛋白酶进行虚拟筛选时将产生一系列通过对接得分排序的匹配记录得的负分越小被认为是配体和靶标蛋白反应越积极

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第四步:命中化合物的后处理
最后一步是命中化合物的后处理 通过计算分子的类药性质ADME/T (吸 收、器官分布、体内代谢、排泄 和毒性)性质的估算，排除那些不具有类 药性质的分子。可以利用一些经验规则如“五规则” 等，快速排除那些 不适合进一步药物开发的分子。
通过以上四步处理，大部分分子从化合物库中剔除，形成一个合理 大小的化合物库，仅对这些适合成药的化合物或购买、或合成、或分离 得到，然后再进行实际的生物测试。
化关系。例如：蛋白质的一级、二级、三级、四级结构
.
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1.2 虚拟筛选技术的定义
虚拟筛选（virtual screening, VS)是计算机辅助药物设计方法的延伸 和推广，针对重要疾病特定靶标生物大分子的三维结构或定量构效关 系(QSAR)模型，从现有小分子数据库中，搜寻与靶标生物大分子结 合或符合QSAR 模型的化合物，进行实验筛选研究。

吸附或融合抑制剂筛选模型


将纯化的CD4或HIV一1 gpl20包被至ELISA 板上，在不同浓度药物存在的情况下，检 测另一种蛋白的结合量 特异识别HIVgp41六股a一螺旋束核心结构 空间构型的单克隆抗体，以该抗体建立夹 心ELISA方法
2 、抑制辅受体相互作用

趋化因子CCR5，为G蛋白偶联因子超家族（GPCR）成员的 细胞膜蛋白，是HIV-1入侵机体细胞的主要辅助受体之一

1、HIV吸附或融合抑制剂：

HIV侵入T淋巴细胞的起始阶段是HIV吸附于细胞膜 表面，是由于HIV膜蛋白gp120与T细胞表面受体 CD4的高度特异性结合。
霉酚酸(MPA)


从Penicillium sp. FO28017培养液中分离得到的小分 子物质, 是一种次黄嘌呤核苷酸脱氢酶( IMPDH ) 抑制剂和抗H IV抑制剂 蛋白印迹分析MPA能减少H IV的gp120表达从而抑 制H IV的感染，其作用机制主要是通过减少H IV 表面膜蛋白gp 120的表达来抑制合胞体形成。

蛋白酶抑制剂筛选模型



HIV-1蛋白酶与短肽链（含Tyr-Pro键）反 应 通过对肽键的测定推算出HIV-1蛋白酶的活 力 以此为对照，在系统中加入待测样品
4、逆转录酶抑制剂： 逆转录酶由pol基因编码，功能为转录和复 制病毒基因组 逆转录酶是艾滋病选择性化疗的首选靶位 之一 quinoxapatin A和quinoxapatin B 由放线 菌产生,为非竟争性酶抑制剂,具有可逆性
7个微生物代谢产物类CCR5 抑制剂
3、蛋白酶抑制剂：


HIV蛋白酶由pol基因编码，功能为切割聚 合蛋白 gag基因编码聚合蛋白→基质蛋白（p17）、 核衣壳蛋白（p7、p9）、衣壳蛋白（p24）

什么是蛋白酶抑制剂？
胃蛋白酶抑制剂
PI:
一类普遍存在于植物，动物和微 生物体内，通过抑制各种蛋白 酶的活性和功能而发挥免疫调 节、抗炎、抗氧化、抗肿瘤、 保护心血管、抗病虫害等作用 的化合物。
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蛋白酶抑制剂的分类
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免疫调节与抗炎作用
抑制免疫相关蛋白酶，干预抗原特异的T细胞 应答。
下调T细胞增生性反应和巨噬细胞功能。 上调IFN一γ活化的巨噬细胞释放一氧化氮，产
生细胞毒作用。 阻断病毒复制周期的关键酶。 抑制与炎症有关的蛋白酶。
抗癌作用 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
抑制炎症因子的产生 降低炎症相关蛋白酶的活
性（如MMP） 参与血液凝固及溶解 抗氧化
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1在基础研究方面， 蛋白酶抑制剂与靶蛋白
酶的相互作用及结合机制 已成为研究蛋白质与蛋白 质相互作用的极好材料。 同时将有更多特异性的蛋 白酶抑制剂将用于实验室 中，来纯化特定的蛋白酶( 亲和层析)。
乙酰胆碱酯酶抑制剂治疗阿尔茨海默病的研究 文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。 进展 ---科技信息 2012年25期
阿尔茨海默病（Alzheimer’s Disease,简称AD）是一种渐进性神经退
化失调症，其表现为记忆功能衰减及识别能力障碍，是老年期痴呆病的
蛋白质类蛋白酶抑制剂
◆主要来源于植物，以丝氨 酸PI、半胱氨酸PI、金属PI为主

50S subunit Nascent peptide chain
5’
3’
30S subunit mRNA
Aminoglycoside-treated bacterial cell
Drug(block of Drug(miscoded Drug(block of
initiation
peptide chain) translocation)
❖ 迅速产生抗药性
❖ 抗药的细菌其毒力也减弱
❖ 无交叉抗药性
.
30
Inhibit Nucleic Acid Synthesis
Pteridine +
p-Aminobenzoic acid
- Dihydropteroate
synthetase
Dihydropteroic acid
Sulphonamides
complex)
5’
3’
.
4
【药理作用】
❖ 链霉素 streptomycin ➢ 杀菌: 结核杆菌、链球菌等G+菌和G-杆菌 ➢ 鼠疫和兔热病的首选药 ➢ 粪链球菌或草绿色链球菌---细菌性心内膜
炎（与penicillin或vancomycin合用） ➢ 二线抗结核药物 ➢ 急性布鲁氏病（与四环素（tetracycline）
的inhA基因发生错义突变(missense mutation)
.
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利福平(rifampin)
地中海链丝菌(Streptomyces mediterranei) 产生的利福霉素(rifamycin )的半合成品
【抗菌作用】 ❖ 抗结核杆菌作用强大
❖ 加强链霉素和isoniazid的抗菌活性
❖ 对繁殖期和静止期的结核杆菌均有作用

酶抑制剂的作用方式
1.直接抑制病原微生物或人体内生物合成 途径中的某种关键酶，减少某种产物的 生成。 2.通过抑制人体内生物合成途径中的某种 酶使人体有益的底物得以积累，从而达 到治疗的目的。 3.通过抑制与某种生物合成途径直接相关 且必需的另一个生化反应的酶来减少有 害物的生成。
酶抑制剂的作用方式
1逆转录酶抑制剂rti2蛋白酶抑制剂3整合酶抑制剂目前国际上治疗艾滋病的药物共17种尚未有治疗艾滋的特效药高效抗逆转录病毒疗法逆转录酶抑制剂法及蛋白酶抑制剂的联合治疗是目前治疗中的基本治疗其他均为辅助治疗如免疫增强剂及中草药设计酶抑制剂筛选方法的基本原理在筛选酶抑制剂时要分离或精制得一定量的筛选酶再根据筛选酶与特定底物的特异性反应后所生成的反应物来设计反应程序从反应体系中底物的减少或消失和生成的产物的数量来判断待筛物的抑制活性强弱
设计酶抑制剂筛选方法 的基本原理
在筛选酶抑制剂时,首先要分离或精 制得一定量的筛选酶，然后再根据 筛选酶与特定底物的特异性反应后 所生成的反应物来设计反应程序,最 后从反应体系中底物的减少或消失 和生成的产物的数量来判断待筛物 的抑制活性强弱。
筛选模型的建立
筛选模型就是在筛选实验中所应用的实 验模型，由于抑制剂筛选要求实验方案 有标准化和定量化的特征，因而在传统 药理实验中常见的动物实验在抑制剂筛 选中较少应用，根据实验模型的不同， 药物筛选可以分为分子水平的筛选和细 胞水平的筛选。
1.比色检测法 比色检测法是最经典的酶检测方法，主要通过 测定反应底物或产物在紫外或可见光下的吸收 值，通过在特定波长下检测吸光值的变化．间 接地反应体系中酶的活性。比色检测法的关键 是在筛选反应体系中含有特定吸收波长、可用 于检测的化合物。对仪器要求简单，普通的酶 标仪就能够满足一般的高通量筛选的要求，也 是最为方便的检测方法之一，但是该方法的灵 敏度有时相对较低，有时为了达到信号在线性 范围内，需要较大的酶量和底物浓度。

HIV含群抗原基因（gag）、聚合酶基因 （pol）和包膜基因（env）等结构基因。
艾滋病毒的出芽繁殖产生包膜
Pathogenesis
巨噬H细IV胞作及用单的核靶细细胞胞。是其CD致4+病T细机胞理， 概括来说就是通过病毒颗粒的不断 复从制而而破造 坏成免疫CD平4+T衡细造胞成的免大疫量缺破陷坏，， 从而引起机会感染和恶性肿瘤的发 生。
目前，艾滋病已成为严重威胁世界人民健 康的公共卫生问题。1983年，人类首次发现 HIV。目前，艾滋病已经从一种致死性疾病变 为一种可控的慢性病。
Introduction
现HIV分为HIV-1和HIV-2，主要流行的 为HIV-1。HIV-1为直径约100~120nm球形 颗粒，由核心和包膜两部分组成。核心包括 两条单股RNA链、核心结构蛋白和病毒复制 所必须的酶类，含有逆转录酶、整合酶和蛋 白酶。
表达CD69、 CD38和HLA-DR等免疫激 HIV蛋白酶的底物是肽。
其致病机理概括来说就是通过病毒颗粒的不断复制而造成CD4+T细胞的大量破坏，从而破坏免疫平衡造成免疫缺陷，从而引起机会感 染和恶性肿瘤的发生。
活标志物水平异常的升高。 HIV-1蛋白酶与抑制剂相互作用的理论计算研究[J].
当这些抑制剂与HIV蛋白酶结合后，可以使HIV蛋白酶的柔性区关闭，于是可以抑制HIV蛋白酶的活性。 计算机药物辅助设计两个重要的研究对象就是受体和配体，本质是受体与配体结合，在氢键，C.
（二）体内抗HIV免疫反应
抗HIV免疫反应包括特异性免疫和非特异 性免疫反应，以特异性免疫反应为主。包括特 异性体液免疫和特异性细胞免疫，人体免疫系 统主要通过针对HIV蛋白的各种特异性抗体、 特异性CD4+ T淋巴细胞免疫反应和CTL直接或 分泌各种细胞因子(如肿瘤坏死因子,干扰素等)， 抑制病毒复制。

Table 1: Virus Log Reduction in ARALAST NP Manufacturing Process
Processing Step Cold ethanol fractionation Solvent Detergent-treatment 15 N nanofiltration Overall reduction factor Virus Log Reduction Factors HIV-1 4.6 > 5.8 > 5.3 > 15.7 BVDV 1.4 > 6.0 > 6.0 > 13.4 PRV 2.1 > 5.5 > 5.6 > 13.2 HAV 1.4 N/A > 5.1 > 6.5 MMV ≤ 1.0* N/A 4.9 4.9
ARALAST NP [alpha1-proteinase inhibitor (human)]
Solvent Detergent Treated Nanofiltered DESCRIPTION
ARALAST NP is a sterile, stable, lyophilized preparation of purified human alpha1-proteinase inhibitor (1-PI), also known as alpha1-antitrypsin.1 ARALAST NP is a similar product to ARALAST, containing the same active components of plasma 1-PI with identical formulations. ARALAST NP is prepared from large pools of human plasma by using the cold ethanol fractionation process, followed by purification steps including polyethylene glycol and zinc chloride precipitations and ion exchange chromatography. All U.S. licensed 1-PI plasma derived products contain chemical modifications which arise during manufacturing and occur in varying levels from product to product.11 ARALAST NP contains approximately 2% 1-PI with truncated C-terminal lysine (removal of Lys394), whereas ARALAST contains approximately 67% 1-PI with the C-terminal lysine truncation.12 No known data suggest influence of these structural modifications on the functional activity and immunogenicity of 1-PI.13 To reduce the risk of viral transmission, the manufacturing process includes treatment with a solvent detergent (S/D) mixture [tri-n-butyl phosphate and polysorbate 80] to inactivate enveloped viral agents such as human immunodeficiency virus (HIV), hepatitis B (HBV), and hepatitis C (HCV). In addition, a nanofiltration step is incorporated into the manufacturing process to reduce the risk of transmission of enveloped and non-enveloped viral agents. Based on in vitro studies, the process used to produce ARALAST NP has been shown to inactivate and/or partition various viruses as shown inNICAL PHARMACOLOGY

在糖尿病治疗中的应用
微生物来源胆固醇生物合成酶抑制剂
随着人们生活水平的提高，生活节奏的加快， 肥胖症、高脂血症正日益影响着人类的健康。
血液胆固醇含量过高，即高胆固醇血症，是 产生动脉粥样硬化，进而引发一系列疾病如 冠心病、心肌梗塞等的始动环节
在这一过程中涉及了许多酶促反应
血脂：中性脂肪（甘油三酯(TG)和胆固醇 （C） 一种为分子生物学的分类，根据末端氨基酸序列 及编码基因的位点来分，可分为四类（Ambler 分类） ：
A类，为丝氨酸酶，由质粒编码
B类，为金属酶，由染色体编码
C类，为丝氨酸酶，由染色体编码
D类，为丝氨酸酶，由质粒编码
另一种为临床上较为实用的分类方法，是 根据各种酶的底物及抑制剂类型分成五型 （Bush-J-M分类） ： ①CEP-N酶， ②PEN-Y酶， ③BSD-Y酶， ④EBS-Y酶即ESBLS（超广谱酶） ⑤金属酶。
（三）酶抑制剂的筛选
寻找新药取得成功基于以下诸因素： 微生物分离 筛选模型的有效性 发酵条件 所需的化合物的分离
其中关键在于建立有效的筛选模型
β-内酰胺酶抑制剂筛选模型
产色头孢菌素法：Nitrocefin(头孢硝噻吩) 是一种反应性很强的头孢菌素，易被β-内 酰胺酶水解，颜色由黄色转变为红色，提 取物或发酵液中如有抑制剂存在，则 Nitrocefin 颜色不变
他汀类药物的非调脂作用
抗凝固作用 改善内皮细胞功能作用 抗炎症作用 抗骨质疏松作用 抗肿瘤作用 预防痴呆 防治慢性心力衰竭 防治高血压 防治周围动脉疾病 抗心律失常 保护心脏瓣膜
毒副作用较少 肌病（CPK） 肝毒性（谷丙和谷草转氨酶）
1998年美国心脏协会（AHA）主席指出， 我们面临一场"脂质革命"，进入了一个"他 汀"的全新时代。他汀类药物在动脉粥样硬 化的预防方面的贡献和成就将至少相当， 甚至超出青霉素问世对传染性疾病和风湿 热预防的贡献与成就。

医学研究
酶抑制法也可用于医学研 究中，例如研究某些疾病 的发生机制和开发新的药 物。
农业科学
在农业科学领域，酶抑制 法可用于研究植物病虫害 的防治和农药残留等。
02
酶的选择与制备
酶的选择
酶的来源
根据实验需求选择合适的 酶来源，如动物、植物或 微生物。
酶的性质
了解酶的活性、最适pH、 最适温度等性质，以确保 实验的准确性和可靠性。
酶抑制法的原理
酶是一种生物催化剂，能够催化生物体内的化学反应。
酶的活性受到抑制剂的影响，抑制剂可以与酶的活性中心结合，从而抑制酶的活性 。
通过研究抑制剂对酶活性的影响，可以了解酶的催化机制和底物与酶之间的相互作 用。
酶抑制法的应用领域
01
02
03
生物化学研究
酶抑制法在生物化学研究 中被广泛应用于研究酶的 催化机制、抑制剂设计和 药物开发等领域。
缺点
干扰物质影响
酶抑制法可能会受到其他物质的干扰，导致 检测结果不准确。
适用范围有限
酶抑制法通常只适用于特定的物质或反应， 对于其他物质可能不适用。
对酶的依赖
该方法依赖于酶的活性，酶的失活或活性降 低可能会影响检测结果。
成本较高
某些酶和试剂的成本较高，增加了检测成本 。
改进方向
开发新型酶和试剂
优化操作流程
蛋白检测
使用蛋白质检测方法，如 Bradford法、Lowry法等，检测
纯化后酶的浓度和纯度。
活性检测
通过测定酶促反应速率，检测纯化 后酶的活性。
分子量测定
使用SDS-PAGE等方法测定纯化后 酶的分子量，以验证纯化效果。
03
酶抑制法实验流程

您记住我了吗？ 我是蛋白酶抑制剂（PI）哦！！！
THANK YOU.!
各类蛋白质类PI的作用
ห้องสมุดไป่ตู้
丝氨酸PI：抗胰蛋白酶和凝 乳蛋白酶等多种蛋白酶 半胱氨酸PI：抑制木瓜蛋白

酶、组织蛋白酶和天冬酰胺
内肽酶等的活性

金属PI：抑制多种含有金属 离子活性中心的蛋白酶活性 酸性PI：

其他天然小分子类蛋白酶抑制剂

主要包括：植物中的黄酮类、多酚类化合物、以
及其他多种天然化合物，例如姜黄素、茶黄素、
艾滋病功能性治愈

2013年，美国首次“功能性治愈”艾滋病。
联合治疗使得艾滋病功能性治愈成为可能,即采用“鸡尾 酒”式的混合药物治疗方法，用蛋白酶抑制剂与逆转录酶 抑制剂联合治疗艾滋病。在疾病治疗方面，对感染者实施 早期的抗病毒药物治疗，使艾滋病新发感染病降低了67%.
虽然国内抗艾药物市场在逐渐走向成熟，但在蛋白酶抑制剂领域，中 国尚属于起步阶段。尽管今后随着其他蛋白酶抑制剂药物专利的到期，国 内企业会争相仿制，品种也会增多，但竞争亦将更加激烈。届时，制药企 业不仅要与进口药争市场，还要直面国内企业的竞争。因此，鉴于蛋白酶 抑制剂的市场在整个艾滋病药物市场增长的驱动下在相应扩大这一趋势， 国内抗艾滋病药生产企业不可对已取得的市场地位盲目乐观，应密切关注 国际市场上的动态，积极应对最新研发动态和产品的挑战和冲击。
第七节
蛋白酶抑制剂
什么是蛋白酶？

蛋白酶(Protease)是一类酶的总称，这类 酶能水解蛋白质里面的肽键

蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、 果实和微生物中

蛋白酶广泛应用在皮革、毛皮、丝绸、

1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷，写作使人精确。——培根
1、不要轻言放弃，否则对不起自己。
2、要冒一次险!整个生命就是一场冒险。走得最远的人，常是愿意 去做，并愿意去冒险的人。“稳妥”之船，从未能从岸边走远。-戴尔．卡耐基。
梦 境
3、人生就像一杯没有加糖的咖啡，喝起来是苦涩的，回味起来却有 久久不会退去的余香。
蛋白酶抑制剂筛选模型 4、守业的最好办法就是不断的发展。 5、当爱不能完美，我宁愿选择无地久的美景，我只要生生世世的轮 回里有你。

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TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定，可配成溶液试剂，只需与 H2O2溶液混和即成应用液。酶反应终止后，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计 中定量，最适吸收波长为450nm。 ABTS虽不如OPD和TMB敏感，但空白值极低，也为一些试剂盒所采用。
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AP的底物为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。产物为黄 色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后， 黄色可稳定一时间。AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮），可用于 ELISA作荧光测定，敏感度较高于用显色底物的比色法。
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包被的方式
将抗原或抗体固定在过程称为包被(coating)。 蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的，靠的是蛋白质分子结构上 的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的， 受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常 含有更多的疏水基团，故更易吸附到固相载体表面。
3.3 酶的底物
HRP的底物
DH2+ H2O2 D+ 2HE2O 上式中， DH2为供氧体， H2O2为受氢体。 DH2一般为无色化合物，经酶作用后成为有色的产物。
DH2如：邻苯二胺(OPD)、四甲基联苯胺(TMB)和ABTS 。
OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵 敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物。
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1.4 免疫测定在病虫害检测中的应用
由于各种抗原成份（如病毒的外壳蛋白、细菌的细胞壁蛋白组分和鞭毛等） ，包括小分子的半抗原（包括植物激素、化学农药等），均可用以制备特异 性的抗血清或单克隆抗体，利用此抗体作为试剂就可检测标本中相应的抗原 ，因此免疫测定的应用范围极广。