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11第九章--亲和纯化技术

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亲和纯化

亲和纯化
载体应具备的特征：
具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面积大； 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用寿命长； 含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化； 粒径均一的球形粒子。
可供选择的载体
❖ 琼脂糖凝胶
过滤介质均 可作为亲和配基的载体
❖ 蛋白质参与亲和作用的机理
一般认为蛋白质的立体结构中存在结合位点， 呈凹陷或凸起结构。
具有亲和作用的分子间还需分子或原子水平的 各种相互作用，主要包括静电作用、氢键力、 疏水性相互作用、配位键、弱共价键等。
生物亲和作用是一种复杂的生物现象，这也是 亲和作用特异性高的主要原因。
二、影响亲和作用的因素
第四节 亲和吸附平衡 （略）
第五节 亲和色谱过程分析
❖ 亲和色谱操作过程
上样吸附 清洗（洗涤） 洗脱 再生
1、进料吸附（p329)
亲和色谱操作中可能存在的两种吸附：
❖ 亲和吸附：亲和配基与目标分子间的特异性结合 （选择性高） ❖ 非特异性吸附：料液中各种溶质（包括目标产物）
概述
❖ 生物亲和作用（bioaffinity）
定义： 生物分子能够区分结构和性质非常相近的其他分子， 选择性地与其中某一分子相结合，生物分子间的这种 特异性相互作用称为生物亲和作用或简称亲和作用。
通过亲和作用发生的结合称特异性结合（specific binding）或亲和结合（affinity binding）。
配基和目标蛋白的可逆性亲和结合可表示为
E＋L E·L
结合常数
Keq

E L EL
结合常数越大，表示 亲和作用越强
其中：E、L和E·L分别表示蛋白、配基和二者形成的复合体。 Keq一般为104~108dm3/mol，太大(接近不可逆结合）洗脱回收困 难，太小则难于有效吸附目标物质。

质粒亲和纯化-概述说明以及解释

质粒亲和纯化-概述说明以及解释

质粒亲和纯化-概述说明以及解释1. 引言1.1 概述质粒亲和纯化是一种重要的生物技术方法，用于从混合物中纯化含有特定亲和标签的质粒。

质粒是一种DNA分子，常常被用来在细菌中进行基因工程。

在质粒亲和纯化过程中，利用质粒与亲和基质之间的特定亲和作用，将含有目标质粒的混合物与其他杂质分离出来，最终得到纯净的目标质粒。

质粒亲和纯化具有高效、特异性强和操作简单等特点，已经广泛应用于分子生物学、基因工程等领域。

本文将详细介绍质粒亲和纯化的原理、步骤和应用，希望能为读者提供一些有益的信息和参考。

1.2 文章结构本文主要分为三个部分：引言、正文和结论。

在引言部分，将介绍质粒亲和纯化的概念和背景，说明文章的意义和重要性，以及本文的目的和意图。

在正文部分，将详细讲解质粒亲和纯化的原理、步骤和应用。

其中，质粒亲和纯化原理部分将介绍质粒和亲和纯化的关系，解释其基本原理。

质粒亲和纯化步骤部分将详细描述进行质粒亲和纯化的具体步骤和操作流程。

质粒亲和纯化应用部分将列举一些质粒亲和纯化在生物技术和研究领域的应用例子。

在结论部分，将对本文的内容进行总结，展望质粒亲和纯化的未来发展方向和可能的应用领域，最后以一些结束语来结束全文，强调质粒亲和纯化在科研和生产中的重要性和价值。

1.3 目的:质粒亲和纯化作为一种常用的蛋白表达和纯化技术，在生物医药领域具有广泛的应用。

本文旨在介绍质粒亲和纯化的原理、步骤以及应用，帮助读者了解该技术的基本概念和操作流程，以及在生物研究和生产中的重要作用。

通过深入了解质粒亲和纯化的相关知识，读者可以更加全面地掌握这项技术，为自己的研究工作提供有力的支持和指导。

希望本文能够帮助读者加深对质粒亲和纯化技术的理解，促进科研工作的进展和创新。

2. 正文2.1 质粒亲和纯化原理质粒亲和纯化是一种常用的蛋白质纯化技术，其原理基于蛋白质或肽链与金属离子或其他亲和配体之间的特异性结合。

在这种技术中，常用的亲和配体包括金属离子如Ni2+、Cu2+等，亲和配体与负载在固定相上的树脂特异性结合，从而可以有效地将目标蛋白质分离纯化出来。

亲和层析纯化

亲和层析纯化

亲和层析纯化亲和层析纯化是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，它基于目标分子与特定配体之间的亲和作用，通过选择性地捕获、洗脱和回收目标分子。

本文将从亲和层析纯化的原理、步骤和应用方面进行阐述。

一、亲和层析纯化的原理亲和层析纯化是基于生物大分子之间特异的相互作用原理进行的。

在该方法中，目标分子与具有亲和性的配体发生结合，形成稳定的复合物。

这种特异的结合使得目标分子能够在混合溶液中被选择性地捕获和富集。

亲和作用可以是多种形式，如氢键、离子键、疏水作用等。

根据目标分子和配体之间的亲和性，可以选择不同类型的亲和层析介质，例如亲和树脂、亲和膜等。

亲和层析纯化通常包括以下几个步骤：样品预处理、柱填充与平衡、样品加载、洗脱和目标分子回收。

1. 样品预处理：首先需要将样品进行预处理，如细胞破碎、蛋白质去除等，以获得目标分子的纯化样品。

2. 柱填充与平衡：将选择的亲和层析介质填充到柱子中，并通过流动缓冲液进行平衡，使介质充分湿润。

3. 样品加载：将样品加入到柱子中，目标分子与配体发生亲和结合，被捕获在柱子内。

4. 洗脱：通过改变流动缓冲液的组成、pH值或离子强度等条件，使非特异性结合的杂质分子被洗脱，而目标分子仍保持与配体的结合。

5. 目标分子回收：通过改变条件，使目标分子与配体的结合解除，从而使目标分子得以回收。

这可以通过改变pH、离子强度、温度等来实现。

三、亲和层析纯化的应用亲和层析纯化在生物技术、生物医药等领域得到了广泛应用。

1. 蛋白质纯化：亲和层析纯化可用于从复杂的混合物中纯化目标蛋白质。

例如，通过选择性地捕获具有特定亲和性的标签蛋白质，如His标签、GST标签等，实现目标蛋白质的高效纯化。

2. 抗体纯化：亲和层析纯化也被广泛用于抗体的纯化。

通过使用抗体与特定抗原之间的亲和作用，可以高效地纯化特定抗体。

3. 生物药物纯化：亲和层析纯化在生物药物制造中起着重要的作用。

通过选择性地捕获和富集目标生物药物，可以实现高纯度和高产量的生物药物生产。

生物制药工艺学习题(含答案

生物制药工艺学习题(含答案

生物制药工艺学习题集（含答案）第一章生物药物概述一、填空：1、我国药物的三大药源指的是化学药物、生物药物、中药2、现代生物药物已形成四大类型，包括基因重组多肽和蛋白质、基因药物、天然生化药物、合成与部分合成的生物药物3、请写出下列药物英文的中文全称：IFN（Interferon）干扰素、IL(Interleukin)白介素、CSF（Colony Stimulating Factor）集落刺激因子、EPO（Erythropoietin）促红细胞生成素、 EGF（Epidermal Growth Factor）表皮生长因子、NGF（Nerve Growth Factor）神经生长因子、 rhGH（Recombinant Human Growth Hormone）重组人生长激素、Ins（Insulin）胰岛素、HCG（Human Choriogonadotrophin）人绒毛膜促性腺激素、 LH 促黄体生成素、SOD超氧化物歧化酶、tPA 组织纤溶酶原激活物4、常用的β-内酰胺类抗生素有青霉素、头孢菌素；氨基糖苷类抗生素有链霉素；大环内酯类抗生素有红霉素；四环类抗生素有土霉素；多肽类抗生素有杆菌肽；多烯类抗生素有两性霉B；蒽环类抗生素有阿霉素5、嵌合抗体是指用人源抗体恒定区替换鼠源抗体恒定区，保留抗体可变区；人源化抗体是指抗体可变区中仅CDR（决定簇互补区）为鼠源，其FR（骨架区）及恒定区均来自人源。

6、基因工程技术中常用的基因载体有质粒、噬菌体（phage）、黏粒（cosmid）、病毒载体等。

二、选择题：1、以下能用重组DNA技术生产的药物为（B）A、维生素B、生长素C、肝素D、链霉素2、下面哪一种药物属于多糖类生物药物（C）A、洛伐他汀B、干扰素C、肝素D、细胞色素C3、能用于防治血栓的酶类药物有（D）A、SODB、胰岛素C、L-天冬酰胺酶D、尿激酶4、环孢菌素是微生物产生的（A）A、免疫抑制剂B、酶类药物C、酶抑制剂D、大环内酯类抗生素5、下列属于多肽激素类生物药物的是（D）A、ATPB、四氢叶酸C、透明质酸D、降钙素6、蛋白质工程技术改造的速效胰岛素机理是（D）A. 将猪胰岛素B30位改造为丙氨酸，使之和人胰岛素序列一致B. 将A21位替换成甘氨酸，B链末端增加两个精氨酸，使之在pH4溶液中可溶C. 将B29位赖氨酸用长链脂肪酸修饰，改变其皮下扩散和吸收速度D. 将人胰岛素B28位与B29位氨基酸互换，使之不易形成六聚体三、名词解释：1、药物 Medicine(remedy)：用于预防、治疗或诊断疾病或调节机体生理功能、促进机体康复保健的物质，有4大类：预防药、治疗药、诊断药和康复保健药2、生物药物（biopharmaceutics）：是以生物体、生物组织或其成份为原料（包括组织、细胞、细胞器、细胞成分、代谢、排泄物）综合应用生物学、物理化学与现代药学的原理与方法加工制成的药物3、基因药物（gene medicine）：是以基因物质（RNA或DNA及其衍生物）作为治疗的物质基础，包括基因治疗用的重组目的DNA片段、重组疫苗、反义药物和核酶等4、反义药物：是以人工合成的十至几十个反义寡核苷酸序列，它能与模板DNA或mRNA互补形成稳定的双链结构，抑制靶基因的转录和mRNA翻译，从而达到抗肿瘤和抗病毒作用5、生物制品（biologics）：是应用普通的或以基因工程、细胞工程、蛋白质工程、发酵工程等生物技术获得的微生物、细胞及各种动物和人源的组织和液体等生物材料制备的，用于人类疾病预防、治疗和诊断的药品6、RNA干涉（RNAi，RNA interference）：是指在生物体细胞内，dsRNA引起同源mRNA的特异性降解，因而抑制相应基因表达的过程7、siRNA(small interfering RNA) ：是一种小RNA分子（~21-25核苷酸），由Dicer（RNAaseⅢ家族中对双链RNA具有特异性的酶）加工而成。

免疫亲和纯化和免疫沉淀

免疫亲和纯化和免疫沉淀

盐析沉淀法 是最古老而又经典的蛋白质纯化 分离技术。由于方法简便、有效、不损害蛋白 抗原活性等优点，至今仍被广泛原理
因为蛋白质是亲水性大分子，所以在水溶液中有双电 层结构的水合膜，来保证分子的溶解度平衡并稳定存在。 当加入盐时，盐会电离成离子态，离子的电性破坏了蛋白 质的双电层的水合膜结构，从而使其沉降，析出。
凝胶过滤(分子筛层析)图示1
凝胶过滤(分子筛层析)图示2
离子交换层析柱
亲和层析
是利用生物大分子的生物学特异性，即生物分子 间所具有的专一性亲和力而设计的层析技术。 例如抗 原和抗体（免疫亲和层析）、 酶和酶抑制剂（或配 体）、酶蛋白和辅酶、激素和受体等之间有一种特殊 的亲和力，在一定条件下，它们能紧密地结合成复合 物。如果将复合物的一方固定在不溶性载体或共价结 合在一种惰性的微珠上，则可从溶液中专一地分离和 提纯另一方。与上述其他纯化方法相比，亲和层析能 产生相当高的纯化作用。另外，此法的优点是迅速， 有时仅一步即可达到纯化的目的。
生物工程下游技术：一般包括产物（一般为蛋白质） 的预处理及分离纯化；产品的成型加工和质量监控等一 系列单元操作和过程中的主要技术,其中生化产物及发 酵产物的分离纯化是其核心内容。下游技术是生物工程 重要组成部分,是生物高科技技术实现产业化的关键， 如：酶工程 , 发酵工程等（提取干扰素、胰岛素和酶 等）。
免疫亲和纯化技术
亲和纯化(affinity purification)是基 于目标分子与固定化配体的特异性 相互作用(如：抗原-抗体)。亲和技 术可用来从混和物中分离特定分子。 捕获目标分子用于相互作用研究, 或 从反应体系中去除某一成分。
免疫亲和纯化原理
免疫亲和纯化是一种分离各种生物大分子最有效的方法
免疫亲和纯化和免疫沉淀技术

串联亲和纯化技术原理

串联亲和纯化技术原理

串联亲和纯化技术原理引言：串联亲和纯化技术是一种用于分离和纯化蛋白质的常用方法。

其原理是利用特定的亲和配体与目标蛋白质发生特异性结合，从而实现目标蛋白质的高效分离和纯化。

本文将详细介绍串联亲和纯化技术的原理及其在生物制药和生物学研究中的应用。

一、串联亲和纯化技术的基本原理1. 亲和配体的选择串联亲和纯化技术的第一步是选择适合的亲和配体。

亲和配体是一种能够与目标蛋白质特异性结合的分子，它通常是一种蛋白质或化学修饰物。

常用的亲和配体有金属离子、抗体、亲和标签等。

2. 亲和柱的制备与校正根据选择的亲和配体，可以制备相应的亲和柱。

亲和柱是一种固定了亲和配体的柱状基质，如琼脂糖、硅胶等。

为了确保亲和纯化的高效性和特异性，亲和柱需要进行校正，以确定适宜的结合和洗脱条件。

3. 样品的处理与加载在进行串联亲和纯化之前，需要对样品进行预处理。

通常包括细胞裂解、蛋白质提取、富集等步骤。

预处理后的样品被加载到亲和柱上，目标蛋白质与亲和配体发生特异性结合。

4. 洗脱与再生洗脱是将目标蛋白质从亲和柱上洗脱下来的过程。

洗脱条件通常是改变pH值、离子浓度、温度等。

洗脱得到的蛋白质溶液即为目标蛋白质的纯化产物。

亲和柱在洗脱后需要再生，以去除非特异性结合的杂质。

二、串联亲和纯化技术在生物制药中的应用1. 蛋白质药物的纯化串联亲和纯化技术广泛应用于蛋白质药物的纯化过程中。

通过选择适当的亲和配体，可以高效地纯化目标蛋白质药物，并去除其他蛋白质、核酸、小分子等杂质。

这种方法具有高效、特异性好、纯化度高等优点，可以满足药物的高纯度要求。

2. 疫苗的制备串联亲和纯化技术也可用于疫苗的制备。

例如，通过将目标抗原蛋白质与亲和配体结合，可以高效地纯化目标抗原，然后将其制备成疫苗。

这种方法可以提高疫苗的纯度和效力，减少潜在的副作用。

三、串联亲和纯化技术在生物学研究中的应用1. 蛋白质相互作用的研究串联亲和纯化技术在研究蛋白质相互作用方面发挥了重要作用。

生物制药工艺学习题第九章亲和纯化技术

第九章亲和纯化技术一、填空题1、亲和层析洗脱方法有，，。

2、亲和力大小除由亲和对本身的决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和吸附剂、、、、等。

3、亲和层析中常用作别离酶的配基有，，和。

4、亲和层析中非专一性吸附有、、。

5、亲和过滤指的是将和结合运用，它包括和两大方法。

二、选择题1、下面关于亲和层析载体的说法错误的选项是〔〕A.载体必须能充分功能化。

B.载体必须有较好的理化稳定性和生物亲和性，尽量减少非专一性吸附。

C.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。

D.理想的亲和层析载体外观上应为大小均匀的刚性小球。

2、制备亲和柱时，应首先选用的配基是〔〕A.大分子的B.小分子的C.中等大小的D.不确定3、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中参加配基的洗脱方法称作〔〕A. 阴性洗脱B. 剧烈洗脱C. 竞争洗脱D. 非竞争洗脱4、亲和层析的洗脱过程中，在流动相中减去配基的洗脱方法称作〔〕A. 阴性洗脱B. 剧烈洗脱C. 正洗脱D. 负洗脱三、名词解释1、亲和反胶团萃取〔Affinity-based resersed micellar extraction〕：2、亲和膜：3、二次作用亲和沉淀〔secondary-effect affinity precipitation〕：4、亲和萃取：5、亲和吸附剂：6、负洗脱：四、问答题1、亲和层析的原理是什么？主要特点是什么？2、对亲和层析的公式 LK L V Ve ][100+= 进展说明。

设 K L =10-7，求[L 0] 〔6分〕 3、何谓“手臂〞？其长短与亲和层析效果有何联络？为什么？4、从亲和沉淀的机理和别离操作的角度出发，简述亲和沉淀纯化技术的优点。

第九章 亲和纯化技术〔答案〕一、填空题1、亲和层析洗脱方法有非专一性洗脱 ， 特殊洗脱， 专一性洗脱。

2、亲和力大小除由亲和对本身的 解离常数 决定外，还受许多因素的影响，其中包括亲和吸附剂 微环境 、 载体空间位阻 、 载体孔径 、 配基和配体的浓度 、配基构造 等。

亲和纯化质谱

亲和纯化质谱
亲和纯化质谱是一种常用的生物分离技术，它能够高效地分离纯化蛋白质。

该技术依靠靶蛋白与亲和基质之间的特异性相互作用，实现纯化目标蛋白质。

亲和基质通常是与目标蛋白质具有互补结构的分子，比如亲和标记、抗体、核酸等。

通过将亲和基质固定在某种载体上，如大孔径凝胶、磁珠等，可以实现目标蛋白质的特异性捕获和分离纯化。

亲和纯化质谱技术在生物医学研究和药物开发中有着广泛的应用，是生物化学、分子生物学、基因工程等领域的重要方法之一。

- 1 -。

亲和纯化


亲和层析载体的性质与选择
常用的亲和层析载体 葡聚糖凝胶：与琼脂糖凝胶相比孔径太小， 3）葡聚糖凝胶：与琼脂糖凝胶相比孔径太小，特别是经 配基偶联后， 凝胶膨胀度会进一步变小， 配基偶联后 ， 凝胶膨胀度会进一步变小 ， 所以应用受到 限制。 限制。 聚丙烯酰胺凝胶： 碳骨架， 4） 聚丙烯酰胺凝胶：碳—碳骨架，由丙烯酰胺和甲叉双 碳骨架 丙烯酰胺聚合而成， 具有网状三维空间结构。 丙烯酰胺聚合而成 ， 具有网状三维空间结构 。 注意避免 接触强氧化剂， 配基偶联后会使它的网格缩小， 接触强氧化剂 ， 配基偶联后会使它的网格缩小 ， 在一定 程度上限制了它的应用。 程度上限制了它的应用。
亲和层析载体的性质与选择
常用的亲和层析载体 纤维素 葡聚糖凝胶 琼脂糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃珠
亲和层析载体的性质与选择
常用的亲和层析载体 1）纤维素：自然界中数量最大的大分子生物材料，取材 纤维素：自然界中数量最大的大分子生物材料， 十分方便。但由于其结构紧密、均一性差， 十分方便。但由于其结构紧密、均一性差，不利于大分 子的渗入。活化后常带有电荷，非特异性吸附较强， 子的渗入。活化后常带有电荷，非特异性吸附较强，加 上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。 上空间位阻等原因，其应用不如凝胶载体广泛。目前主 要用于分离与核酸有关的物质。 要用于分离与核酸有关的物质。 2）琼脂糖凝胶：用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。 琼脂糖凝胶：用于亲和层析的主要为交联珠状凝胶。 这类载体能使吸附物质保持活性， 这类载体能使吸附物质保持活性，能迅速活化并接上各 种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。 种功能基团，结构疏松孔径大，流速快。
(四)亲和层析的基本操作
(二)
洗脱方式
1,一步洗脱 一步洗脱 属于非选择性洗脱方法，应用于高度特异性吸附剂 属于非选择性洗脱方法， 的结合， 的结合，经过一次洗脱将被吸附物质全部洗脱下 就可得到较纯的分离物。 来，就可得到较纯的分离物。 非选择性洗脱主要受洗脱液的pH、离子强度、 非选择性洗脱主要受洗脱液的pH、离子强度、温度 pH 和介电常数等因素的影响， 和介电常数等因素的影响，有效的洗脱液既能改变 被吸附蛋白质的构象以降低蛋白质与配基之间的亲 和力，又不破坏蛋白质和亲和吸附剂的稳定性。 和力，又不破坏蛋白质和亲和吸附剂的稳定性。

免疫亲和纯化和免疫沉淀概要


免疫亲和纯化的关键：高亲和力与容易洗脱的优 化组合。
常见错误是将低亲和力和容易洗脱等同看待。
1．亲和层析支持物的选择:作为亲和层析支持物须 符合以下要求：①非特异性吸附低；②液体通过 时流速要快；③在各种pH和高浓度盐溶液中稳 定；④必须有合适的、丰富的化学基团，能有效 地与蛋白质或其它化合物结合；⑤必须带有丰富 的微孔，以增加结合容量。符合以上5个条件的 支持物有琼脂糖、聚丙烯酰胺和多孔玻璃球，其 中常用的是琼脂糖珠（Sepharose2B、4B、6B）。
特点： 1、高纯化率，通常为常规纯化的1,000-10,000倍以上。 2、由于内在的背景限制，如目标抗原量非常稀少，需与其他方法结 合才能获得均质性产物。 3、快速纯化抗原，层析柱常可重复使用。可按照不同规模进行，半 天内即可完成。 4、不仅适用于纯化抗原，也可用来分离经过初步纯化的抗体，乃至 所有能与相应配体有效结合的生物分子。 5、抗体与其相应抗原结合具有高度亲和力和特异性，能大量分离天 然状态或近似天然状态的抗原。 6、需要适当纯化的抗体，不是所有的抗体都适用于免疫亲和层析， 但一旦获得一种性能良好的抗体，纯化过程就简单、快速、可靠 。
影响免疫亲和层析纯化效果的因素
抗原初始相对浓度（即纯度）：是决定最终产物纯度 极为重要的因素。
抗原与抗体的亲和力：是免疫亲和纯化层析过程中最 麻烦的问题。高亲和力抗体（>10-8 mol/L)能在1 h以内 达到有效的分离，而低亲和力的抗体(﹤10-6 mol/L）即 使在高浓度时也不能结合溶液中的全部抗原。使用针 对同一抗原多个表位的多克隆抗体以增强亲和力的方 法固然可结合较多的抗原，但增加了洗脱的困难性。 只有当所需的最终产物为变性蛋白时，才选用识别多 个表位的抗体。
超速离心 是分离亚细胞及蛋白质大分子的有效手
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第九章 亲和纯化技术
1
亲和纯化技术概念
利用生物分子间的特异性结合作用的原理进行生物 物质分离纯化的技术称为亲和纯化技术（Affinity purification）
2
3
本章内容的重点
1、 掌握亲和层析的基本原理，亲和吸附剂的制备 要点包括载体和配基的选择及其它措施。 2、 熟悉亲和层析的基本操作，洗脱条件的控制及 提高分辨率的方法。 3、 了解亲和层析的用途。 4、 掌握亲和过滤、亲和萃取、亲和沉淀、亲和电 泳的有关概念。
用连二亚硫酸钠还原，亚硝酸钠处理，得重氮盐衍生物。 配基与重氮盐衍生物偶联，制得亲和层析柱。
48
碳二亚胺缩合法
碳二亚胺为羧 基活化剂。
反应中的脲衍 生物可用有机 溶剂洗涤除去。
49
（三）用于固定化配基的凝胶衍生物
1、CNBr活化的Sepharose 4B
Sepharose 4B经CNBr活化，可偶联蛋白和核 酸类配基。
62
非专一性吸附 亲和层析中的非专一性吸附。
离子效应 疏水基团 复合亲和力
63
离子效应
配基与载体-间隔臂的不完全 结合，将无关离子基团引入 吸附剂。
具有离子基团的亲和吸附剂 会影响蛋白质的洗脱行为。
64
疏水基团
吸附剂疏水性基团与蛋白质结构中的疏水 区相互吸引，形成非专一性吸附。
疏水基团： （1）长的烃链结构的“手臂”： （2）疏水性配基：
19
（二）常用载体
纤维素 (cellulose) 琼脂糖凝胶 葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺凝胶 多孔玻璃珠（Bio-Glass） 其它载体——壳聚糖 (Chitosan)
20
1、纤维素
纤维素结构紧密、均一性差，不利于大分子的 渗入。
非特异性吸附力较强，空间位阻。
主要用于分离与核酸有关的物质。
7
第一节 亲和层析(affinity Chromatography)
利用生物大分子物质具有与某些相应的分子 专一性可逆结合的特性而建立的层析技术。
适用于从成份复杂且杂质含量远大于目标物 的混合物中提纯目标物。
8
特点
经过一次处理可得到高纯度活性物质 。 设备要求不高、操作简便、特异性强、分离速度
27
亲和势—KL（EL复合物的解离常数 ）
以酶和底物为例：
KL：解离常数
KL
E： 酶
E+L
EL
L： 底物
EL：复合物
E0、L0：起始浓度，当L0》E0时， 分配比k
（二）配基的浓度
对亲和势比较低的时候（KL≥10-4mol/L），增 加配基浓度有利于吸附。
增加亲和柱的长度来提高吸附率。
配基浓度太高使吸附力太强，洗脱困难。
60
七、 亲和层析的吸附和洗脱
影响吸附的条件 亲和层析的洗脱 亲和吸附剂的再生
61
（一）影响吸附的条件
亲和吸附剂及配体的性质 缓冲液的种类、离子强度、pH、温度和层析流
速有关。
温度升高会使吸附作用减弱。 流速每小时低于10 ml/cm2。 层析柱用前必须充分平衡。 上样体积为柱床体积的5%。
42
甲苯磺酰氯法
在无水丙酮中进行。
优点：①活化反应迅速； ②偶联条件温和； ③偶联效率高。
43
双功能试剂法
双功能试剂是同一分子中具有两个反应活性基团 的化学试剂，常作为连接两个分子的“桥梁”。
二乙烯砜、戊二醛、琥珀酸酐 优点：反应速度快、条件温和，能与氨基、糖类、
酚、醇类等偶联。
44
聚丙烯酰胺凝胶载体的活化法
快、分离效果好、分离条件温和。 亲和吸附剂通用性较差，专用的吸附剂。
9
亲和吸附剂：载体—配基
在亲和层析中起 可逆结合的特异 性物质称为配基 （Ligand）。
与配基结合的层 析介质称为载体 （Matrix）。
10
一、亲和层析的原理
（1）配基固定化：配基与载体偶联，结合成具 有特异亲和性的分离介质。
65
复合亲和力
离子效应作用，又有疏水作用。 配体与配基有较强生物特异性。 用高浓度的盐和有机溶剂，以提高选择性。
66
（二）亲和层析的洗脱
洗脱：
洗脱方法主要有三种： 非专一性洗脱 特殊洗脱 专一性洗脱
67
1、非专一性洗脱 通过调节洗脱液的pH值、离子强度、离子种类或温度等
理化性质降低目标产物的亲和吸附作用，是使用较多的洗 脱方法。
配基浓度对亲和力的影响 空间障碍的影响 配基与载体的结合位点的影响 载体孔径的影响 微环境的影响
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（一）配基浓度对亲和力的影响
为将亲和配体与其它物质分开，需要阻留值 ≥10。
配基浓度与亲和对解离常数相关。 对于低亲和力系统，配基浓度提高。
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（二）空间障碍的影响
空间位阻。 对于分子大的配体以及小
理想的配基浓度为1-10μmol/L。
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（三）配基偶联的位置
配基固定化时，其不参与亲和 结合的部位与载体进行偶联。
AMP-Sepharose亲和柱。 腺嘌呤N6-氨基接到载体上，对
脱氢酶和甘油激酶有吸附力。 磷酸基接到载体上，对甘油醛-
3-磷酸脱氢酶有吸附力。
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（四）配基分子的大小
特点：特异性高、分离效果好。 缺点：配基不稳定，偶联时活性损失大，价格昂贵、
成本高。
通用配基（general ligand）
用于一类物质的分离提纯。
用NADH作脱氢酶类亲和层析的通用配基； 用ATP作激酶类亲和层析的通用配基； 用外源性凝集素作糖蛋白类亲和层析时的通
用配基等。
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2、通用性配基（general ligand）：
选用大分子配基。
甘氨酸 小分子物质作为配基，载
体和配基间插入一个“手 臂”以消除空间障碍。
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（五）配基的类型
较小的有机分子或天然生物活性物质。 根据配基应用和性质:特殊配基和通用配基。 特殊配基（special ligand）
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1、特殊配基（specific ligand）：
指只与单一或很少种类的蛋白质等生物大分子结合的 配基。如生物素和亲和素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、 激素－受体等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物 质作为配基都属于特殊性配基。
四、载体的活化与偶联
糖类载体的活化与偶联 聚丙烯酰胺凝胶及其它凝胶衍生物活化与偶联 用于固定化配基的凝胶衍生物
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（一）糖类载体活化与偶联
溴化氰活化法 高碘酸氧化法 环氧化法 甲苯磺酰氯法 双功能试剂法
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溴化氰活化法
载体如琼脂糖、葡聚糖等，在碱性条件下用溴 化氰处理，可引入活泼的“亚氨基碳酸”中间 体。
2、AH-Sepharose 4B和CH-Sepharose 4B 含有6个碳原子的”手臂”的琼脂糖衍生物 AH-Sepharose 4B用于含有羧基的一类配基。 CH-Sepharose 4B能与含有一级氨基的配基偶
联。
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3、环氧活化型Sepharose 6B
由亲水“手臂”与Sepharose 6B载体通过醚 链形成的衍生物。
（2）吸附样品：亲和层析介质选择性吸附生物 活性物质。
（3）样品解吸：选择适宜的条件使被吸附物活 性物质解吸。
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基本过程
•固相化
+
吸附
+
+
冲洗
解吸
+
亲和层析的原理
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举例：抗原-抗体亲和层析
二、亲和层析载体
（一）亲和层析对载体的要求：
（1）充分功能化，与配基进行共价连接。 （2）有较好的理化稳定性和生物惰性。 （3）具有高度的水不溶性和亲水性。 （4）具有多孔的立体网状结构。 （5）应为大小均匀的刚性小球。
6、其它载体——壳聚糖
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壳聚糖(甲壳素和壳聚糖)
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三 、亲和配基
配基的选择 配基的浓度 配基偶联的位置 配基分子的大小 配基的类型
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（一）配基的选择
亲和层析配基的选用主要取决于分离对象。
1、配基与配体有足够大的亲和力 （亲和势） KL 在10-4～10-8之间。
2、配基与配体的结合应是专一的 。 3、配基应具有化学活性 。
葡聚糖凝胶孔径太小，偶联配基后，孔径更 小，应用受到限制。
4、聚丙烯酰胺凝胶： Bio-gel P
有供化学反应的酰胺基，能制得配基含量较 高的亲和柱，适用于亲和势比较低的系统。 pH过高或过低的溶液中酰胺基易水解。
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5、多孔玻璃珠：
化学与物理稳定性较好，机械强度高。
缺点：亲水性不强，对蛋白质尤其是碱性蛋白质 有非特异性吸附，化学活性基团少。
分子配基更明显。
“手臂”，增加与载体相 连配基的活动度，减轻载 体的立体障碍。
常用的“手臂”多为烃链。
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（三）配基与载体的结合位点的影响
多肽或蛋白质等大分子配基须控制偶联反应条件， 使它以最少的功能基团与载体连接。
保持蛋白质原有的高级结构，使亲和吸附剂具有 较大的亲和力。
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（四）载体孔径的影响
用于小分子配基的固定化。 用于偶联脂多糖、蛋白等大分子配基。
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4、活化型亲和胶10和15
由N-羟琥珀酰亚胺与琼脂糖衍生物形成的活化酯。 Affi-Gel10的“手臂”长为10个碳原子，产生一些负电
荷，有利于碱性或中性蛋白偶联； Affi-Gel15为15个碳原子的“手臂”，产生一些正电荷，
指特异性不是很强，能和某一类的蛋白质等生物大分 子结合的配基，如各种凝集素（lectine）可以结合各种糖 蛋白、NADH作脱氢酶类的通用配基等。通用性配基对生物 大分子的专一性虽然不如特异性配基，但通过选择合适的 洗脱条件也可以得到很高的分辨率。而且这些配基还具有 结构稳定、偶联率高、吸附容量高、易于洗脱、价格便宜 等优点，所以在实验中得到了广泛的应用。