不同产地枳实药材的高效液相色谱特征图谱研究

第48卷第17期2020年9月广㊀州㊀化㊀工Guangzhou Chemical Industry Vol.48No.17 Sep.2020枳实药材的色谱-质谱联用指纹图谱陈㊀鑫,陈玉宇(泰州医药高新技术产业园区管理委员会,江苏㊀泰州㊀225300)摘㊀要:采用色谱-质谱联用法建立枳实的高效液相指纹图谱分析方法㊂利用带有预柱的汉邦Phecda C18色谱柱(4.6mmˑ150mm,5μm),流动相为2%HAC溶液(A)-甲醇(B)的梯度洗脱;流速1mL㊃min-1;柱温30ħ;检测波长283nm的色谱条件㊂结果表明枳实中有效成分能较好地分离㊂通过对照品对照和色谱-质谱联用定性分析鉴定,14批枳实共标出10个共有峰㊂结果表明,高效液相色谱法具有较好的分离效果,所选用方法符合定性研究要求,为枳实的化学成分的深入研究奠定了基础㊂关键词:枳实;质谱;高效液相色谱;指纹图谱;质量控制㊀中图分类号:R917㊀㊀㊀㊀㊀文献标志码:B文章编号:1001-9677(2020)17-0057-05㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀通讯作者:陈鑫(1985-),男,主要从事现代药物质量研究与评价㊂Study on the HPLC Fingerprints in Fructus Aurantii ImmaturusCHEN Xin,CHEN Yu-yu(Taizhou National Medical Hi-tech Development,Jiangsu Taizhou225300,China)Abstract:The fingerprint of Fructus Aurantii Immaturus by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry was developed.The analytical method was carried out with Hanbang Phecda C18column(4.6mmˑ150mm, 5μm)with pre-column.The mobile phase consisted of2%HAC solution(A)-methanol(B)gradient elution as flow rate of1mL㊃min-1.The detection wavelength was283nm,and column temperature was30ħ.10common peaks were separated in14batches of Fructus Aurantii Immaturus.The observation of methodology was in keeping with quantitative determination and qualitative study.HPLC has good separation result to provide reliable basis for Fructus Aurantii Immaturus s material foundation research.Key words:Fructus Aurantii Immaturus;mass spectrometry;HPLC;fingerprints;quality control枳实为芸香科植物酸橙及其栽培变种或甜橙的干燥幼果[1],植物形态为常绿小乔木,有长刺㊂单叶互生,革质,叶柄有狭长形或倒心脏形的翼;叶片长椭圆形,有半透明油点;花排列成总状花序;花萼杯状,5裂;花瓣5,白色,长椭圆形;柑果圆形而稍扁,成熟时橙黄色㊂花期4~5月,果期6~11月㊂枳实呈半球形,少数为球形,直径0.5~2.5cm㊂外果皮黑绿色或暗棕绿色,具颗粒状突起和皱纹,有明显的花柱残迹或果梗痕,切面中果皮略隆起,厚0.3~1.2cm,黄白色或黄褐色,边缘有1~2列油室,瓤囊棕褐色,质地坚硬㊂气清香,味苦㊁微酸㊂主产于四川㊁江西㊁福建㊁江苏等地,具有破气消积㊁化痰散痞等功效㊂主要用于积滞内停,痞满胀痛,泻痢后重,大便不通,痰滞气阻,胸痹,结胸,脏器下垂等㊂目前,对于枳实药材的研究,虽然除了对于主要化学成分的含量测定以外,也包含大量的HPLC图谱研究和其他指纹图谱,但也存在一些不足㊂目前已有文献[2-17]对枳实的指纹图谱进行研究,标定了其中一些有效成分,本文在此基础上采用HPLC-ESI/DAD-TOF-MS联用色谱技术建立了枳实高效液相色谱指纹图谱,经黄酮类标准图谱对照和HPLC-ESI/DAD-TOF-MS总离子流信息鉴定10个共有峰,进而建立了14批枳实特征色谱指纹图谱,此方法将色谱质谱联用技术应用在枳实的指纹图谱分析中,方法新颖㊁特征峰多㊁信息量大的良好特点,这种相结合的分析方法是科学的㊁系统的㊁全面的,从而有利于中药科学的质量控制,为枳实的全面研究提供参考;为该药的进一步开发和利用提供重要参考依据和有力手段;也为全面探究枳实活性成分提供了切实的依据㊂本文建立的枳实药材综合指纹图谱,采用相似度评价系统对不同产地不同生产厂家的枳实药材进行了差异甄别,为鉴定枳实药材成分差异㊁控制药材质量奠定了夯实的基础,使其生产达到规范化㊁稳定化㊁现代化,为其它天然药物的研究提供参考㊂1㊀仪器与材料1.1㊀仪㊀器Shimadazum LC-10Advp高效液相系统;配套真空脱气机㊁自动进样器及柱温箱;UV检测器;LC-Solution工作站;Agilent1260高效液相色谱仪配二极管阵列检测器,美国Agilent;Agilent6224TOF-LC-MS系统,配备电喷雾离子源(ESI源)以及Agilent MassHutter Qualitative Analysis B.04.00质谱工作站软件,美国Agilent;AB135-S分析天平,美国梅特勒-托利多仪器有限公司;LIBROR AEU-2101/1万电子天平,Japan Shimadzu;KQ-500VDB型超声波清洗器,昆山超声仪器厂;Beckman Avanit J-E高速离心机,美国Beckman coulter;58㊀广㊀州㊀化㊀工2020年9月CW130粉碎机,上海天祥健台制药机械有限公司;DHG-9070A型电热恒温鼓风干燥箱,上海索谱仪器有限公司㊂1.2㊀材㊀料枳实品种如表1所示,经鉴定为芸香科植物酸橙(Citrus aurantium L.)及其栽培变种或甜橙(Citrus sinensis Osbeck.)的干燥幼果,样本现保存于江苏省南京市中国药科大学㊂对照品:柚皮苷(分子式C27H32O14,CAS号10236-47-2,批号:12030612),橙皮苷(分子式C28H34O15,CAS号250-26-3,批号:12020304),新橙皮苷(分子式C28H34O15,CAS号13241-33-3,批号:12030701)对照品均购自成都曼斯特生物科技有限公司,规格均为20mg/支,纯度ȡ98%㊂试剂:甲醇(特级纯),南京晚晴化玻仪器有限公司;乙酸(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;乙醇(分析纯),国药集团化学试剂有限公司;水为纯净水,杭州娃哈哈集团有限公司㊂表1㊀不同产地及不同炮制品的枳实Table1㊀Fructus aurantii from different producing areas and processed products组别枳实品种序号产地批号生产厂家1麸炒枳实S1江西省120121河南省宛西制药股份有限公司2生枳实S2江西省120801江西药都仁和中药饮片有限公司3醋制枳实S3江西省121005无锡江阴天江药业有限公司4酒制枳实S4江西省121005无锡江阴天江药业有限公司5蜜制枳实S5江西省121005无锡江阴天江药业有限公司6生枳实S6四川省120805四川中药厂有限责任公司7麸炒枳实S7四川省121015陕西广济堂中药饮片厂8麸炒枳实S8江西省121109江西樟树天齐堂中药饮片有限公司9麸炒枳实S9四川省120531四川中药厂有限责任公司10生枳实S10四川省120801陕西广济堂中药饮片厂11麸炒枳实S11江西省121005江西樟树天齐堂中药饮片有限公司12麸炒枳实S12江西省120901江西药都仁和中药饮片有限公司13麸炒枳实S13江西省120221河南省宛西制药股份有限公司14麸炒枳实S14江西省130110亳州市永刚饮片厂有限公司2㊀方法与结果2.1㊀色谱条件带有预柱的汉邦Phecda C18色谱柱(150ˑ4.6mm,5μm),流动相为2%乙酸水溶液(A)-甲醇(B);梯度洗脱,洗脱程序:0~10min(5%~15%B,95%~85%A),10~15min (15%~20%B,85%~80%A),15~20min(20%~30%B, 80%~70%A),20~25min(30%~36%B,70%~64%A), 25~40min(36%B,64%A),40~45min(36%~65%B, 64%~35%A),45~50min(65%~80%B,35%~20%A), 50~55min(80%~95%B,20%~5%A),55~60min(95% B,5%A),60~65min(95%~5%B,5%~95%A),65~75min (5%B,95%A);流速1mL㊃min-1;柱温30ħ;检测波长283nm;进样量10μL;分析时间为75min㊂2.2㊀质谱条件电喷雾(ESI)离子源;采用正离子和负离子模式检测;脱气溶剂气流量8L㊃min-1;脱气溶剂温度350ħ;雾化室压力: 30Psig;毛细管电压3.5kV;TOF检测电压120V;捕捉电压65V;每1s采集一次图谱;全扫描(MS scan),质量扫描范围:m/z100~1000;实验数据采用Agilent MassHutter Qualitative Analysis B.04.00质谱工作站软件处理㊂2.3㊀供试品溶液的制备取14份不同的枳实药材适量,采用CW130粉碎机粉碎,在温度为60ħ下烘干㊂分别称取枳实药材粉末约1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加甲醇20mL,用KQ-500VDB型超声波清洗器设置超声提取时间为30min,放冷,过滤,滤液置50mL 容量瓶中,滤渣重复提取1次,合并滤液,定容㊂提取液于高速离心机下16000r㊃min-1离心10min,取上清,进样㊂2.4㊀对照品溶液的制备分别精密称量新橙皮苷㊁橙皮苷㊁柚皮苷对照品适量,用适量甲醇溶解配成浓度约1mg㊃mL-1的储备液,分别稀释至所需的混合对照品储备液㊂-20ħ保存,备用㊂待进液相和质谱㊂2.5㊀测定方法精密量取上述混合供试品溶液和对照品溶液,进样量10μL,分析时间为75min,注入高效液相色谱仪和Agilent 1260高效液相色谱仪配二极管阵列检测器及Agilent6224TOF-LC-MS系统,记录时间为75min色谱图,色谱图见图1和图2,质谱图见图5和图6㊂图1㊀枳实药材供试品的高效液相色谱图Fig.1㊀HPLC of Fructus aurantii第48卷第17期陈鑫,等:枳实药材的色谱-质谱联用指纹图谱59㊀图2㊀对照品指纹图谱Fig.2㊀Reference fingerprint2.6㊀方法学考察[2]2.6.1㊀精密度实验分别吸取同一(本实验选择的编号为S1枳实样品)供试品溶液,连续进样6次,每次进样10μL,记录高效液相色谱图㊂计算相对保留时间和相对峰面积的RSD,结果表明:所有共有峰的相对保留时间的RSD 值小于0.32%,相对峰面积的RSD 值小于1.25%,表明仪器精密度良好㊂2.6.2㊀稳定性实验取同一(本实验选择的编号为S1枳实样品)供试品溶液10μL,分别在0㊁2㊁4㊁8㊁12㊁24h 进样6次㊂计算相对保留时间和相对峰面积的RSD,结果表明:所有共有峰的相对保留时间RSD 值小于0.12%,相对峰面积的RSD 值小于1.53%,表明供试品溶液在24h 内稳定㊂2.6.3㊀重现性实验取同一批枳实(本实验选择的编号为S1枳实样品)6份,按照枳实供试品溶液的制备方法平行制备供试品溶液,记录高效液相色谱图㊂计算相对保留时间和相对峰面积的RSD,结果表明:所有共有峰的相对保留时间的RSD 值小于0.25%,相对峰面积的RSD 值小于2.18%,表明方法重现性良好㊂2.7㊀枳实药材指纹图谱的建立㊁测定及分析[19]2.7.1㊀指纹图谱分析软件的应用按照上述确定的色谱-质谱条件和供试品溶液的制备方法,测定了14批不同产地和不同炮制方法的枳实的色谱质谱联用技术的指纹图谱㊂因图谱中各个物质分离度良好,含量较高,所以选其作为枳实药材质量和活性的指标㊂采用国家药典委编的‘中药色谱指纹图谱相似度评价系统2004A 版“㊂参数设置如下:采用序号S1枳实样品作为相似度计算时校正的参照图谱;选取0.10min 为 时间窗宽度 ;选用多点校正的 校正方式㊂图3㊀14批枳实药材的高效液相指纹重叠图谱(S1~S14代表样品组别从1到14)Fig.3㊀HPLC fingerprinting of 14batches of Fructus aurantii(S1~S14represents sample groups from 1to 14)高效液相色谱指纹图谱的生成:选择编号从S1到S14的共14批枳实药材色谱图生成高效液相色谱重叠图谱见图3,软件生成的对照高效液相色谱-质谱指纹图谱见图4,通过软件就算的相似度计算结果见表3㊂图4㊀软件生成的枳实药材对照指纹图谱Fig.4㊀Software generated fingerprint of Fructusaurantii图5㊀放大的枳实药材总离子流图谱Fig.5㊀Amplified total ion current atlas of Fructusaurantii图6㊀枳实(样品1)总提取物的正离子模式(a)和负离子模式总离子流图(b)Fig.6㊀Total ion pattern (a)and total ion pattern (b)oftotal extract of Fructus aurantii (sample 1)2.7.2㊀共有峰的确定精密量取14批枳实供试品溶液,记录枳实药材总离子流色谱图,通过比对相同保留时间的紫外光谱图,最终选择了60㊀广㊀州㊀化㊀工2020年9月10个特征峰作为指纹图谱的共有峰,见图5㊂经HPLC-ESI/ DAD-TOF-MS检测得到枳实中各化学成分的保留时间和质谱信息,并结合提取离子流图( ESI(+)/DAD-TOF-MS和ESI (-)/DAD-TOF-MS 的质谱总离子流图(TIC),见图(6)及与对照品㊁相关文献数据[20-31]对比,从而对枳实进行化学成分确认,样品中分析鉴定的成分见表2㊂枳实药材的总离子流色谱图中,保留时间为39.886min, 43.696min处出现2个色谱峰,它们具有相同的相对分子质量,但具有不同的保留行为,其提取离子色谱图见图6㊂其中,通过与对照品比对,确定保留时间为39.886min的色谱峰为新橙皮苷,43.696min的色谱峰为橙皮苷㊂其中tR为34.833min的峰在ESI+,ESI-模式下分别得到m/z为581,579的离子峰,其保留时间及质谱行为与柚皮苷对照品相一致,据此确定该化合物为柚皮苷㊂tR为39.886min的峰在ESI+,ESI-模式下分别得到m/z为611,609的离子峰,其保留时间及质谱行为与新橙皮苷对照品相一致,据此确定该化合物为新橙皮苷㊂tR为43.696min的峰在ESI+,ESI-模式下分别得到m/z为611,609的离子峰,其保留时间及质谱行为与橙皮苷对照品相一致,据此确定该化合物为橙皮苷㊂tR为28.886min,相对分子质量596.1736,采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C27H32O15,可知是圣草次苷或新北美圣草苷㊂tR为29.781min,相对分子质量535.1624,采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C22H31O15,可知是苦橙甙(aurantiamar)㊂同时根据已报道的文献,将各物质出峰的先后顺序㊁ESI+, ESI-模式下分别得到m/z等与文献中的信息相比对,以及采用软件处理得到的误差,可以推测tR为26.014min的色谱峰m/z 理论值为178.0266,m/z实测值为178.031,采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C9H6O4,可判断为6,7-二羟基香豆素;tR为46.280min的色谱峰的色谱峰m/z理论值为578.1636,m/z实测值为578.1636,采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C27H30O14,可判断为野漆树苷;tR为48.665min的色谱峰m/z理论值为302.079,m/z实测值为302.0776,采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C16H14O6,可判断为橙皮素;tR为52.277min的色谱峰m/z理论值为342.1103,m/z实测值为342.1099,采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C19H18O6,可判断为3',4',7,8-四甲氧基黄酮;tR为54.696min的色谱峰m/z理论值为388.1158,m/z实测值为388.113,采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C20H20O8,可判断为单羟基五甲氧基黄酮㊂最终选择确定这10个峰作为指纹图谱的共有峰,其中峰1为6,7-二羟基香豆素,峰2为圣草次苷或新北美圣草苷(二者为同分异构体),峰3为苦橙苷,峰4为柚皮苷,峰5为橙皮苷,峰6为新橙皮苷,峰7为野漆树苷,峰8为橙皮素,峰9为3',4',7,8-四甲氧基黄酮,峰10为单羟基五甲氧基黄酮㊂表2㊀枳实提取物的HPLC-ESI/DAD-TOF-MS数据及成分鉴定Table2㊀Identification results of Fructus Aurantii Immaturus by HPLC-ESI/DAD-TOF-MS峰号t R/min实测值m/z理论值m/z误差1ˑ10-6分子式化合物126.014178.031178.0266-24.53C9H6O46,7-二羟基香豆素228.886596.1736596.17410.83C27H32O15圣草次苷/新北美圣草苷329.781535.1624535.16637.24C22H31O15苦橙甙(aurantiamarin) 434.833580.1795580.1792-0.55C27H32O14柚皮苷539.886610.1906610.1898-1.4C28H34O15橙皮苷643.696610.1917610.1898-3.2C28H34O15新橙皮苷746.28578.1636578.1636-0.12C27H30O14野漆树苷848.665302.0776302.079 4.84C16H14O6橙皮素952.277342.1099342.1103 1.21C19H18O63',4',7,8-四甲氧基黄酮1054.696388.113388.11587.2C20H20O8单羟基五甲氧基黄酮2.7.3㊀特征指纹峰的分析㊀表3㊀14批样品相似度评价结果Table3㊀Similarities for fourteen batches of samples批号参照图谱对照图谱110.96520.7500.73930.7950.78040.9240.91450.8950.90660.6860.71270.5600.57280.7560.75090.6960.709100.5890.616110.7400.738120.7380.745130.7380.745140.8580.890㊀㊀采用‘中药色谱指纹图谱相似度计算软件2004A版“对14批枳实的指纹图谱进行分析,14批枳实之间的相似度和生成的对照指纹图谱的相似度如表3所示㊂从表3可以看出, 14批枳实的相似度在0.560~0.958之间,14批枳实药材与生成的对照指纹图谱的相似度在0.572~0.965之间,不同来源㊁不同批次的枳实药材的特征峰峰高有明显的差异,且相似度也有显著的差异㊂3㊀结㊀论本实验首次采用HPLC-DAD/ESI-TOF-MS技术对枳实中的生物碱类和黄酮类成分进行快速分析,根据高分辨质谱获得的母离子信息,结合对照品以及参考文献[20-31],对枳实中多种化学成分进行了鉴定,为该药材的GAP提供参考㊂本实验对枳实药材高效液相指纹图谱的构建进行了探讨,可为枳实药材的品质评价㊁质量标准的制定提供科学的依据㊂在其他条件相同的情况下,不同批次枳实药材提取所得的14批枳实药材醇提液的特征峰高及相似度差异较大㊂因此,采用高效液相指纹图谱技术对枳实的质量控制是极有必要的,可第48卷第17期陈鑫,等:枳实药材的色谱-质谱联用指纹图谱61㊀以采用指定厂家,到符合GAP生产管理规范的基地购买道地枳实药材㊂本方法学建立了枳实药材HPLC-ESI/DAD-TOF-MS 联用色谱技术的高效液相色谱指纹图谱,能更好更全面地控制枳实药材的质量㊂10峰分别体现了枳实药材的特征,不仅为枳实药材的物质基础研究提供了部分依据,也为其整体上进行质量控制奠定了夯实的基础,充分体现了中医临床用药的特色,为延续挖掘传统中药复方的特色提供了有利手段㊂参考文献[1]㊀国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:化学工业出版社,2010:230-231.[2]㊀黄雪丽,陈玉宇.中药枳实的化学成分及分析方法研究进展[J].广州化工,2016,17(44):22-25.[3]㊀陈永刚,林励.柑橘属常用中药黄酮类成分HPLC指纹图谱研究与比较[J].中国中药杂志,2011,36(19):2660-2665.[4]㊀张玲,刘振丽,宋志前.枳实配方颗粒㊁相应饮片及汤剂HPLC图谱对比分析[J].中国中医药信息杂志,2007,14(10):38-39. 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枳实配方颗粒、相应饮片及汤剂HPLC图谱对比分析 【编者按】医药论文是科技论文的一种是用来进行医药科学研究和描述研究成果的论说性文章。

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 枳实配方颗粒、相应饮片及汤剂HPLC图谱对比分析 【摘要】目的考察枳实配方颗粒质量。

方法选用3个批次枳实饮片制备配方颗粒与汤剂。

采用Zobax Extend C18色谱柱,乙腈-水-磷酸-十二烷基硫酸钠(12∶87∶1∶0.2)为流动相,检测波长为275 nm。

结果枳实配方颗粒与相应饮片和汤剂HPLC图谱出峰数量、峰位无差异;配方颗粒与汤剂相应峰的相对峰面积无明显区别,但与饮片有一定差异。

结论HPLC图谱显示枳实配方颗粒与汤剂具有高度的相似性。

 【关键词】枳实;配方颗粒;高效液相色谱法 Abstract：Objective To inspect the quality of Fructus Aurantii Immaturus formula granule. Methods Choose three batch Fructus Aurantii Immaturus to prepare formula granule and decoction. Zobax Extend C18 column was used with acetonitrile-water-phosphoric acid-sodium lauryl sulphate (12∶87∶1∶0.2) as the mobile phase, the detection wavelength was 275 nm. Result There were no differences in elution peak quantity and peak position in the HPLC spectrum of Fructus Aurantii Immaturus formula granule with corresponding cut crude drug and decoction. The relative peak area in the corresponding peak of formula granule had no significant difference with decoction, but had certain differences with cut crude drug. Conclusion HPLC spectrum showed that Fructus Aurantii Immaturus formula granule and decoction had high similarity. Key words：Fructus Aurantii Immaturus;formula granule;HPLC 枳实为常用理气药,具有破气消积、化痰散痞的功效[1],主要含有挥发油、黄酮类和生物碱类化学成分[2]。

枳实总黄酮苷提取物特征图谱研究韦锦宁;程帆;王章伟;刘地发;邱小燕;杨小玲【摘要】目的：研究并建立枳实总黄酮苷提取物的特征图谱测定方法,更好地控制本产品的质量。

方法：采用色谱柱YMC-Pack ODS-A（4.6 mm×250mm,5μm）;流动相乙腈-0.1%磷酸溶液（18∶82,V/V）为高效液相色谱进行等度洗脱;流速1.0m L/min;检测波长283nm;柱温30℃。

结果：通过对11批枳实总黄酮苷提取物特征图谱研究,确定了5个共有峰,并对5个峰进行了指认,分别为新北美圣草苷、柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷。

各样品特征图谱与对照特征图谱的相似度大于0.90。

结论：该方法准确、可靠、耐用性良好,可用于枳实总黄酮苷提取物的质量控制。

【期刊名称】《江西中医药大学学报》【年(卷),期】2016(028)005【总页数】4页(P72-74,87)【关键词】枳实总黄酮苷提取物;特征图谱;高效液相色谱【作者】韦锦宁;程帆;王章伟;刘地发;邱小燕;杨小玲【作者单位】[1]江西青峰药业有限公司,江西赣州341000;[2]创新天然药物与中药注射剂国家重点实验室,江西赣州341000【正文语种】中文【中图分类】R284.1枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果。

5～6月份收集自落的果实，除去杂质，自中部横切为两半，晒干或低温干燥，较小者直接晒干或低温干燥。

具有破气消积，化痰散痞之功效[1]。

在药材来源方面，枳实的产地主要有四川、江西、湖南、福建等地，以江西产枳实为道地药材，且以鹅眼枳实质量最好[2]。

在化学成分方面，现代文献资料显示枳实主要成分为三大类[3]，分别为黄酮类、生物碱类及挥发油类。

药理作用方面，包括对胃肠道的作用、抗氧化作用、抗炎作用、抗菌作用等。

对胃肠道的作用，主要的活性成分为黄酮类和挥发油类[4]。

高效液相色谱法同时测定不同产地枳壳药材中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异柚皮苷的含量杨华;邓义德;胡高云【期刊名称】《中国药业》【年(卷),期】2012(021)022【摘要】Objective To establish a determination method of narirutin, hesperidin, neohesperidin and naringin in Bittet Orange by HPLC. Methods The HPLC method was adopted with the Venusil XBP C18 column (250mm×4. 6 mm,5 μm). The mobile phase was acetonitrile-0. 1% formic acid solution (gradient elution) with the flow rate of 1 mL/min. The detection wavelength was 283 nm and the column temperature was 30 ℃. Results Naringin was linear within 0. 5 - 5 μg, the correlation coefficient r = 0. 999 8, the average recovery rate was 98. 25%. Narirutin was linear within 0.08-2.01 μg.the correlation coefficient r = 0.999 8,the average recovery ratewas 101. 17%. Hesperidin was linear within 0.06-1.2 μg,the correlation coefficient r = 0.999 9,the average recovery rate was 95.42%. Neohesperidin was linear within 0.09-4.82 μg,the correlation coefficient r = 0.999 7, the average recovery rate was 100.95%. Conclusion The method is simple, accurate and reliable, which is suitable for the quality control of medicinal material Bittet Orange.%目的建立同时测定枳壳药材中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异柚皮苷含量的方法.方法采用高效液相色谱法,色谱柱Venusil XBP C18柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),流动相为乙腈-0.1％甲酸(梯度洗脱),检测波长为283 nm,流速为1 mL/min;柱温为30℃.结果柚皮苷进样量在0.5 ～5 μg范围与峰面积线性关系良好,r=0.999 8;异柚皮苷在0.08 ～2.01 μg范围线性良好,r=0.999 8;橙皮苷在0.06 ～1.2 μg范围线性关系良好,r=0.9999;新橙皮苷在0.09～4.82 μg范围线性关系良好,r=0.9997.异柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷平均加样回收率分别为101.17％,98.25％,95.42％和100.95％.结论该方法简便、准确、可靠,适用于枳壳药材质量控制.【总页数】3页(P33-35)【作者】杨华;邓义德;胡高云【作者单位】湖南汉森医药研究有限公司,湖南长沙 410013;湖南汉森医药研究有限公司,湖南长沙 410013;中南大学,湖南长沙 410013【正文语种】中文【中图分类】R284.1;R282.71【相关文献】1.高效液相色谱法同时测定参苏止咳糖浆中葛根素、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷含量 [J], 杨兵2.RP-HPLC法测定不同产地枳实中的柚皮苷、橙皮苷及新橙皮苷 [J], 谢贞建;焦士蓉;李恺;童永鑫3.HPLC同步测定麸炒枳壳配方颗粒特征图谱与柚皮苷橙皮苷新橙皮苷含量 [J], 姚娜; 黄燕明; 李雪银; 陈桂生; 康志英4.不同生长期枳实枳壳中柚皮苷橙皮苷新橙皮苷的含量研究 [J], 康四和;邓海英5.高效液相色谱法测定不同产地枳壳中柚皮苷和新橙皮苷 [J], 杨武亮;杨世林;黄加龙;李霞兰;欧阳辉;刘颖;王少军因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

第48卷第7期2020年4月广　州　化　工Guangzhou Chemical IndustryVol.48No.7Apr.2020枳实药材HPLC-DAD /ESI-TOF-MS 的定性鉴别黄雪丽,陈玉宇,王丽平,孔秀芹(泰州医药高新技术产业园区管理委员会公共平台服务中心,江苏　泰州　225300)摘　要:借助高效液相色谱-高分辨质谱(HPLC-DAD /ESI-TOF-MS)联用技术,对枳实中的有效成分进行初步分析㊂采用汉邦Phecda C 18色谱柱(4.6mm×150mm,5μm),流动相为2%HAC 溶液(A)-甲醇(B)的梯度洗脱;流速1mL㊃min -1;柱温30℃;经柱后分流分别经DAD 检测器及ESI-TOF-MS 正离子和负离子模式采集㊂根据获得的母离子精确相对分子质量信息,结合文献,从枳实药材中鉴定分析了25个成分㊂本方法分离度良好㊁灵敏度高,可用于枳实药材的定性分析,并有助于对该药材的质量控制及深入研究㊂关键词:高效液相色谱-高分辨质谱联用技术;枳实;有效成分　中图分类号:R917　　文献标志码:B文章编号:1001-9677(2020)07-0101-05通讯作者:黄雪丽(1987-),女,主要从事药物质量研究与评价㊂Analysis of Effective Components in Fructus Aurantii Immaturusby HPLC-DAD /ESI-TOF-MSHUANG Xue -li ,CHEN Yu -yu ,WANG Li -ping ,KONG Xiu -qin(The Public Service Platform of Taizhou National Medical Hi-tech Development,Jiangsu Taizhou 225300,China)Abstract :The effective components in Fructus Aurantii Immaturus from different places and their different processed products were identified by HPLC-DAD /ESI-TOF-MS.Separation was performed on a Hanbon C 18column with methanol and water (with 2%HAC)as mobile phase.Based on the high-resolution mass information,MS fragmentation behaviors and chemical components from literatures,25components were identified.This work could be useful for the quality control and further studies of the plant.Key words :HPLC-DAD /ESI-TOF-MS;Fructus Aurantii Immaturus ;effective components枳实为芸香科植物酸橙(Citrus aurantium L .)及其栽培变种或甜橙(Citrus sinensis Osbeck .)的干燥幼果㊂枳实味苦㊁辛㊁酸,微寒㊂具有破气消积,化痰除痞之功效[1]㊂可用于积滞内停,痞满胀痛,泻痢后重,大便不通,痰滞气阻,胸痹,结胸,脏器下垂等㊂为血分中之气药,惟此称最㊂枳实的化学成分主要为生物碱和黄酮类两类物质㊂据现有文献报道的枳实的化学成分分析方法有HPLC 和HPLC-MS 联用等㊂由于生物碱类和黄酮类等对照品难于获得,所以在无法获得对照品的情况下,利用相对保留值进行定位显得必要㊂本实验首次采用HPLC-DAD /ESI-TOF-MS 技术对枳实中的生物碱类和黄酮类成分进行快速分析,根据高分辨质谱获得的母离子信息,结合对照品以及参考文献[2-14],对枳实中多种化学成分进行了鉴定,为该药材的GAP 提供参考㊂1　仪器与材料Agilent 1260高效液相色谱仪配PDA 检测器,美国Agilent;Agilent 6224TOF -LC -MS 系统,配备ESI 源;Agilent MassHutter Qualitative Analysis B.04.00质谱工作站;AnkeTGL-16B高速离心机,上海安亭科学仪器厂;KQ 3200E 型超声波清洗器,昆山市超声仪器有限公司;AB135-S 分析天平,美国梅特勒-托利多仪器有限公司;高速多功能粉碎机,上海冰都电器有限公司㊂枳实炮制品分别购自河南宛西制药㊁河南省弘景中药饮片㊁四川科伦天然药业㊁江西樟树天齐堂中药饮片㊁亳州市永刚饮片等公司,经中国药科大学中药学院秦民坚教授鉴定为芸香科植物酸橙(Citrus aurantium L .)及其栽培变种或甜橙(Citrus sinensis Osbeck .)的干燥幼果,样本现保存于中国药科大学药学院㊂枳实炮制品如表1所示㊂对照品:柚皮苷(批号:12030612),成都曼斯特生物科技有限公司;橙皮苷(批号:12020304),成都曼斯特生物科技有限公司;新橙皮苷(批号:12030701),成都曼斯特生物科技有限公司,纯度均≥98%㊂试剂:甲醇(特级纯),江苏汉邦科技有限公司;乙酸(分析纯),南京化学试剂有限公司;乙醇(分析纯),江苏强盛功能化学股份有限公司;纯净水,杭州娃哈哈集团有限公司㊂102　广　州　化　工2020年4月表1　不同产地及不同炮制品的枳实Table1　Fructus aurantii from different producing areas and processed products样品编号枳实品种产地批号生产厂家1麸炒枳实江西120121河南省宛西制药股份有限公司2生枳实江西120801江西药都仁和中药饮片有限公司3醋制枳实江西121005河南省弘景中药饮片有限公司4酒制枳实江西121005河南省弘景中药饮片有限公司5蜜制枳实江西121005河南省弘景中药饮片有限公司6生枳实四川120905四川科伦天然药业有限公司7麸炒枳实四川121001成都吉安康药业有限公司8麸炒枳实江西121109江西樟树天齐堂中药饮片有限公司9麸炒枳实江西130110亳州市永刚饮片厂有限公司2　方　法2.1　溶液的制备2.1.1　供试品溶液的制备　分别取9份不同编号枳实药材样品适量,高速多功能粉碎机粉碎,60℃烘干㊂分别称取枳实药材粉末约1g,精密称定,置具塞锥形瓶中,加甲醇20mL,放置超声波清洗器超声提取30min,放冷,过滤,滤液置50mL量瓶中,滤渣重复提取1次,合并滤液,定容㊂提取液于高速离心机16000r㊃min-1离心10min,取上清,进样㊂2.1.2　对照品溶液的制备分别精密称量新橙皮苷㊁橙皮苷㊁柚皮苷对照品适量,甲醇溶解配成浓度约1mg㊃mL-1的储备液,分别稀释制得含新橙皮苷203.00μg㊃mL-1㊁橙皮苷130.75μg㊃mL-1㊁柚皮苷326.75μg㊃mL-1的混合对照品储备液㊂-20℃保存,备用㊂2.2　色谱条件汉邦Phecda C18色谱柱(4.6mm×150mm,5μm);流动相为2%乙酸水溶液(A)-甲醇(B);流速1mL㊃min-1;柱温30℃;进样量10μL;梯度洗脱程序,总洗脱时间为75min㊂梯度洗脱条件为:0~10min(5%~15%B),10~15min (15%~20%B),15~20min(20%~30%B),20~25min (30%~36%B),25~40min(36%B),40~45min(36%~ 65%B),45~50min(65%~80%B),50~55min(80%~95% B),55~60min(95%B),60~65min(95%~5%B),65~ 75min(5%B)㊂2.3　质谱条件电喷雾(ESI)离子源;采用分别正离子和负离子模式检测;毛细管电压3.5kV;TOF检测电压120V;捕捉电压65V;脱气溶剂气流量8L㊃min-1;脱气溶剂温度350℃;雾化室压力: 30Psig;每1s采集一次图谱;全扫描(MS scan),质量扫描范围:100~1000m/z;实验数据采用Agilent MassHutter Qualitative Analysis B.04.00质谱工作站软件处理㊂3　结　果3.1　HPLC-ESI/DAD-TOF-MS成分鉴定采用HPLC-ESI/DAD-TOF-MS对枳实提取液中化学成分进行定性分析,对照品图谱见图1,枳实的ESI(+)/DAD-TOF-MS和ESI(-)/DAD-TOF-MS的质谱总离子流图见图2和图3㊂图1　对照品HPLC色谱图Fig.1　HPLC chromatogram of thereference图2　枳实(样品1)总提取物的正离子模式总离子流图Fig.2　Mass spectrometry total ion chromatogram(TIC)of Positive ion mode of total extract of Fructus AurantiiImmaturus图3　枳实总提取物负离子模式总离子流图Fig.3　Mass spectrometry total ion chromatogram(TIC)of negative ion mode of total extract of Fructus Aurantii Immaturus3.2　枳实化学成分分析通过HPLC-ESI/DAD-TOF-MS检测得到枳实中各化学成分的保留时间和质谱信息,并结合提取离子流图及与对照品㊁相关文献数据对比,从而对枳实进行化学成分确认,样品1中分析鉴定的成分见表2㊂第48卷第7期黄雪丽,等:枳实药材HPLC-DAD/ESI-TOF-MS的定性鉴别103表2　枳实提取物的HPLC-ESI/DAD-TOF-MS数据及成分鉴定Table2　Identification results of Fructus Aurantii Immaturus by HPLC-ESI/DAD-TOF-MS峰号T R/min实测值m/z理论值m/z误差1×10-6分子式化合物12.116372.1246372.1209-9.87C20H20O7酸橙素/异橙黄酮/桔皮晶/苦橙丁26.589360.0799360.077218.44C18H16O8迷迭香素320.968529.1819529.1815-0.73C30H27NO8Acrimarine C/Acrimarine E 425.772594.158594.15850.75C27H30O15忍冬苷/忍冬苦苷526.014178.031178.0266-24.53C9H6O46,7-二羟基香豆素628.886596.1736596.17410.83C27H32O15圣草次苷/新北美圣草苷729.781535.1624535.16637.24C22H31O15苦橙甙(aurantiamarin) 834.833580.1795580.1792-0.55C27H32O14柚皮苷937.534272.0685272.0685-0.18C15H12O5柚皮素1039.886610.1906610.1898-1.4C28H34O15橙皮苷1143.696610.1917610.1898-3.2C28H34O15新橙皮苷1246.28578.1636578.1636-0.12C27H30O14野漆树苷1346.38543.1798543.18153.12C31H29NO8Acrimarine B1447.109202.0262202.02662.14C11H6O4花椒毒酚1547.987470.1855470.18621.54C26H30O8柠檬苦素1648.004594.1964594.1949-2.56C28H34O14枸橘柑/异樱花素-7-芸香糖苷1748.086464.2387464.2336-0.94C21H20O12槲皮素-3-O-葡萄糖苷1848.665302.0776302.0794.84C16H14O6橙皮素1950.289332.1644332.1624-6.04C19H25O5马曼2050.787169.072169.073911.07C8H11NO3去甲肾上腺素2151.383372.1203372.12091.56C20H20O7酸橙素/异橙黄酮/桔皮晶/苦橙丁2252.277342.1099342.11031.21C19H18O63′,4′,7,8-四甲氧基黄酮2354.696388.113388.11587.2C20H20O8单羟基五甲氧基黄酮2454.845286.108286.1079-0.23C16H14O5异樱花素2556.303270.0489270.052814.62C15H10O5芹菜素3.3　枳实化学成分的定性鉴别枳实药材的总离子流色谱图中,保留时间为39.886min, 43.696min处出现2个色谱峰,它们具有相同的相对分子质量,但具有不同的保留行为,其提取离子色谱图见图1㊂其中,通过与对照品比对,确定保留时间为39.886min的色谱峰为新橙皮苷,43.696min的色谱峰为橙皮苷㊂其中t R为34.833min的峰在ESI+,ESI-模式下分别得到m/z为581,579的离子峰,其保留时间及质谱行为与柚皮苷对照品相一致,据此确定该化合物为柚皮苷㊂t R为39.886min的峰在ESI+,ESI-模式下分别得到m/z为611,609的离子峰,其保留时间及质谱行为与新橙皮苷对照品相一致,据此确定该化合物为新橙皮苷㊂t R为43.696min的峰在ESI+,ESI-模式下分别得到m/z为611,609的离子峰,其保留时间及质谱行为与橙皮苷对照品相一致,据此确定该化合物为橙皮苷㊂t R为2.116min和51.383min,它们具有相同的分子量,可能是酸橙素/异橙黄酮/桔皮晶/苦橙丁这四种物质之一,还有待进一步鉴别㊂同理,t R为20.968min,它们具有相同的相对分子质量,可能是Acrimarine C或Acrimarine E,Acrimarine C/Acrimarine E 这两种物质是同分异构体,需做进一步鉴别㊂t R为25.772min,相对分子质量为594.1585,采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C27H30O15,可知是忍冬苷或忍冬苦苷㊂t R为28.886min,相对分子质量596.1736,采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C27H32O15,可知是圣草次苷/新北美圣草苷,可进一步做定性鉴别,判断属于哪种物质㊂t R为48.004min,相对分子质量为594.1964,采用Mass Hunter B.04软件处理得到分子式为C28H34O14,可知是枸橘柑或异樱花素-7-芸香糖苷,可进一步做定性鉴别,判断属于哪种物质㊂同时根据已报道的文献[2-7],将各物质出峰的先后顺序㊁ESI+,ESI-模式下分别得到m/z等与文献中的信息相比对,可以推测t R为6.589min的色谱峰为迷迭香素;t R为26.014min 的色谱峰为6,7-二羟基香豆素;t R为37.534min的色谱峰为柚皮素;t R为46.280min的色谱峰为野漆树苷;t R为46.380min 的色谱峰为Acrimarine B;t R为47.109min的色谱峰为花椒毒酚;t R为47.987min的色谱峰为柠檬苦素;t R为48.086min的色谱峰为槲皮素-3-O-葡萄糖苷;t R为48.665min的色谱峰为橙皮素;t R为50.289min的色谱峰为马曼;t R为50.787min的色谱峰为去甲肾上腺素;t R为52.277min的色谱峰为3′,4′,7,8-四甲氧基黄酮;t R为54.696min的色谱峰为单羟基五甲氧基黄酮;t R为54.845min的色谱峰为异樱花素;t R为56.303min的色谱峰为芹菜素㊂从九个样品定性分析结果中可以看出,不同产地不同炮制品中同种物质的成分含量有显著的差别;且同种产地中不同炮制品种不仅成分种类有差别,而且的含量也有差别,所以造成了临床用药的不科学性,以及临床疗效的差别,因此加强中药的临床用药规范尤为重要㊂4　讨　论4.1　柱温的选择本实验考察了不同温度下,色谱的分离情况㊂在25℃㊁30℃㊁35℃的柱温条件下的色谱分离情况,如图4所示㊂柱温越高,物质出峰时间越短㊂当柱温为25℃时,分离度较差,目标峰(1-柚皮苷;2-橙皮苷;3-新橙皮苷)与后面物质的峰拥挤到一起,没有达到良好的分离效果;当柱温为30℃和35℃时,对分离影响不大且升高柱温不利于柱子的保护㊂结果显示在30℃下,各成分分离良好,达到定量测定要求,故选择30℃为色谱分析温度㊂图4　柱温的选择Fig.4　Optimization of column temperature4.2　流动相的选择图5　流动相中水相 甲酸和乙酸的优化Fig.5　Optimization of the aqueous phase in the mobilephase (formic acid and aceticacid)图6　流动相中水相 乙酸百分数的优化Fig.6　Optimization of the aqueous phase in the mobilephase (the percentage of acetic acid)本文考察了不同浓度(0.05%㊁0.1%㊁1%㊁2%)的乙酸溶液和甲酸(0.05%㊁0.1%㊁1%)溶液,实验结果表明,在2%HAC 水溶液下,分离效果最佳,故本实验采用2%HAC 为流动相,如图5和图6所示㊂4.3　枳实成分结果分析枳实药材中的主要化学成分主要有2类:生物碱类和黄酮类,它们在正离子模式下容易形成[M]+和[M+H]+母离子峰,且还有的形成[M+Na]+和[M+K]+峰;在负离子模式下容易形成[M]+和[M -H]-母离子峰,且还易形成[M -Cl]-和[M -CH 3COOH]-峰㊂从HPLC-ESI /DAD-TOF-MS 正㊁负离子模式图中能看出,黄酮类物质虽然在正离子条件下也有响应,但是负离子模式下更容易形成,信号较强㊂黄酮类物质在负离子条件下有稳定的苯酚离子形成,而在正离子条件下,噪音的水平相对来说比较高,且有些片断在正离子模式下消失不见㊂这是由于黄酮类物质不能容纳氮原子,在液相中呈现低碱性,因而在正离子模式下,黄酮类的阳离子片断信号相对较弱㊂而生物碱类在正离子模式下产生较丰富的信息㊂所以对黄酮类物质进行分析时,可采用负离子模式,而生物碱类物质可以采用正离子模式㊂5　结　论本研究利用HPLC-ESI /DAD-TOF-MS 分析了中药枳实中的多种生物碱和黄酮类成分㊂根据高分辨质谱获得的精确分子量信息,依据已有文献,在缺乏对照品确认的情况下快速㊁准确地分析化学成分㊂采用正㊁负离子监测模式的质谱扫描功能,通过高分辨数据共鉴定了25个成分,包括黄酮苷元类㊁黄酮氧苷类㊁生物碱等成分㊂本实验建立了一种色谱-质谱联用的方法,同时鉴别了多种黄酮类和生物碱以及其对应的异构体,这有助于枳实的后续化学成分及其药效物质基础的研究㊂参考文献[1]　张尚英.枳实㊁枳壳类药材质量分析的新进展[J].海峡药学,2004,16(5):13-14.[2]　郭戎,束艳,张丽.四逆散化学成分的UPLC-ESI /MS 分析[J].中国中药杂志,2011,22(36):3114-3118.[3]　乔颖,温静,宋洋.基于UPLC-PDA-MS /MS 技术的四逆散水煎液体内外物质基础研究[J].中国中药杂志,2012,37(11):1672-1676.[4]　贾强,白杨,马燕,等.枳壳和枳实化学成分的HPLC-ESI-MS 分析[J].中草药,2005,25(2):169-172.[5]　王淳.不同品种产地积实有效成分的对比分析[D].中国中医科学院,2009.[6]　LIU Wen-Yuan,ZHOU Chen,YAN Cui-Min,et al.Characterizationand simultaneous quantification of multiple constituents in Aurantii Fructus Immaturus extracts by HPLC-DAD-ESI-MS /MS[J].Chinese Journal of Natural Medicines,2012,10(6):456-463.[7]　黄雪丽,陈玉宇,尧爱珉,等.HPLC 法测定枳实不同炮制品中有效成分的含量[J].广州化工,2013,41(9):149-151.[8]　Hai -Yan Zhao,Li Yang,Jian Wei,et al.Bioactivity evaluations ofingredients extracted from the flowers of Citrus aurantium L.var.amara Engl[J].Food Chemistry,2012,135(4):2175-2181.[9]　Ikram Moulehi,Soumaya Bourgou,Ines Ourghemmi et al.Variety andripening impact on phenolic composition and antioxidant activity of mandarin (Citrus reticulate Blanco )and bitter orange (Citrus aurantium L.)seeds extracts[J].Industrial Crops and Products,2012,39:74-80.(下转第168页)管理方法,为大学生科技创新㊁技能竞赛㊁课程设计㊁毕业设计等实践课程提供良好的平台㊂(4)深化校企合作,建立高效产学研机制环境工程专业的发展与社会经济发展和相关产业的密切相关㊂学院领导及学科专业教学团队应重视校企合作建设,一方面,要重视扩展环保公司和其他相关生产实习单位的数量,拓展项目教学的资源和渠道;另一方面,深化校企合作,与国内多家有实力的环保公司㊁企业等建立教学科研合作,加强教学实习基地建设,让学生深入参与到实际的工程或科研项目中,学生将受益匪浅,增强学生的实践能力㊁接触社会的机会,全面提高综合素质㊂(5)实践教学评价机制的建立和完善通过实践应用,全方位对学生进行工程实践能力的培养,探索校企联合评价教学的新途径与新方法,制定一套有效的工程实践能力培养质量标准,注重各项指标的执行情况,对新的培养模式和原有的培养模式进行对比分析,对新的培养模式进行全面评价㊂如实验教学项目,要结合行业要求开展考核,按实验项目㊁实验课程㊁实验体系三个层次对学生进行环境工程技术技能掌握质量进行系统评估,通过各项技术指标的分析,深入探讨具体实验教学内容㊁组织方式㊁教学过程各环节对学生实验技能掌握的影响,评判各实验项目的难易程度,综合评价实验教学全过程与目标技能掌握的科学关系,提出下一轮实验教学内容㊁组织方式㊁过程控制㊁考核体系的修订方案㊂3　结　语互联网+”㊁大数据㊁物联网㊁人工智能㊁绿色经济等成为人们生活新常态,新工科教育顺应而为,引领学科发展㊂作为工程技术人才培养的主阵地,许多高校积极进行着教学改革,以更好的服务新经济㊂实践教学作为环境工程专业的重要组成部分,对全面提高我国工程教育人才培养质量具有重要的意义㊂各个高校应结合实际,积极进行探索符合新工科建设的实践教学体系,共建产㊁政㊁学㊁研平台,以提高学生的工程实践能力,为培养高质量人才,实现立德树人的根本任务奠定坚实的基础㊂参考文献[1]　陈欣然.新工科: 卓越计划2.0”的催化剂 记天津大学工程教育改革与实践[J].中国教育报,2019(6):1-2.[2]　胡天觉,曾光明,汤琳,等.新兴产业发展时代环境科学专业特色的建设理论与实践[J].高教学刊,2017(17):1-4.[3]　苏文辉,郑丽霜,李芳.应用型本科高校环境工程专业实践教学体系的改革与探讨[J].高教学刊,2019(4):127-129.[4]　马万征,谢越,李孝良,等.新工科背景下符合专业认证的环境类专业人才培养方案的研究[J].高教学刊,2018(21):155-160. [5]　王龙飞,李轶,牛丽华.新工科建设背景下环境工程概论教学模式改革研究[J].教育现代化,2018,5(41):15-17.[6]　马宏卿,李宝.地方高校工科专业课程教学模式改革研究 以临沂大学‘大气污染控制工程“为例[J].高教学刊,2019(9):132-134.[7]　张明芳.数字环保特色型环境工程专业人才培养体系改革研究[J].教育教学论坛,2018,12(51):32-33.[8]　陈永志,白圆,李健,等.环境工程专业生产实习的主要问题及对策研究[J].教育教学论坛,2019(15):47-48.(上接第104页)[10]Sanggon Leea,Jehyeon Rab,Ju-Young Songa,et al.Extracts fromCitrus unshiu promote immune-mediated inhibition of tumor growth in a murine renal cell carcinoma model[J].Journal of Ethnopharmacology, 2011,133:973-979.[11]Hae Gyeong Kim,Gon-Sup Kim,Semin Park,et al.Flavonoidprofiling in three citrus varieties native to the Republic of Korea using liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry: contribution to overall antioxidant activity[J].Biomed.Chromatogr., 2012,26:464-470.[12]Evelyn Chizzali,Ivo Nischang,Markus Ganzera.Separation ofadrenergic amines in Citrus aurantium L.var.amara by capillary electrochromatography using a novel monolithic stationary phase[J].J.Sep.Sci.,2011,34:2301-2304.[13]Dongxiu He,Yang Sha,Yuehui Wu,et al.Simultaneous determinationof flavanones,hydroxycinnamic acids and alkaloids in citrus fruits by HPLC-DAD-ESI/MS[J].Food Chemistry,2011,127:880-885. [14]Xian-guo He,Li-zhi Lian,Long-ze Lin,et al.High-performanceliquid chromatography-electrospray mass spectrometry in phytochemical analysis of sour orange(Citrus aurantium L.)[J].Journal of Chromatography A.,1997,791:127-134.[15]Rita Gatti,Cinzia Lotti,Rita Morigi,et al.Determination ofoctopamine and tyramine traces in dietary supplements and phytoextracts by high performance liquid chromatography after derivatization with2,5-dimethyl-1H-pyrrole-3,4-dicarbaldehyde[J].Journal of Chromatography A,2012,1220:92-100.。

高效液相色谱法同时测定枳壳饮片中4种黄酮类化合物的含量张宏武;封宇飞;邹忠梅【期刊名称】《中国新药杂志》【年(卷),期】2008(17)18【摘要】目的:建立高效液相色谱法测定枳壳饮片中柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的含量.方法:采用Sunfire C18色谱柱(150 mm×4.6 mm,5μm),以乙腈-0.1%磷酸溶液(20:80)为流动相,流速为1 mL·min-1,检测波长为283 nm,柱温为30℃.结果:柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷分别在0.074～123.7,0.60～999.0,0.072～120.3和0.59～982.0μg·mL-1范围内线性良好,其平均回收率分别为96.6%,96.1%,96.0%和97.2%.结论:该方法简便、快速、准确、重复性好,可用于枳壳中柚皮芸香苷、柚皮苷、橙皮苷和新橙皮苷的同时测定.【总页数】4页(P1600-1602,1621)【作者】张宏武;封宇飞;邹忠梅【作者单位】中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京,100094;中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京,100094;中国医学科学院北京协和医学院药用植物研究所,北京,100094【正文语种】中文【中图分类】R927.2【相关文献】1.HPLC测定枳壳饮片中柚皮苷的含量 [J], 江波;石典花;袁振海;孙立立2.高效液相色谱法同时测定不同产地枳壳药材中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、异柚皮苷的含量 [J], 杨华;邓义德;胡高云3.高效液相色谱法测定金果饮咽喉片中橙皮苷含量 [J], 胡婷霞;祝明4.反相高效液相色谱法测定枳实、枳壳中橙皮甙和柚皮甙的含量 [J], 李秀玲;李龙;肖红斌;梁鑫淼5.高效液相色谱法测定枳壳中新橙皮苷的含量 [J], 杨武亮;余世平;杨世林;任燕冬;李越峰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

枳实提取物中类黄酮的高效液相色谱法测定及其抗氧化作用研究【摘要】目的建立了枳实中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、芦丁、槲皮素含量的测定方法，同时测定了枳实提取物的抗氧化作用。

方法采用HPLC法，色谱柱：Phenomenex Gemini C18柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)，柱温37℃，流动相为乙腈-磷酸溶液，检测波长280，365 nm，流速1.0 ml/min 。

采用DPPH·测定枳实提取物的自由基清除能力。

结果进样量范围：柚皮苷为1.143～5.717 μg，橙皮苷为0.092～0.459 μg，新橙皮苷为1.179～5.895 μg，芦丁为0.024～0.118 μg，槲皮素为0.079～0.395 μg。

柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷的平均回收率分别为99.604%，100.150%，100.249%。

RSD分别为0.515%，4.390%，0.774%。

枳实提取物对DPPH・清除作用是柚皮苷的17.6倍。

结论HPLC测定法简便、准确，可用于测定枳实类黄酮含量，同时枳实提取物具有较强的自由基清除作用。

【关键词】枳实；类黄酮；高效液相色谱法；抗氧化作用Abstract：ObjectiveTo establish an HPLC method for determination of naringin， hesperidin， neohesperidin， rutin and quercetin in Citrus aurantium L.， and to study antioxidant activity .MethodsThe samples were extracted with ethanol. The chromatographic conditions were as follows: Phenomenex Gemini C18 column (150 mm×4.6 mm，5μm)， column temperature at 37℃， mobile phase of acetonitrile-phosphate solution，detection wavelength at 280nm or 365nm， flow rate 1.0ml/min. In addition， DPPH radical-scavenging was employed to measure antioxidant activities. ResultsThe calibration curves were linear in the range of 1.143～5.717μg for naringin， 0.092～0.459μg for hesperidin， 1.179～5.895μg for neohesperidin， 0.024～0.118μg for rutin and 0.079～0.395μg for quercetin. The average recoveries of naringin，hesperidin， neohesperidin were 99.604%， 100.150% and 100.249% respectively. RSD were 0.515%， 4.390% and 0.774% respectively. The DPPH radical scavenging activity of C. aurantium L. flavoniods was 17.6 times of naringin. ConclusionThe method is simple， accurate for detecting flavoniods in C. aurantium L.， and the C.aurantium L .extract has antioxidant activities.Key words：Citrus aurantium L. ； Flavoniods ; High performance liquid chromatography; Antioxidant activity枳实为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙Citrus sinensis Osbeck的干燥幼果，具有破气除痞、化痰消积的功效，是中医临床常用药物［1］。

临床医药文献电子杂志Electronic Journal of Clinical Medical Literature 2019 年第 6 卷第 29 期2019 Vol.6 No.29172・药物研究・不同产地枳壳高效液相色谱法检测分析蒋朋，李阳希（马应龙药业集团股份有限公司，湖北武汉 430070）【摘要】目的 分析高效液相色谱法对不同产地枳壳检测结果。

方法 选取江西、湖南、浙江、重庆出产的枳壳采用高效液相色谱法进行柚皮苷、新橙皮苷含量及性状鉴定质量优劣进行检测，记录检测结果。

结果 除湖南沅江枳壳的性状鉴定质量较差外，其他产地的枳壳性状鉴定质量均较好，且柚皮苷、新橙皮苷含量均达到《中国药2015年版》规定标准。

结论 不同产地的枳壳质量有所差异，高效液相色谱法能准确检测枳壳中成分含量，对枳壳质量控制有重要作用。

【关键词】高效液相色谱法；柚皮苷；不同产地；新橙皮苷；枳壳【中图分类号】R284 【文献标识码】A 【文章编号】ISSN.2095-8242.2019.29.172.01枳壳是临床使用频率较高的中药材，主要用于呕逆、胸膈痰滞、子宫脱垂、胸痞、食积、脱肛等疾病的治疗[1]。

2015年颁布的《中国药典》提出采用高效液相色谱法检测柚皮含量控制枳壳质量，但是随着临床长期研究发现，柑橘属中很多植物果实中均含有柚皮苷，但是不含有新橙皮苷，不能准确判定枳壳质量。

本文就高效液相色谱法对不同产地枳壳检测结果进行分析，为枳壳的选择提供借鉴经验，提高枳壳质量，内容如下。

1 试药仪器与方法1.1 试药仪器试药：乙腈（分析纯）、水（重蒸水）；柚皮苷及新橙皮苷对照品从中国药品生物制品检定所购买，枳壳药材产地包括江西（樟树、新干、樟树吴城乡）、湖南（怀化、阮江）、浙江兰溪、重庆（綦江县、江津县）。

仪器：安捷伦公司提供的安捷伦1200高效液相色谱仪及色谱工作站，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司提供的电子天平。

1.2 检测方法供试品溶液制备：精密称取枳壳粉末0.5 g放于100 mL 圆底烧瓶，加入甲醇25 mL，水浴回流提取90 min，然后滤过，将滤液放于50 mL量瓶，残渣用甲醇10 mL连续提取2次，每次10 min。

HPLC法测定枳实不同炮制品中有效成分的含量黄雪丽;陈玉宇;尧爱珉;冯芳【摘要】建立了同时测定枳实有效成分的HPLC法:汉邦Phecda C18色谱柱(4.6 mm× 150 mm,5μm),流动相为2％ HAC溶液(A)-甲醇(B)的梯度洗脱；流速1 mL· min-1;柱温30℃；检测波长283nm.结果表明:各物质的分离度良好,可用于测定枳实不同炮制品的含量.该方法简便、准确、可靠、重复性好,可用于枳实药材的质量控制,为该药的质量评价提供依据.【期刊名称】《广州化工》【年(卷),期】2013(041)009【总页数】3页(P141-143)【关键词】枳实;炮制品;HPLC【作者】黄雪丽;陈玉宇;尧爱珉;冯芳【作者单位】中国药科大学药物分析教研室,江苏南京210009;中国药科大学药物分析教研室,江苏南京210009;中国药科大学药物分析教研室,江苏南京210009;中国药科大学药物分析教研室,江苏南京210009【正文语种】中文【中图分类】R917枳实为芸香科植物酸橙 (Citrus aurantium L.)及其栽培变种或甜橙 (Citrus sinensis Osbeck.)的干燥幼果［1］，具有破气消积，化痰散痞之功效。

枳实历代有炒炭、麸炒、土炒、姜炙、酒炙、醋炙、蜜炙、蒸制等多种炮制方法［2］，2010版中国药典中仅收载了麸炒枳实［1］。

枳实的主要成分为黄酮类、挥发油以及生物碱。

其中柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷等黄酮类［5－6］最能体现枳实特征，是枳实理气、行滞、平喘、抗炎、抗氧化和抗过敏的重要活性成分［4］。

本研究拟用RP－HPLC法对枳实不同炮制品及不同产地药材［3］中三种黄酮类物质［7－9］同时进行测定，比较它们的含量［3］，探讨不同炮制方法的合理性和科学性以及比较不同产地药材质量，为该药的合理应用提供依据。

1 仪器与材料1.1 仪器Shimadazum LC－10Advp高效液相系统，DGU－20A3真空脱气机，Sil－20AC自动进样器，CTO－10ASvp柱温箱，Shimadazum LC－10Advp高效液相系统，DGU－20A3真空脱气机，Sil－20AC自动进样器，CTO－10ASvp柱温箱，紫外检测器SPD－10Avp，LC－Solution工作站;AB135－S分析天平，美国梅特勒－托利多仪器有限公司;KQ3200E型超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司;TGL－16B型台式高速离心机，上海安亭科学仪器厂。