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生物化学与基础分子生物学实验本实验旨在增进学生对于生物化学与基础分子生物学知识的理解，同时也希望借此机会增强学生的实验动手能力和实验数据分析能力。
本实验主要分为两部分，第一部分是生物化学实验，主要包括蛋白质的提取、纯化和酶促反应的研究。
第二部分是基础分子生物学实验，主要涉及DNA的提取、PCR扩增和凝胶电泳检测等。
一、生物化学实验1. 蛋白质的提取蛋白质的提取是研究蛋白质功能和结构的基础。
常用的蛋白质提取方法有机械破碎法、化学破碎法和生物学破碎法等。
本实验以细胞生物学破碎法为主要方法，即利用超声波或手工研磨等方法将细胞破碎。
其中，手工研磨可以选择石英砂或三氧化二铬等研磨介质。
破碎过程中需加入适量浓度等渗液和抑制剂，以防止蛋白质的降解和氧化。
2. 蛋白质的纯化蛋白质的纯化是进一步研究蛋白质结构和功能的关键。
常用的蛋白质纯化方法包括离子交换、凝胶过滤、透析、亲和层析和电泳等方法。
本实验以离子交换和凝胶过滤为主要方法。
其中，离子交换可利用正离子交换和负离子交换两种模式进行，考虑到蛋白质电荷状态的不同以及离子交换树脂的不同选择，从而使得目标蛋白质与其它蛋白质的区分度大大增加。
凝胶过滤则利用凝胶的孔径大小进行分离纯化。
3. 酶促反应的研究酶促反应是生物化学研究的重要组成部分，可以研究酶的特性、动力学以及酶对于特定底物和抑制剂的亲和性等。
本实验选择酶促细胞色素C氧化为模型反应。
反应中需要考虑诸多因素，如温度、pH、反应时间等，同时还需考虑反应体系中酶、底物和抑制剂的摩尔比例关系。
二、基础分子生物学实验1. DNA的提取DNA的提取是基础分子生物学实验的关键步骤，其目的是提高纯度和量。
常用的DNA提取方法有化学法、机械法、热平衡法和离心法等。
本实验以盐酸摇法为主要方法进行DNA的提取。
其中将细胞经过适当处理后加入盐酸和β-己糖苷酯，在恒温和摇动条件下分离得到DNA。
2. PCR扩增PCR是分子生物学中的核心技术之一，是一种复合酶链反应。
一、实验目的1. 学习蛋白质的提取方法。
2. 掌握肽的提取和纯化技术。
3. 了解肽的结构和性质。
二、实验原理蛋白质是由氨基酸组成的大分子化合物，肽是蛋白质的水解产物。
蛋白质在特定的条件下可以发生水解反应，生成肽。
本实验通过酸水解法提取肽，并对其结构、性质进行初步分析。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：牛血清蛋白、盐酸、氢氧化钠、乙醚、无水乙醇、正己烷、苯酚、硫酸铜、氯仿等。
2. 仪器：分析天平、恒温水浴锅、磁力搅拌器、离心机、紫外-可见分光光度计、氨基酸分析仪等。
四、实验步骤1. 蛋白质溶液的制备：将牛血清蛋白溶解于0.1mol/L盐酸溶液中，浓度为1mg/mL。
2. 酸水解：将蛋白质溶液置于恒温水浴锅中，在100℃下加热1小时，使蛋白质发生水解反应。
3. 调节pH值：将酸水解后的溶液用氢氧化钠溶液调节至pH值为7.0。
4. 醇沉：向调节pH值后的溶液中加入无水乙醇，使蛋白质沉淀。
静置30分钟，离心分离。
5. 透析：将沉淀物溶解于水中，进行透析，去除小分子杂质。
6. 脱色：向透析后的溶液中加入苯酚和氯仿，进行脱色处理。
7. 纯化：将脱色后的溶液用硫酸铜溶液处理，使肽与铜离子形成络合物。
静置30分钟，离心分离。
8. 脱铜：将沉淀物溶解于水中，加入氢氧化钠溶液，使肽与铜离子分离。
9. 测定肽含量：采用紫外-可见分光光度计测定肽溶液的吸光度，计算肽含量。
10. 氨基酸分析：采用氨基酸分析仪对肽进行氨基酸组成分析。
五、实验结果与分析1. 肽提取：通过酸水解法，成功提取了肽。
经透析和醇沉处理后，肽的纯度较高。
2. 肽性质：通过紫外-可见分光光度计测定，肽溶液在特定波长下有明显的吸收峰，表明肽具有特定的结构和性质。
3. 氨基酸组成：氨基酸分析仪分析结果显示，肽中含有多种氨基酸，与牛血清蛋白的氨基酸组成基本一致。
六、实验讨论1. 酸水解法提取肽是一种简单、有效的实验方法，但需要注意的是，水解过程中温度和时间的选择对肽的提取效果有较大影响。
第1篇实验名称：鱼类蛋白提纯实验实验目的：1. 熟悉鱼类蛋白提取的基本原理和方法。
2. 掌握鱼类蛋白粗提、纯化和鉴定等实验技术。
3. 了解蛋白质在不同溶剂中的溶解性差异，以及盐析、透析等纯化方法的原理和应用。
实验原理：蛋白质是生物体内重要的生物大分子，具有多种生物学功能。
鱼类蛋白提取是研究蛋白质结构和功能的重要步骤。
本实验通过使用不同的提取方法和纯化技术，从鱼类组织中提取蛋白质，并对提取的蛋白质进行鉴定。
实验材料：1. 鱼肉样本2. 丙酮、甲醇、盐酸、硫酸铵、SDS、考马斯亮蓝G-250等试剂3. 离心机、紫外分光光度计、透析袋、凝胶电泳装置等仪器实验步骤：一、样品处理1. 将鱼肉样本切碎，用丙酮或甲醇进行初步提取，去除脂肪和杂质。
2. 将提取液离心，取上清液作为粗提蛋白溶液。
二、粗提蛋白的纯化1. 盐析法：将粗提蛋白溶液用硫酸铵进行盐析，调节pH值至7.0，离心分离蛋白沉淀。
2. 透析法：将蛋白沉淀用透析袋进行透析，去除小分子杂质。
三、蛋白鉴定1. 紫外分光光度法：测定蛋白溶液的紫外吸收光谱，确定蛋白质的浓度。
2. 凝胶电泳法：将蛋白溶液进行SDS-PAGE电泳，分析蛋白质的纯度和分子量。
3. 考马斯亮蓝G-250染色法：观察电泳后的蛋白质条带，判断蛋白质的纯度。
实验结果：一、粗提蛋白的盐析通过硫酸铵盐析，得到白色蛋白沉淀，表明蛋白质成功从鱼肉组织中提取。
二、粗提蛋白的透析通过透析，去除小分子杂质，得到较纯的蛋白溶液。
三、蛋白鉴定1. 紫外分光光度法：蛋白溶液在280nm处有较强的吸收峰，表明存在蛋白质。
2. 凝胶电泳法：电泳结果显示，蛋白溶液在特定位置出现单一条带，表明蛋白质纯度较高。
3. 考马斯亮蓝G-250染色法：电泳后的蛋白质条带颜色均匀，表明蛋白质纯度较高。
实验结论：本实验成功从鱼肉组织中提取了蛋白质，并通过盐析、透析等纯化方法得到了较纯的蛋白溶液。
实验结果表明，紫外分光光度法、凝胶电泳法和考马斯亮蓝G-250染色法均可用于蛋白质的鉴定。
酪蛋白提取实验报告酪蛋白提取实验报告引言：酪蛋白是一种重要的蛋白质成分，存在于牛奶等乳制品中。
本实验旨在通过提取酪蛋白，探索其在食品工业和医药领域的应用潜力。
通过实验过程的详细描述和结果的分析，我们将深入了解酪蛋白提取的方法和效果。
实验材料与方法：1. 材料：牛奶、氯化钙、硫酸、酒精、磷酸盐缓冲液等。
2. 方法：a. 酪蛋白的沉淀：将牛奶加热至80°C，加入少量氯化钙搅拌，冷却后加入硫酸沉淀酪蛋白。
b. 酪蛋白的溶解：将酪蛋白沉淀加入磷酸盐缓冲液，搅拌溶解。
c. 酪蛋白的纯化：将溶解的酪蛋白加入酒精，离心沉淀，去除杂质。
实验过程：1. 酪蛋白的沉淀：将适量牛奶加热至80°C，加入少量氯化钙搅拌，冷却后加入硫酸，酪蛋白逐渐沉淀。
2. 酪蛋白的溶解：将沉淀后的酪蛋白加入磷酸盐缓冲液，搅拌溶解，形成均匀的溶液。
3. 酪蛋白的纯化：将溶解的酪蛋白加入酒精，离心沉淀，去除杂质，得到纯净的酪蛋白。
实验结果与讨论：通过实验，我们成功地提取到了酪蛋白，并进行了初步的纯化。
在实验过程中，我们观察到牛奶在加热后出现了沉淀，这是因为加热使酪蛋白发生凝聚而形成的。
随后，我们通过加入磷酸盐缓冲液将酪蛋白溶解，得到了均匀的溶液。
最后，通过加入酒精并进行离心，我们成功地去除了酪蛋白溶液中的杂质，得到了纯净的酪蛋白。
酪蛋白作为一种重要的蛋白质成分，具有广泛的应用潜力。
在食品工业中，酪蛋白可用于制作奶酪、酸奶等乳制品，增加其营养价值和口感。
此外，酪蛋白还可以作为食品添加剂，提高食品的稳定性和质感。
在医药领域，酪蛋白具有抗菌、抗病毒等生物活性，可以应用于药物的载体材料和生物医学领域。
然而，本实验中的提取方法仅是初步的纯化过程，酪蛋白的纯度还有待进一步提高。
在实际应用中，需要根据具体需求选择更加精细的提取和纯化方法，以获得更高纯度的酪蛋白。
此外，酪蛋白的稳定性也需要进一步研究，以确保其在不同环境条件下的应用效果。
SDS研究实验报告一、研究背景及目的对于那些生物体内含量高、易于分离结晶获得纯品的蛋白，可以通过测定氨基酸序列，借助各种氨基酸的分子量求出蛋白的分子量，并与质谱等手段相互结合，得到精确可信的分子量。
但对于那些含量少，不易分离的蛋白，无法实现结晶，就必须借助其他手段测定其分子量。
要找到能够测定分子量的实验手段，首先要考虑那些能够将不同分子按照其各自的分子量分离的技术。
在众多的技术当中，密度梯度离心、层析、电泳都与物质的分子量有关。
其中，超速离心机造价高，使用过滤层析色谱测分子量要做标准曲线，柱长要求高，且这些方法不够准确。
因此，电泳技术成为了实现分子量测定这一目的的最佳选择。
但是，在活性电泳中，影响蛋白前迁移率的因素有蛋白质的电荷性质、分子大小和形状。
要测定分子量，就要消除电荷、分子形状对蛋白迁移率的影响，即使得各种蛋白的电荷、形状不存在显著差异。
对于电荷，使各分子不带电违背电泳的基本原理，而使各分子带点完全相同是无法实现的，因此考虑使其带上大量电荷，从而让分子之间的电荷差异可以忽略。
在活性电泳中，改变样品的带电情况依靠的是缓冲液pH的变化，显然不能够使分子大量带电，这就表明必须向电泳体系中引入其他物质，与蛋白分子定量等量结合，且不改变分子量差异造成泳动差异。
对于分子形状，考虑到功能性蛋白大多是球形粒子，要保持形状不变，就要实现对蛋白的包裹性结合。
而蛋白表面的电荷分布情况千差万别，依靠电荷性质无法结合形成稳定的复合物。
考虑到蛋白质中含有大量的疏水氨基酸，可以通过疏水作用结合，这就要造成蛋白变性，是疏水基团充分暴露出来，分子不能在维持球型而变成棒状，因此，所选择的物质还需要能够维持复合物形状的统一。
基于以上考虑，科学家选择了双亲性物质，既能通过疏水作用与蛋白定量结合成牢固的复合物，又能借助亲水性在溶液中良好分散。
新技术的发明常以原有技术作为基础。
在活性电泳中，采用碱性体系，依靠浓缩效应实现了样品的浓缩，大大提高了分析的精度。
蛋白质提取实验报告蛋白质提取实验报告引言：蛋白质是生命体内最基本的组成部分之一，具有重要的生物学功能。
为了研究蛋白质的结构和功能，科学家们经常需要从生物样品中提取蛋白质。
本实验旨在探究蛋白质提取的方法和步骤，并评估不同提取方法的效果。
实验材料与方法：1. 实验材料：- 细胞样品（例如细菌、植物或动物细胞）- 细胞裂解缓冲液（含有蛋白质保护剂）- 高速离心机- 蛋白质定量试剂盒2. 实验步骤：1）将细胞样品收集到离心管中，并加入适量的细胞裂解缓冲液。
2）使用超声波处理仪对细胞样品进行超声波破碎，以破坏细胞膜，释放细胞内的蛋白质。
3）将破碎后的细胞样品放入高速离心机中，以分离蛋白质。
4）将上清液转移到新的离心管中，并进行蛋白质浓度的测定。
实验结果与讨论：通过本实验，我们成功提取了细胞样品中的蛋白质，并进行了浓度测定。
在实验过程中，我们注意到以下几个关键点。
1. 细胞裂解缓冲液的选择：细胞裂解缓冲液中的蛋白质保护剂可以保护蛋白质免受降解。
在本实验中，我们选择了含有蛋白质保护剂的缓冲液，以最大程度地保留蛋白质的完整性和活性。
2. 超声波破碎的条件：超声波破碎是破坏细胞膜的常用方法之一。
然而，超声波的功率和处理时间对实验结果有很大的影响。
在本实验中，我们对超声波功率和处理时间进行了优化，以确保细胞样品完全破碎，但又不会对蛋白质造成不可逆的损伤。
3. 高速离心的参数选择：高速离心是将细胞碎片与蛋白质上清液分离的关键步骤。
离心的参数，如转速和离心时间，对分离效果有重要影响。
在实验中，我们尝试了不同的离心参数，并选择了最佳条件，以获得最高纯度的蛋白质上清液。
4. 蛋白质浓度的测定：蛋白质浓度的测定是评估蛋白质提取效果的重要步骤。
在本实验中，我们使用了蛋白质定量试剂盒进行测定。
该试剂盒利用比色法，根据蛋白质与染色剂的反应产生的吸光度变化来测定蛋白质的浓度。
通过与标准曲线的比较，我们可以准确地确定蛋白质的浓度。
结论：通过本实验，我们成功地提取了细胞样品中的蛋白质，并进行了浓度测定。
蛋白质的定性实验报告一、实验目的蛋白质是生物体中重要的大分子物质，本实验旨在通过一系列定性实验方法，确定样品中是否存在蛋白质，并对其性质进行初步的分析和判断。
二、实验原理1、双缩脲反应蛋白质中的肽键在碱性条件下能与铜离子结合，生成紫红色的络合物。
此反应是鉴定蛋白质的常用方法。
2、茚三酮反应蛋白质或氨基酸中的α氨基能与茚三酮反应，生成蓝紫色化合物。
3、黄色反应含有苯环结构的蛋白质能与浓硝酸发生反应，生成黄色物质。
三、实验材料与仪器1、实验材料蛋清溶液、牛奶、豆浆、大豆提取液、标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白）。
2、实验试剂双缩脲试剂（A 液：01g/mL 的氢氧化钠溶液；B 液：001g/mL 的硫酸铜溶液）、茚三酮试剂、浓硝酸、10%氢氧化钠溶液。
3、实验仪器试管、试管架、滴管、酒精灯、石棉网、三脚架、玻璃棒、量筒、烧杯。
四、实验步骤1、双缩脲反应（1）取 5 支试管，编号为 1-5 号。
（2）在 1 号试管中加入 2mL 标准蛋白质溶液，2 号试管中加入2mL 蛋清溶液，3 号试管中加入 2mL 牛奶，4 号试管中加入 2mL 豆浆，5 号试管中加入 2mL 蒸馏水作为对照。
（3）向各试管中先加入 1mL 01g/mL 的氢氧化钠溶液，摇匀，营造碱性环境。
（4）再向各试管中加入 4 滴 001g/mL 的硫酸铜溶液，摇匀。
（5）观察各试管中溶液颜色的变化。
2、茚三酮反应（1）取 4 支试管，编号为 6-9 号。
（2）在 6 号试管中加入 2mL 标准蛋白质溶液，7 号试管中加入2mL 大豆提取液，8 号试管中加入 2mL 10%氢氧化钠溶液作为对照，9 号试管中留空。
（3）向各试管中滴加 2-3 滴茚三酮试剂。
（4）将试管放入沸水浴中加热 5-10 分钟。
（5）观察各试管中溶液颜色的变化。
3、黄色反应（1）取 3 支试管，编号为 10-12 号。
（2）在 10 号试管中加入 2mL 标准蛋白质溶液，11 号试管中加入2mL 蛋清溶液，12 号试管中加入 2mL 蒸馏水作为对照。
一、实验目的1. 掌握蛋白滴定电泳的基本原理和操作方法；2. 学习通过蛋白滴定电泳对蛋白质进行分离和鉴定；3. 熟悉实验数据的处理和分析方法。
二、实验原理蛋白滴定电泳是一种基于蛋白质在特定pH值下的等电点（pI）和电荷性质差异的分离技术。
当蛋白质溶液的pH值等于其等电点时，蛋白质不带净电荷，因此在电场中不发生移动。
当溶液pH值低于或高于蛋白质的等电点时，蛋白质分别带正电荷或负电荷，在电场中发生向相应电极方向的移动。
通过调节溶液pH值，可以使蛋白质在电场中分离。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 蛋白质样品（如血清蛋白、细胞提取物等）- 标准蛋白质溶液（如牛血清白蛋白、肌红蛋白等）- 氨水、盐酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠等试剂- 水浴锅、电泳仪、紫外可见分光光度计、凝胶成像系统等仪器2. 实验试剂：- 氨水（25%）- 盐酸（1.0mol/L）- 磷酸二氢钠（0.1mol/L）- 磷酸氢二钠（0.1mol/L）- 碳酸钠（0.1mol/L）- 硫酸铵（饱和溶液）四、实验步骤1. 准备蛋白质样品：取一定量的蛋白质样品，加入适量的磷酸缓冲溶液，混匀后，用紫外可见分光光度计测定蛋白质浓度。
2. 准备电泳凝胶：按照实验要求配置凝胶，加入适量的氨水和盐酸，混匀后，倒入凝胶模具中，静置固化。
3. 加样：将蛋白质样品和标准蛋白质溶液分别加入电泳凝胶的孔中。
4. 滴定：用磷酸缓冲溶液滴定蛋白质样品和标准蛋白质溶液，调节溶液pH值至蛋白质的等电点。
5. 电泳：将电泳凝胶放入电泳仪中，设定电压和时间，进行电泳分离。
6. 成像与分析：电泳结束后，用凝胶成像系统对凝胶进行成像，分析蛋白质分离结果。
五、实验结果与分析1. 蛋白质分离：通过蛋白滴定电泳，可以将蛋白质样品中的不同组分分离出来，形成不同的区带。
2. 定性鉴定：根据标准蛋白质溶液的迁移距离和蛋白质样品的迁移距离，可以初步判断蛋白质样品中的组分。
3. 定量分析：通过比较蛋白质样品和标准蛋白质溶液的吸收峰面积，可以计算出蛋白质样品中各组分的相对含量。
醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白实验报告醋酸纤维薄膜电泳分离血清蛋白实验报告引言：血清蛋白是人体内一种重要的生物大分子，它在维持人体正常生理功能中起着至关重要的作用。
因此，对血清蛋白的研究一直备受科学家的关注。
本实验旨在利用醋酸纤维薄膜电泳技术，对血清蛋白进行分离，以期进一步了解血清蛋白的组成和功能。
实验方法：1. 准备样品：从健康人体中提取血清样品，将其离心，得到血清上清液。
2. 制备醋酸纤维薄膜：将醋酸溶液倒入玻璃容器中，将玻璃容器放置在恒温槽中，使醋酸溶液温度保持在60℃左右。
然后，将玻璃容器从恒温槽中取出，迅速浸入冷水中，使醋酸溶液迅速凝固形成醋酸纤维薄膜。
3. 实验操作：将醋酸纤维薄膜放置在电泳槽中，加入足够的电泳缓冲液，使醋酸纤维薄膜完全浸泡其中。
然后，将血清样品均匀涂抹在醋酸纤维薄膜上，并连接电源进行电泳分离。
4. 电泳条件：设置电泳电压和时间，一般情况下，电泳电压为100V，电泳时间为30分钟。
5. 实验结果：观察电泳结束后的醋酸纤维薄膜，记录血清蛋白的分离情况。
实验结果与讨论：经过电泳分离后，观察到醋酸纤维薄膜上出现了多个带状条纹，这些条纹代表了不同的血清蛋白组分。
根据条纹的迁移距离和形状，我们可以初步判断血清蛋白的分子量和电荷特性。
通过对实验结果的分析，我们可以发现，血清蛋白主要可以分为白蛋白、球蛋白、半胱氨酸蛋白和β-球蛋白等几个主要组分。
白蛋白是血清蛋白中含量最高的成分，迁移速度最快；球蛋白次之，迁移速度较慢；半胱氨酸蛋白和β-球蛋白迁移速度最慢。
这些血清蛋白的分离结果与其分子量和电荷特性有关。
白蛋白分子量较小，电荷较弱，因此迁移速度最快；球蛋白分子量较大，电荷较强，迁移速度较慢；半胱氨酸蛋白和β-球蛋白分子量更大，电荷更强，迁移速度最慢。
结论：本实验利用醋酸纤维薄膜电泳技术成功地对血清蛋白进行了分离，并初步了解了血清蛋白的组成和特性。
通过观察醋酸纤维薄膜上的带状条纹，我们可以对血清蛋白的分子量和电荷特性进行初步判断。
实验六 SDS-PAGE测定蛋白质分子量生物111 杨明轩 1102040128一、研究背景及目的对于那些生物体内含量高、易于分离结晶获得纯品的蛋白，可以通过测定氨基酸序列，借助各种氨基酸的分子量求出蛋白的分子量，并与质谱等手段相互结合，得到精确可信的分子量。
但对于那些含量少，不易分离的蛋白，无法实现结晶，就必须借助其他手段测定其分子量。
要找到能够测定分子量的实验手段，首先要考虑那些能够将不同分子按照其各自的分子量分离的技术。
在众多的技术当中，密度梯度离心、层析、电泳都与物质的分子量有关。
其中，超速离心机造价高，使用过滤层析色谱测分子量要做标准曲线，柱长要求高，且这些方法不够准确。
因此，电泳技术成为了实现分子量测定这一目的的最佳选择。
但是，在活性电泳中，影响蛋白前迁移率的因素有蛋白质的电荷性质、分子大小和形状。
要测定分子量，就要消除电荷、分子形状对蛋白迁移率的影响，即使得各种蛋白的电荷、形状不存在显著差异。
对于电荷，使各分子不带电违背电泳的基本原理，而使各分子带点完全相同是无法实现的，因此考虑使其带上大量电荷，从而让分子之间的电荷差异可以忽略。
在活性电泳中，改变样品的带电情况依靠的是缓冲液pH的变化，显然不能够使分子大量带电，这就表明必须向电泳体系中引入其他物质，与蛋白分子定量等量结合，且不改变分子量差异造成泳动差异。
对于分子形状，考虑到功能性蛋白大多是球形粒子，要保持形状不变，就要实现对蛋白的包裹性结合。
而蛋白表面的电荷分布情况千差万别，依靠电荷性质无法结合形成稳定的复合物。
考虑到蛋白质中含有大量的疏水氨基酸，可以通过疏水作用结合，这就要造成蛋白变性，是疏水基团充分暴露出来，分子不能在维持球型而变成棒状，因此，所选择的物质还需要能够维持复合物形状的统一。
基于以上考虑，科学家选择了双亲性物质，既能通过疏水作用与蛋白定量结合成牢固的复合物，又能借助亲水性在溶液中良好分散。
新技术的发明常以原有技术作为基础。
生物化学实验报告
实验四麦清蛋白的初步提取
一、研究背景及目的
无论是在科学研究还是商业化产品的开发中，生物大分子的分离纯化似乎都是一个永恒的话题。
针对某一类物质的分离，人们通过寻求它们之间的共性特征而发明了诸多的分离纯化技术。
然而随着人们对某一特定目标产物活性与纯度的需求逐渐增大，但同类物质之间彼此性质的相似性使得精确的分级难度随之加大，二者之间的矛盾刺激人们不断探索新的技术以提高纯化水平。
人们清楚地意识到，要想使目标物得到分离，目标物与杂质之间的性质差异必须足够大，这又与某些性质差异小的物质的分离相矛盾，而人为放大这些差异小的性质必然会破坏目标物的原有结构，因此需要借助第三者进行差异转化，即以其自身的性质为基础，转化为其他方面差异大的性质。
层析法就是通过层析介质与流动相的共同作用，使被分离物质之间差异很小的性质随流动相的流动而转化成了速度上的差异，通过时间上的积累进而转化为距离上的差异。
所以，从理论上来说，只要层析柱足够的长，纵使是很微小的速度差异也能够体现出一定的距离上的差异，从某种意义上来说对于层析法也就不存在无法分离的物质，这是层析法在生物大分子的分离纯化中占据主导优势地位的原因。
此外，除了定性能力较差以外，层析法几乎囊括了物质分析纯化中的所有优点，比如分离效率高、速度快，样品用量少、检测灵敏度高、分析速度快、易于自动化管理等。
基于不同的原理，层析法又衍生出诸多的操作技术，在实际应用中可以根据待分离物质的特定性质选择适合的操作技术。
基于以上种种原因，层析法在分离高纯度、高活性的生物大分子中有着不可替代的作用。
本实验以分子筛层析完成麦清蛋白脱盐为实例验证层析技术的可行性，了解相关技术的应用及新技术的发明对边缘性实验学科的重要作用，感悟技术发明的思路。
二、原理
1.硫铵分级沉淀
中性盐沉淀的原理是大量中性盐加入使水活度降低，它们在争夺溶剂水的同时破坏蛋白质表面的水化层，使疏水氨基酸暴露，从而发生聚集沉淀下来。
由于不同蛋白质所形成的双电层水膜的稳定性不一样，因此破坏他们所需的硫酸铵的浓度也不一致，所以我们可以利用不同浓度的硫酸铵来对样品液进行分级沉淀，特定的浓度可以使样品中一类蛋白甚至是一种蛋白质发生沉淀。
显然，硫酸铵分级沉淀在对蛋白质的粗提取过程中实际上已经实现了精细分级（除去了一部分蛋白杂质），这符合实验设计中尽可能使每一步实现效益最大化的原则，所以被用作蛋白质粗分级中的常用手段。
此外，硫酸铵还有其他的一些优势：（1）硫酸铵
属于惰性物质，不易与其他生物活性物质发生反应，在纯化过程中能最大程度的保护蛋白质活性，不易使蛋白质变性；（2）硫酸铵为二价离子，等浓度时离子强度高，能更有效的降
低蛋白质溶解度；（3）硫酸铵在水中的溶解度大、温度系数小，在低温时仍可以高浓度存在，既能够满足低温沉淀某些蛋白质的需要，又能有效争夺溶剂水和破坏蛋白质水化层，使蛋白质有效沉淀；（4）硫酸铵溶解性好也为后续的高盐纯化做准备，便于洗涤去除。
2.凝胶过滤层析
凝胶过滤层析是生化分离常用色谱技术的一种，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。
凝胶是一类多孔性高分子聚合物，每个颗粒犹如一个筛子。
当样品溶液通过凝胶柱时，相对分子质量较大的物质沿着凝胶颗粒间的孔隙，随着溶剂流动，首先流出层析柱；相对分子质量较小的物质可自由地进出凝胶颗粒的网孔，使流量增长，移动速率慢而最后流出层析柱；中等大小的分子在大分子物质与小分子物质之
间被洗脱。
这样，由于分子量大小不同的物质被洗脱的时间是一定的，经过层析柱后，混合物中的各物质按其分子大小不同而被分离。
3.实验方案
本实验选取麦清蛋白作为纯化对象进行研究，我们首先通过硫铵分级沉淀对小麦种子提取液做初步的提纯，得到含有硫酸铵杂质盐的麦清蛋白粗提取物，然后通过分子筛层析除盐，最后利用紫外分光光度计测定各阶段纯化产物的OD280以检测蛋白含量，同时用BaCl2检测纯化产物中有无硫酸根离子，最后对比分析麦清蛋白和盐的洗脱曲线来评判凝胶过滤层析的除盐效果。
三、仪器与试剂
仪器：UV9600紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）、JP-100架盘药物天平（常熟市双杰测试仪器厂）、TDL-40B低速离心机（上海安亭科学仪器厂）、SL-200型高速多功能粉碎机（浙江省永康市松青五金厂）、BSZ-100自动部份收集器（上海沪西分析仪器厂）、HL-2恒流泵（上海沪西分析仪器厂）；
器具：微量可调手动移液器（大龙）、研钵；
试剂：饱和（NH4）2SO4溶液、1%的BaCl2溶液、洗脱液、蒸馏水；
材料：新鲜小麦种子、葡聚糖凝胶G-25。
四、实验步骤[1]
1.溶胀凝胶（教师完成）
称取交联葡聚糖凝胶G-25适量，加入足量的洗脱液于沸水浴中溶胀5h。
溶胀平衡后，适度搅拌使充分悬浮后稍静置，待大部分凝胶沉降后，除去含有细碎颗粒的上层液，如此反复操作多次直至无细微颗粒为止。
最后将漂洗好的凝胶在真空干燥器中减压除气。
2.装柱
打开层析柱柱帽，下端止水，装入1/4左右柱长的洗脱液。
将凝胶边搅拌边倒入柱中，同时开启洗脱，使凝胶一直处在溶液中，一次性连续装柱直至柱长的3/4左右。
装柱完成后适时止水以使洗脱液面高于凝胶面3~5cm，待凝胶沉降完成后，旋上柱帽，连接洗脱系统，平衡洗脱约3h。
3.盐析法分离提取麦清蛋白
取小麦种子，粉碎，称取2g于三角瓶。
加20ml蒸馏水，连续震荡1h，3000r/min离心20min。
取上清液，搅拌下加入等体积的饱和硫酸铵溶液，冰箱冷藏4小时左右使麦清蛋白充分沉淀出来。
随后以3000r/min离心20min，弃上清液，加3ml去离子水溶解沉淀，即得麦清蛋白粗品水溶液。
4.上样
打开柱帽，放入略小于层析柱内径的滤纸片，使其自然飘落在凝胶面上。
连接收集系统，确定流速（10滴/s），准备上样。
利用恒流泵加速按钮使洗脱液面与胶床表面相齐时，停止洗脱。
用加样器取1.5ml样品提取液，小心滴入凝胶床面中央，然后开启洗脱，同时开启收集器。
待样品与凝胶面相齐时，迅速用滴管加入略高于上样高度（1.5~2cm）的洗脱液，如此操作2~3次。
待洗脱液再次与凝胶面相齐时，用滴管小心加入3~5ml高的洗脱液，旋上柱帽，连续洗脱收集。
5.洗脱、收集与鉴定
每3毫升收集一管，然后以洗脱液作为空白管，用紫外分光光度计测定各收集管的OD280值。
记录每管的消光值，以管号为横坐标，消光值为纵坐标，绘制洗脱曲线。
比色完毕后，确定峰值管，并留取样液250μl，随后向各管分别加入2滴1%的BaCl2溶液，混匀观察是否产生白色沉淀，比浊法比较脱盐效果。
五、数据整理及图表
表1 凝胶过滤层析提取麦清蛋白数据整理
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沉淀，即洗脱液中含有盐。
注：“0”表示洗脱液加入BaCl2后无沉淀，即盐含量为0；“1”表示洗脱液加入BaCl2后无沉淀，即洗脱液中含有盐。
六、讨论与分析
（1）从图1可以看出，麦清蛋白洗脱曲线有一个明显的洗脱峰，峰值管（蛋白质含量最高）为第7管。
进一步分析发现，洗脱峰两侧（特别是右侧峰值管之后）较为平缓而不是呈现尖锐的形态，原因应该是上样时样品滴加速度过慢且上样后用洗脱液淋洗层析柱内壁时加入洗脱液的量过多所致。
（2）从图2可以看出，盐的洗脱曲线其洗脱峰同样比较平缓。
就本实验而言，我们并没用很精确的方法对洗脱液中盐含量进行定量，只是通过BaCl2沉淀法判断洗脱液中是否存在盐（硫酸根离子），而用肉眼观察确定沉淀的大致产生量还是有较大误差的，故所绘盐的洗脱曲线仅供参考。
（3）对比图1、2，麦清蛋白的洗脱峰与盐的洗脱峰相隔距离还是比较近的，大概只有一管的差距。
正常情况下，两种待分离物质的洗脱曲线中，峰值管之间至少应该相差3~4管，这种情况下才能认为是两种物质达到了有效分离。
故坦率的讲，本实验并没有有效地对麦清蛋白进行脱盐，也没有达到预期的目标。
七、结论与展望
（1）由本实验的结果我们可以看到，分子筛层析是具有可操作性的，但若要保证其分离效果，就需要严格的规范熟练操作。
拿我组实验来说，由于是初次接触此类实验，经验不足，所以操作过程中的一些要点没有把握好，造成最终实验结果并不理想。
（2）通过本实验，我们对层析技术有了一个较深的认识。
在目前生物大分子的分离纯化中，层析占据着主导优势，但是随着生命科学的不断向前发展，在物质的分离纯化方面必然会出现实际操作中层析技术解决不了的问题，所以新的分离纯化技术肯定还会产生。
八、质疑与相关思考
（1）如何改进本实验使洗脱液中的盐含量能够定量检测？个人认为在原有操作的基础上可各管将所的沉淀进行离心，计算所得沉淀量，进而得出盐的洗脱量。
（2）实验中洗脱液的流速为10滴/s，这是如何确定的？是前人的实验总结而来的吗？进一步来讲，在进行柱层析时洗脱液的流速确定是不是有什么规定或者参考标准？
（3）本实验中盐的洗脱曲线其洗脱峰非常平缓（较宽），原因可能是上样后环壁淋洗加入的洗脱液体积过多，导致样品进入凝胶柱过慢，从而增加了洗脱峰的宽度。
（4）在实验最终洗脱的过程中，我组的恒流泵似乎出现了问题，洗脱速度一直在发生变化，导致相同时间内收集得到的洗脱下来的液体的量明显不一样。
虽然我们几经调整，但流速始终没有稳定在一个确定的值。
我想这应该也是本次实验失败的原因之一。
九、思考题。
