蛋白酶酶活的测定方法(福林法)

一、福林—酚试剂发测定蛋白酶活力一）、试剂：1、福林试剂的配制：在2000ML磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O)100克、钼酸钠(Na2MO4·2H2O)25克，水700ML、85％的磷酸50ML、浓盐酸100ML，温火沸腾回流10h。

再取下回流冷凝器，在通风橱中加入硫酸锂(Li2SO4)50克、水50ML和数滴浓溴水(99．0％)，继续沸腾15min，以除去多余的溴，如冷却后仍有绿色，需要再加溴水，再煮沸除去过量的溴。

冷却，加水定容到1000ML。

制得的试剂应呈金黄色，存储在棕色瓶内。

使用时加2倍的蒸馏水稀释。

2、0.55mol 碳酸钠溶液：称取无水碳酸钠（Na2CO3）58.3克，以蒸馏水溶解并定容至1000ml 3、10%三氯乙酸4、0.02M pH7.5 磷酸盐缓冲液：称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）6.02克和磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）0.5克，以蒸馏水溶解并定容至1000ml。

5、0.5%酪蛋白溶液：准确称取干酪素0.5克，加入0.5N氢氧化钠1ml湿润，再加入少量0.02MpH7.5磷酸盐缓冲液稀释，在水浴中煮沸溶解，定溶至100ml，配制后应即使使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。

（0.5N氢氧化钠100ml：2g氢氧化钠溶于蒸馏水100毫升）。

6、500μg/ml酪氨酸溶液：准确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸50mg，加入少量0.2N盐酸使溶解，用0.2N盐酸定容至100ml，其浓度为500μg/ml，此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。

二）、测定方法1、标准曲线的制作按下表配制各种不同浓度的酪氨酸溶液：试管号： 1 2 3 4 5 6蒸馏水（ml）： 10 9 8 7 6 5500μg/ml酪氨酸（ml）： 0 1 2 3 5 6酪氨酸最终浓度（μg/ml）： 0 50 100 150 200 2502、测定步骤：取6支试管按上表编号，分别加入不同浓度酪氨酸1ml，加0.5%酪蛋白溶液2ml，于37℃水浴中反应15分钟，然后加入10%三氯乙酸3ml，离心除去沉淀，取上清夜1ml，加入0.55mol 碳酸钠溶液5ml，再加入福林试剂1ml，于37℃水浴中显色15分钟，以等量蒸馏水代替酪氨酸作空白，在680nm波长比色；重复三次测定，取平均值。

水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理每箱随机各取 3 尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4C冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入一26C冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。

二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml, 4C冷却去离子水稀释，4C下离心20min（13, OOOg）, 上清液标号分装，并与4C冰箱中冷却保存，24Hr待测。

将肝胰脏及肠道组织用4C去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。

按样品重量加10倍的4C冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm 匀浆玻璃管外设冰浴）。

匀浆液在4C下离心20分钟（13, OOOg）,上清液标号分装，并于4C 冰箱冷却保存，24Hr 内测定完毕。

酶粉及饲料：取2 . 0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。

测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。

取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。

三、酶活性测定1. 蛋白酶测定：前、中、后肠,肝胰脏。

方法：福林—酚试剂法1.1 原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA ）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等） ,这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应）,用分光光度计测定。

1.2 蛋白酶活性单位：1克食靡或组织在30C, PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为 1 个酶活力单位。

1.3 试剂1. 福林试剂（已配）2. 0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3 ）42.4g 用水溶解和定容至1,000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。

3. 0.1M三氯醋酸（TCA ）:用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1 , 000ml 。

实验四、蛋白酶酶活力的测定一、原理以酪蛋白为反应底物，令蛋白酶在其最适宜条件下反应一定时间，用三氯乙酸终止反应后过滤或离心得上清液，用Folin比色法测上清液中蛋白酶解物的浓度，计算蛋白酶活力。

蛋白酶活力定义：在一定的条件下，每分钟水解酪蛋白生成与1μg酪氨酸相当的三氯醋酸可溶物所需的木瓜蛋白酶的量，为1个酶活力单位（u）。

二、材料、仪器与试剂（一）材料：木瓜蛋白酶（二）仪器：可见-紫外分光光度计、水浴锅、天平、具塞刻度试管（10、15ml）、漏斗、滤纸、试管架，容量瓶、移液管（1、10ml）、烧杯（25ml）、玻璃棒。

（三）试剂：1福林试剂(Folin试剂)市场购买的Folin试剂。

此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释，即成已稀释3倍的福林试剂。

2、中性稀释液－pH7.2磷酸盐缓冲液称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol/L溶液(A液)。

称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol/L 溶液(B液)。

取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。

3、酪蛋白溶液2g恒重的酪蛋白，用0.5mol/LNaOH溶液润湿后加入80ml pH7.2磷酸盐缓冲液，沸水浴溶解，冷却后，用1 mol/L盐酸调至pH 7.0，再用磷酸盐缓冲液定容至100ml，得浓度为2%的酪蛋白溶液。

临用现配。

4、三氯醋酸溶液称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL，得0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液5、酪氨酸标准溶液精确称取精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，逐步加入6mL 1N盐酸使溶解,用0.2N盐酸定容至100mL,其浓度为1000μg/mL,再用水稀释5倍，得到200μg/mL的酪氨酸标准溶液。

取200μg/mL的标准酪氨酸溶液，配成不同浓度的溶液（0、20、40、60、80、100μg/mL）6、样品溶液称取木瓜蛋白酶0.100g, 置于研钵中,加入相应的缓冲液定容至50mL,得到稀释500倍的酶液（当天配制、稀释）。

实验四、蛋白酶活力的测定1.实验目的掌握用Folin-酚法测定蛋白酶活力的方法，与Azocasein（偶氮酪蛋白）法作为比较。

2.实验原理蛋白酶在一定的温度和pH下，水解酪素底物产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸），在碱性条件下，将福林试剂还原，生成钼蓝和钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比，通过在660nm测定其吸光度，可得到酶解产生的酚基氨基酸的量，计算出蛋白酶活力，以此代表蛋白酶的总酶活力。

酶活单位定义：在37℃、相应的pH条件下，在1min内水解酪蛋白底物，产生相当于1µg酚类化合物（由酪氨酸等同物表示）的酶量，为1个酶活单位。

3.主要仪器和试剂试剂：0.1mg/mL L-酪氨酸标准贮备溶液、0.55mol/LNa2CO3、福林试剂、Casein溶液、TCA 溶液仪器设备：恒温水浴锅、分光光度计、pH计，分析天平、秒表。

4.实验步骤（1）标准曲线绘制取三支试管（一支空白，两支样品管），分别向三支试管中准确加入5mLcasein基质液，将三支管放入37℃水浴中预热10min分别向两支样品管中加入1mL稀释酶液，准确计时，反应30min，取出迅速加入5mLTCA；空白管先加TCA预热30min再加稀释酶液，摇匀。

将三支试管继续置于37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。

三支试管中反应液用滤纸过滤。

另取三支试管（一支空白。

两支样品管），分别吸取上述相应的滤除液2mL，加入碳酸钠溶液5mL，稀Folin试剂1mL，摇匀，在37℃水浴中放置30min，取出，迅速冷却至室温。

以空白管为对照调仪器零点，在分光光度计波长660nm下，用比色皿分别测二支样品管中酶液的吸光度，取平均值，通过标准曲线求出生成的酪氨酸的含量。

5.数据处理。

蛋白酶酶活的测定方法（福林法）1. 酶单位定义: 1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u /g（u/mL）表示。

2.原理蛋白酶在一定温度和pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。

3.试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiSO4）50g，水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需要再加入溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。

制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。

使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。

3.2碳酸钠溶液c（Na2CO3）=0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，加水溶解并定容至1000mL。

3.3三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。

3.4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。

3.5 盐酸溶液c（HCl）=1mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。

3.6 缓冲溶液a．磷酸缓冲液（pH=7.5），适用于中性蛋白酶。

称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4. 2H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。

b．乳酸缓冲液（pH=3.0），适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80%~90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。

乙液称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。

蛋⽩酶酶活的测定⽅法（福林法）蛋⽩酶酶活的测定⽅法（福林法）1. 酶单位定义: 1g固体酶粉（或1mL液体酶），在⼀定温度和pH值条件下，1min⽔解酪素产⽣1ug酪氨酸为⼀个酶活⼒单位，以u /g（u/mL）表⽰。

2.原理蛋⽩酶在⼀定温度和pH值条件下，⽔解酪素底物，产⽣含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、⾊氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，⽣成钼蓝和钨蓝，⽤分光光度法测定，计算其酶活⼒。

3.试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000mL磨⼝回流装置中加⼊钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，⽔700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，⼩⽕沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加⼊硫酸锂（LiSO4）50g，⽔50mL和数滴浓溴⽔（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿⾊需要再加⼊溴⽔，再煮沸除去过量的溴），冷却，加⽔定容⾄1000mL，混匀，过滤。

制得得试剂应呈⾦黄⾊，贮存于棕⾊瓶内。

使⽤溶液：⼀份福林试剂与⼆份⽔混合，摇匀。

3.2碳酸钠溶液c（Na2CO3）=0.4mol/L称取⽆⽔碳酸钠（Na2CO3）42.4g，加⽔溶解并定容⾄1000mL。

3.3三氯⼄酸c（CCl3.COOH）=0.4mol/L称取三氯⼄酸65.4g,加⽔溶解并定容⾄1000mL。

3.4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。

3.5 盐酸溶液c（HCl）=1mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。

3.6 缓冲溶液a．磷酸缓冲液（pH=7.5），适⽤于中性蛋⽩酶。

称取磷酸氢⼆钠（Na2HPO4.12H2O）6.02g和磷酸⼆氢钠（NaH2PO4. 2H2O）0.5g，加⽔溶解并定容⾄1000mL。

b．乳酸缓冲液（pH=3.0），适⽤于酸性蛋⽩酶甲液称取乳酸（80%~90%）10.6g，加⽔溶解并定容⾄1000mL。

酸性蛋白酶酶活测定日期：2006-04-16 23:12:50________________________________________1. 定义1g固体酶粉在40℃和pH值3.0条件下，1min水解酪素产生1微克酪氨酸的酶量为1个酶活力单位，以u/g表示。

2 原理蛋白酶在一定的温度和pH条件下，水解底物酪素产生含有酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，在碱性条件下，将福林试剂(Folin)还原，生成钼蓝与钨蓝，用分光光度计测定，计算其酶活力。

3.试剂和溶液3.1 1 mol/L及0.1mol/L盐酸(HCl)溶液取浓盐酸85ml，加水稀释并定容至1000ml，即为1 mol/L盐酸溶液；取100ml 1 mol/L盐酸溶液，定容1000ml，即为0.1mol/L盐酸溶液。

3.2 100mg/ml L－酪氨酸标准液精确称取预先于105℃干燥至恒重的L－酪氨酸0.1000g，精确至0.0001g。

用1 mol/L盐酸60ml溶解后定容至100ml，即为1mg/ml酪氨酸标准溶液。

吸取1mg/ml酪氨酸标准溶液10.0ml，用0.1mol/L盐酸定容至100ml，即得到100mg/ml L－酪氨酸标准液。

3.3 0.4mol/L碳酸钠(Na2CO3)溶液称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。

3.4 福林(Folin) 试剂于2000ml磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2WO4•2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4•2H2O)25g、蒸馏水700ml、85％磷酸50ml、浓盐酸100ml。

小火沸腾回流10小时，取下回流冷却器，在通风厨中加入硫酸锂(Li2SO4)50g，加蒸馏水50ml和数滴浓(99％)溴水，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴)，冷却后加蒸馏水定容至1000ml。

混匀、过滤。

试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。