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中国实用乡村医生杂志,2020,27(12)•39•I综述结核分枝杆菌耐药机制研究进展王秀媛作者单位：301800天津，天津市宝t氐区中医医院检验科【摘要】结核病是一种传染性疾病，其病原菌为结核分枝杆菌。
随着抗生素的广泛应用和不合理使用、新药研发速度缓慢等因素，导致耐药结核菌株出现，加大了结核病的防控难度。
为深入了解结核杆菌耐药机制,并作出相应的药物调整，以遏制耐药结核病的蔓延。
文章对结核分枝杆菌的可能耐药机制进行综述,以期为结核病的防治提供新思路。
【关键词】结核病;结核分枝杆菌;耐药机制；固有性耐药;获得性耐药【中图分类号】R52【文献标识码】A【文章编号】1672-7185(2020)12-0039-03doi:10.3969/j.issn.l672-7185.2020.12.015结核病是一种传染性疾病，其病原菌为结核分枝杆菌。
临床上常应用抗生素来治疗该疾病。
近年来,抗生素的广泛应用和不合理使用,导致耐药结核菌株的出现。
耐药结核菌株的产生和播散，已成为21世纪结核病控制难题之一。
因此，需深入了解结核杆菌耐药机制，并作出相应的药物调整，以遏制耐药结核病的蔓延皿。
结核分枝杆菌和其他细菌一样具有复杂的耐药机制，可分为固有性耐药和获得性耐药。
本文就结核分枝杆菌的耐药机制综述如下。
1固有性耐药机制1.1结核分枝杆菌细胞壁渗透性下降分枝菌酸、阿拉伯半乳聚糖和细胞壁黏肽三种成分共同组成结核分枝杆菌的细胞壁。
细胞壁内类脂质含量非常高，使亲水性抗生素进入细胞壁间隙较慢，这一物理屏障成为结核分枝杆菌第一道抵制药物的防线。
细胞壁渗透性下降，药物不容易通过高疏水性细胞壁间隙,这样就降低了药物的有效性,成为结核分枝杆菌耐药机制中最常见的一种囱。
1.2药物外排泵外排泵属于细胞重要功能性膜蛋白，是代谢链组成的重要部分，当有药物进入细胞时，外排泵充分发挥外排作用，将药物从胞内排除。
研究发现，外排泵在分枝杆菌耐药机制中发挥重要作用:当药物进入胞内时，外排泵会将胞内药物泵出胞外,这样胞内药物浓度显著降低，可能不能达到发挥作用的有效浓度,无法对分枝杆菌的生长等生理过程进行抑制，从而导致细菌耐药性的产生⑷。
贵阳市结核分枝杆菌链霉素和乙胺丁醇耐药相关基因突变的检测与分析孙荣;欧维正;王燕;蒙俊;秦万;毕雅坤;陈峥宏【摘要】目的了解贵阳市及周边地区结核分枝杆菌链霉素和乙胺丁醇耐药相关基因rpsl、rrs和embB的突变特征.方法对39株结核分枝杆菌临床分离株(乙胺丁醇和链霉素均耐药菌株19株,均敏感菌株20株)的rpsl、rrs和embB基因片段进行PCR扩增和测序,以H37Rv菌株序列为参考,比较耐药菌株和敏感菌株的突变特征.结果 19株耐药菌株中有14株检出rpsl基因突变,突变率为73.7％(14/19),其中12株为AAG43AGG突变,1株为AAG43AAT突变,1株为AAG88AGG突变;20株敏感菌株中有1株发生rpsl基因AAG43AGG突变,突变率为5.0％;耐药菌株和敏感菌株均未检测出rrs基因突变.19株耐药菌株中有16株检出embB基因突变,突变率为84.2％(16/19),突变包括6株ATG306GTG突变,ATG306ATA、ATG306ATT和ATG306ATC突变各1株;GGC406GCC和GGC406AGC突变各3株,1株CAG497CGG突变;20株敏感菌株未检测出突变.结论贵阳地区结核分枝杆菌菌株链霉素和乙胺丁醇耐药相关基因突变具有多样性;优势突变分别为rpsl43和embB306位点突变.【期刊名称】《中国人兽共患病学报》【年(卷),期】2016(032)008【总页数】5页(P760-764)【关键词】结核分枝杆菌;链霉素;乙胺丁醇;耐药性;基因突变【作者】孙荣;欧维正;王燕;蒙俊;秦万;毕雅坤;陈峥宏【作者单位】贵州医科大学微生物学教研室,贵阳 550025;贵阳市公共卫生救治中心,贵阳 550003;贵阳市公共卫生救治中心,贵阳 550003;贵阳市公共卫生救治中心,贵阳 550003;贵阳市公共卫生救治中心,贵阳 550003;贵州医科大学微生物学教研室,贵阳 550025;贵州医科大学微生物学教研室,贵阳 550025【正文语种】中文【中图分类】R378结核病是由结核分枝杆菌引起的一种传染性疾病，虽然结核病的发病率呈缓慢下降趋势，但是近年来由于耐药结核分枝杆菌的出现和传播，使得结核病的疫情仍然不容乐观。
结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分离株emb B基因突变研究顾德林;石彩芳;陈俊林;施军卫;施慧慧【期刊名称】《临床肺科杂志》【年(卷),期】2010(015)011【摘要】目的探讨结核分枝杆菌对乙胺丁醇(EMB)产生耐药的分子机制,建立直接快速检测结核分枝杆菌EMB药物敏感性的实验方法.方法采用聚合酶链反应(PCR)扩增技术对临床耐乙胺丁醇结核分枝杆菌进行PCR扩增,扩增产物经纯化后,直接进行DNA测序分析.结果 54例临床分离株中,19例为EMB敏感株,35例为EMB耐药株.35例耐药株中13例(37.1%)发生基因突变.13例基因突变皆为错义突变,且有1例同时发生310位和313位突变.结论 emb B306位氨基酸Met被置换是结核分枝杆菌对乙胺丁醇产生耐药性的重要机制,测序分析可以确认耐药基因的突变位点,是快速检测耐乙胺丁醇结核分枝杆菌的快速、有效的方法.【总页数】3页(P1556-1558)【作者】顾德林;石彩芳;陈俊林;施军卫;施慧慧【作者单位】226003,江苏,南通,南通市第六人民医院;226003,江苏,南通,南通市第六人民医院;226003,江苏,南通,南通市第六人民医院;226003,江苏,南通,南通市第六人民医院;226003,江苏,南通,南通市第六人民医院【正文语种】中文【相关文献】1.结核分枝杆菌耐喹诺酮临床分离株gyrA基因突变的研究 [J], 安慧茹;王巍;李洪敏;梁建琴;刘真;李素梅;何珂2.结核分枝杆菌耐氧氟沙星临床分离株gyrA基因突变的研究 [J], 闫丽萍;肖和平;郑瑞娟;胡忠义;乐军;景玲杰3.耐异烟肼结核分枝杆菌临床分离株耐药基因突变及其分子流行病学调查研究 [J], 刘佳文;申阿东;孙桂芝4.7株结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分离株embB基因测序分析 [J], 伍学强;张舒林;王庚琴5.结核分枝杆菌耐乙胺丁醇分离株embB基因突变的检测 [J], 李庆华因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
网络出版时间:2019－1－1114:07网络出版地址:http ://kns．cnki．net /kcms /detail /34．1065．r．20190109．1117．035．html耐药结核分枝杆菌与耐药基因突变的相关性分析孔伟伟1，邢应如2，胡万发2，胡东3，吴璇1，于莉1，汪旻旻1，黄升海12018－10－31接收基金项目：国家自然科学基金（编号：81371797、81571528）；淮南市科技计划项目（编号：2015A2401、2017A0592）作者单位：1安徽医科大学基础医学院微生物学教研室，合肥2300322安徽理工大学附属肿瘤医院，淮南2320353安徽理工大学，淮南232001作者简介：孔伟伟，女，副主任技师，硕士研究生；黄升海，男，教授，硕士生导师，责任作者，E-mail ：huang-shh68@aliyun．com摘要探讨结核患者结核分枝杆菌（MTB ）耐药性与基因突变情况。
68例临床分离菌株采用罗氏药敏实验检测MTB 对利福平（ＲFP ）、异烟肼（INH ）、链霉素（SM ）、吡嗪酰胺（PZA ）和乙胺丁醇（EMB ）的耐药情况，采用聚合酶链反应－单链构象多态性分析（PCＲ-SSCP ）检测MTB 临床分离株耐利福平（rpoB ）、异烟肼（katG ）、链霉素（rpsL ）、吡嗪酰胺（pn-cA ）、乙胺丁醇（embB ）基因突变率，5种耐药基因突变率依次为78.2%、69.8%、72.2%、43.8%、31.4%，其中高耐株基因突变率分别为92.1%、80.0%、87.5%、72.0%、45.5%。
低耐株分别为47.1%、25.0%、28.5%、13.0%、7.7%。
MTB 耐药基因突变与耐药水平密切相关，PCＲ-SSCP 法检测结核分枝杆菌rpoB 、katG 、rpsL 、pncA 和embB 基因突变快速、敏感、特异。
关键词结核分枝杆菌；药敏实验；聚合酶链反应－单链构像多态性中图分类号Ｒ378．91+1文献标志码A 文章编号1000－1492（2019）02－0329－04doi ：10．19405/j．cnki．issn1000－1492．2019．02．035在医学迅速发展的今天，全球仍有约1/3人口受过结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis ，MTB ）感染，且每年都有新增病例，相关研究［1］显示，我国是全球22个结核病高负担国家之一。
耐多药结核分枝杆菌基因位点表达研究戚应杰;查晓丹【期刊名称】《实用医学杂志》【年(卷),期】2016(32)24【摘要】目的:了解临床分离的耐多药结核分枝杆菌菌株耐药基因的突变情况.方法:采用基因芯片法对耐多药结核分枝杆菌临床分离菌株的耐药基因进行检测,研究其耐药基因突变情况.结果:80株耐多药结核分枝杆菌临床分离株中未见单一耐药情况,全部耐异烟肼(isoniazid,INH)+利福平(rifampicin,RFP),其中耐异烟肼+利福平+链霉素(streptomycin,SM)+乙胺丁醇(ethambutol,EMB)的耐药率明显高于其他耐药情况,差异有统计学意义(P＜0.05).rpoB基因突变位点主要为第S531L、D516G、H526Y、D516V、H526D位密码子,其中第S531L和D516G位密码子突变率分别为72.5％和75.0％,明显高于其他密码子,差异有统计学意义(P＜0.05).katG基因突变位点主要为第315M位密码子,突变率为75％.inhA基因突变位点主要为第-15M位密码子,突变率为87.5％.rpsL基因突变位点主要为第43M、88M位密码子,突变率分别为85.2％、14.8％.embB基因突变位点主要为第306M2位密码子,突变率为65％.结论:PCR及基因位点突变测定可快速检测耐多药结核分枝杆菌的耐药基因,结核分枝杆菌耐多药性与多个耐药基因突变相关.【总页数】4页(P4118-4121)【作者】戚应杰;查晓丹【作者单位】230022合肥市,安徽省立医院感染病院检验科;230022合肥市,安徽省立医院感染病院检验科【正文语种】中文【相关文献】1.合肥地区耐多药结核分枝杆菌异烟肼、链霉素及乙胺丁醇耐药相关基因位点表达研究 [J], 戚应杰; 刘婷; 查晓丹; 石玉如; 王云; 岳莉; 马筱玲2.重庆市耐多药结核分枝杆菌对贝达喹啉和德拉马尼的药物敏感性研究 [J], 罗明; 陈耀凯; 张汇征; 严晓峰; 曹培明; 廖传玉; 何瑛; 李晓旭; 王静; 李同心3.浙东地区耐多药结核分枝杆菌耐药特性及分子机制研究 [J], 石庆新;陆如岳;於青峰;涂茜;李蒿蒿;蔡莺莺;周秋菊;周凯;王冬莲4.徐州市耐多药结核耐药分析及分枝杆菌基因突变特征研究 [J], 刘加彬;张瑞梅;刘成永5.甘肃耐氨基糖苷类结核分枝杆菌样本相关基因位点的研究 [J], 高恺;同重湘;杨增伟;吴玲;车团结因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
结核分支杆菌耐乙胺丁醇分子机制及其耐药基因检测方法的研究摘要ｆ≮箩１，《目的：为ｌ阐呀结核分支杆菌耐乙胺丁醇（ＥＭＢ）的分子机制，了角姑核分支杆菌耐ＥＭＢ分离株ｅｍｂＢ基因突变情况，ｚＯｔ：瓠ｍｂＢ基酉突变与ＥＭＢ最小抑菌浓度（ＭＩＣｓ）之间的关系；探番累合酶链反应．单链构象多态性（ＰＣＲ－ＳＳＣＰ）分析技术检测结核分支杆菌耐乙胺丁醇的应用价值，建立快速、有效的结核分支杆菌药物敏感性试验方法。
３ｆ方法：临床标本进行传统分支杆菌培养、菌种鉴定和药敏试验；对耐药结核分支杆菌分离株进行ＥＭＢ最低抑菌浓度（ＭＩＣｓ）测定，ＥＭＢ浓度如下：０、５、１０、２０、３０、５０ｕｇ／ｍｌ；通过１６Ｓ“ⅢＡＰＣＲ．ＳＳＣＰ分析方法对１６０株临床分离株进行分支杆菌初步分子菌种鉴定；通过ＰＣＲ．ＳＳＣＰ、ＰＣＲ．限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）和ＰＣＲ．直接测序（ＤＳ）技术分析结核分支杆菌临床分离株ｅｍｂＢ基因。
结果：１６０株分离株经ＰＣＲ．ＳＳＣＰ初步分子菌种鉴定，５株为非结核分支杆菌，１５５株为结核分支杆菌复合群．对１５５株结核分支杆菌进行了传统药物敏感性试验，３８株为ＥＭＢ敏感株，１１７株为耐ＥＭＢ菌株。
用引物Ｅ４和Ｅ５及Ｅ６和Ｅ７分别扩增６８株结核分支杆菌耐ＥＭＢ分离株和３８株ＥＭＢ敏感株ｅｍｂＢ基因，产生３６５ｂｐ和２５８ｂｐ片段。
引物Ｅ４和Ｅ５扩增ｅｍｂＢ基因３６５ｂｐ片段的敏感性为１０ｐｇ；引物Ｅ６和Ｅ７扩增ｅｍｂＢ基因２５８ｂｐ片段的敏感性为１００ｆｇ。
对２２株分支杆菌及８株非分支杆菌标准株ｅｍｂＢ基因２５８ｂｐ片段进行扩增，结果显示引物Ｅ６和Ｅ７是分支杆菌属特异的。
以结核分支杆菌标准菌株Ｈ，，Ｒｖ做对照，１０６株结核分支杆菌临床分离株ｅｍｂＢ基因２５８ｂｐ扩增片段经限制性内切酶ＨａｅｌＬＩ酶切后，进行１５％聚丙烯酰胺凝胶电泳（ＰＡＧＥ），结果显示：３８株ＥＭＢ敏感株和６０株耐ＥＭＢ菌株的ＰＣＲ．限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）图谱与结核分支杆菌标准株相同，余８株耐ＥＭＢ菌株ＲＦＬＰ图谱与结核分支杆菌标准株有明显差异。
结核分枝杆菌耐药表型与耐药基因型相关性研究进展陈珊;刘厚明;单万水【期刊名称】《中国感染控制杂志》【年(卷),期】2016(015)011【总页数】4页(P883-886)【关键词】结核分枝杆菌;分子机制;表型耐药;耐药基因【作者】陈珊;刘厚明;单万水【作者单位】广东医科大学，广东湛江 524000;深圳市第三人民医院，广东深圳518000;深圳市第三人民医院，广东深圳 518000【正文语种】中文【中图分类】R378.91+120世纪80年代以来，结核病(tuberculosis，TB)疫情呈全球性回升趋势，我国作为全球最大的发展中国家，同时也是全球TB疫情最严重的国家之一[1]。
随着全球耐药结核病(drug-resistant tuberculosis，DR-TB)的出现和传播，特别是耐多药结核病(multidrug-resistant TB，MDR-TB)、广泛耐药结核病(extensively drug-resistant TB，XDR-TB),以及全耐药结核病(totally drug-resistant TB，TDR-TB)发生率的增高，全球TB的有效治疗和控制受到严重威胁。
深入研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)的耐药分子机制，发现基因突变是MTB 产生耐药的重要原因。
现就各抗结核药物的耐药表型与耐药基因型的相关性研究进行综述。
RFP为半合成广谱杀菌剂，是最有效的抗结核药物之一，在短期化学治疗中起重要作用。
RFP通过与细菌RNA聚合酶的β亚单位牢固结合，抑制细菌mRNA的合成，防止该酶与DNA连接，从而干扰、阻断RNA转录过程。
MTB RNA聚合酶β亚单位由rpoB基因编码，当rpoB基因个别密码子发生突变时，DNA依赖性RNA聚合酶β亚单位的空间构象发生改变，无法与RFP结合，从而表现为耐药。
现已知95%～99%的MTB耐RFP主要是因rpoB基因在507-533位密码子共81 bp的核心区域内(rifampicin resistance determining region，RRDR)[2-3]碱基发生突变、缺失、颠换等导致。
收稿日期22基金项目新疆兵团医药卫生专项(G G 3)作者简介张向晖(82),女,硕士生,专业方向为抗感染免疫。
通讯作者袁 俐(62),女,教授,从事抗感染免疫的研究。
2y 83@y 。
第25卷 第6期2007年12月石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University (Natural S cience )V ol.25 N o.6D ec.2007文章编号:100727383(2007)0620668204乙胺丁醇耐药结核分枝杆菌embB 基因分析张向晖1,李奇凤1,杨 坚2,王远志1,吴万贵1,王 仙1,邢建新1,袁 俐1(1石河子大学医学院,新疆石河子832002;2石河子大学医学院第一附属医院,新疆石河子832002)摘要:了解结核分枝杆菌耐乙胺丁醇(E M B )分离株emb B 基因突变情况,研究其应用价值。
通过聚合酶链反应2单链构象多态性(PCR 2SSCP )和PCR 2限制性片段长度多态性(RF LP )技术分析98株新疆部分地区结核分枝杆菌临床分离株embB 基因。
以H37Rv 标准株为对照,52株药物敏感株的emb B 基因SSCP 均泳动正常,RF LP 和测序分析与对照株相同。
46株耐E MB 分离株中,28株(60.9%)emb B 基因SSCP 泳动异常;5株RF LP 分析异常;测序分析5株均为306位密码子突变,为ATG →AT A 。
部分结核分枝杆菌耐EM B 是由于其embB 基因突变所致,PCR 2SSCP 和PCR 2RF LP 技术可能成为测定部分结核分枝杆菌E MB 耐药简便、快速的方法。
关键词:结核分枝杆菌;乙胺丁醇;耐药性;embB ;PCR 2SSCP ;PCR 2RF LP 中图分类号:R378191+1 文献标识码:A 近年来,结核病再次成为全球性的重大公共卫生问题。
我国属于全球结核病高发国家之一,结核病人数居世界第二[1],新疆活动性肺结核患病率是全国平均水平的1.26倍[2]。
embB基因突变与乙胺丁醇药敏表型及耐多药关系的研究刘厚明;单万水;曾敏;李全;赵艳敏;邹婧;林牧;赵丹;肖颜玉;邓群益【摘要】目的研究结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)embB306位点及其他突变位点与乙胺丁醇(ethambutol,EMB)的耐药表型及耐多药(multidrug resistant,MDR)的关系;分析embB基因突变与EMB药敏表型及MDR的关系. 方法对临床分离的MTB采用BD MGIT 960 SIRE试剂比例法进行药敏试验,取48株EMB耐药、46株EMB敏感但耐其他药及7株四药均敏感MTB提取核酸并扩增embB基因全序列,对扩增产物进行测序分析embB基因序列,与H37Rv标准株序列比对,分析embB基因各突变位点、形式及频率. 结果 101株MTB发现embB基因序列上有17个不同位点突变形式.53株MTB在embB 基因序列上发生突变,其中46株为EMB耐药,7株为EMB敏感;embB基因野生型的MTB有48株,其中2株为EMB耐药,46株为EMB敏感;embB突变型与embB 野生型的MTB之间EMB耐药率有显著性差异(x2=68.95,P＜0.01).101株MTB 中MDR有51株,其中有42株发生embB突变,9株为embB基因野生型,embB 基因突变率在MDR和非MDR之间有显著性差异(x2=36.9,P＜0.01). 结论embB306位点与EMB耐药及MDR中度相关,embB基因突变与EMB耐药及耐多药结核菌(multidrug resistant-Mycobacteriumtuberculosis,MDR-TB)高度相关,embB基因突变可作为MDR-TB的检测分子标记物,指导临床用药.【期刊名称】《分子诊断与治疗杂志》【年(卷),期】2017(009)001【总页数】8页(P16-22,32)【关键词】结核分枝杆菌;embB基因;突变;乙胺丁醇;耐多药【作者】刘厚明;单万水;曾敏;李全;赵艳敏;邹婧;林牧;赵丹;肖颜玉;邓群益【作者单位】深圳市第三人民医院检验科,广东,深圳518112;深圳市第三人民医院检验科,广东,深圳518112;深圳华大基因研究院,广东,深圳518083;深圳华大基因研究院,广东,深圳518083;深圳华大基因研究院,广东,深圳518083;深圳华大基因研究院,广东,深圳518083;深圳市第三人民医院检验科,广东,深圳518112;深圳市罗湖区慢性病防治院检验科,广东,深圳518029;深圳市第三人民医院检验科,广东,深圳518112;深圳市第三人民医院肺病科,广东,深圳518112【正文语种】中文据世界卫生组织2013年调查数据显示，中国的结核病患者约为85.5万人，其中耐多药（multi⁃drug resistant，MDR）结核病患者约为5.4万人，我国的结核病和MDR结核病患病严重程度仅次于印度［1］，为世界第二大结核病和MDR结核病负担大国，控制耐药和MDR结核病的流行已经成为中国结防工作的迫切任务。
乙胺丁醇（ethambutol，EMB）是治疗结核病的一线用药之一，EMB作用于靶分子阿拉伯糖基转移酶，抑制了阿拉伯糖基聚合入阿拉伯半乳糖，从而影响MTB的细胞壁分枝菌酸⁃阿拉伯半乳聚糖⁃肽聚糖复合物的形成，发挥抑菌作用，使靶分子在细胞内的药物更容易进入细胞，使联合用药发挥协同作用［2］。
目前大部分研究认为MTB耐EMB与阿拉伯糖基转移酶的编码基因embABC操纵子表达增高或突变有关，其中embB基因突变改变了阿拉伯糖基转移酶结构，从而引起耐药［3］。
Morkrouslv等［4］对embB306与临床结核病的EMB耐药关系之间研究显示embB序列中306位点突变最常见（约48.3％的EMB耐药和32.5％的EMB敏感但耐其他一线药的MTB发生306位点突变），但是306位点以外的embB基因突变也可引起EMB耐药，如在耐EMB分离株中，还可以检测到如下基因位点突变：285Phe→Leu、330Phe→Val、630Thr→Ile等［4⁃6］，说明除306位点外还存在其他耐EMB MTB的基因突变位点。
本研究对深圳市结核病患者分离的MTB embB基因全序列（3 297 bp）进行测序分析，期许发现更多与耐EMB相关的embB突变位点，提高MTB的EMB药敏鉴定的准确性，可有效控制耐EMB结核病和MDR的流行。
1.1 研究对象对2013年1月至2014年5月来院就诊结核病患者9 038份标本进行MTB的分离、培养和鉴定，共分离出MTB 2 243株，对其中865株进行BD MGIT 960 SIRE液体药敏试验，选取所有EMB耐药48株，占5.55％（48/865），取EMB 敏感但耐其他药46株，4种药物全敏感7株，共计101株进行研究。
1.2 药物敏感性测定使用在国际上作为MTB药物敏感性检测的“金标准”——比例法，严格按照BD MGIT 960 SIRE液体药敏试验操作说明书进行，利福平（ri⁃fampin，RFP）、异烟肼（isonicazide，INH）、EMB和链霉素（streptomycin，SM）药敏判读折点浓度分别为1 mg/L、0.1 mg/L、5 mg/L和1 mg/L，结果判读为耐药（R）或敏感（S）。
本文MDR是指至少同时耐利福平和异烟肼，多耐药是指不同时耐利福平和异烟肼，但至少耐2种药。
1.3 核酸提取取MTB培养阳性菌悬液1 mL，80℃灭活60 min，13 300 rpm离心10 min，弃上清；沉淀用1 mL生理盐水悬浮，13 300 rpm离心10 min，弃上清；重复上述步骤一次。
沉淀加入50 μL去离子水，涡旋震荡混匀，干浴锅100℃×10 min，13 300 rpm离心10 min，离心后的上清即可作为PCR扩增模板。
1.4 目的基因扩增、测序及测序数据分析将核酸提取物送至深圳华大基因研究院进行目的基因扩增测序及测序数据分析，根据M.tuber⁃culosis H37Rv菌株的标准参考序列（GenBank ac⁃cessionno.NC_000962）设计embB基因全序列（3 297 bp）的PCR扩增引物，上游引物（5′⁃3′）序列为AATCAGGCTCCAGACGC，下游引物（5′⁃3′）为TACCGAGCAGCATAGGAG。
PCR反应条件：（1）94℃，1 min预变性；（2）94℃，30 s变性；（3）58℃，30 s退火；（4）72℃，210 s延伸；（5）步骤（2）～（4）循环30次；（6）72℃，7 min；（7）12℃，保持。
采用Sanger 测序法对embB基因全序列进行测序，利用软件DNAstar Lasergene进行序列拼接和与embB基因标准序列的比对，分析突变位点。
本研究对embB基因的核苷酸或氨基酸位点均采用大肠杆菌的编号系统进行描述。
1.5 统计学分析统计学软件为SPSS 19.0分析数据，两组间的差异分析采用完全随机设计的两样本率比较（卡方检验），P＜0.05表明差异有统计学意义。
2.1 比例法液体药敏试验结果入选的101株MTB标本比例法药敏试验，48例EMB耐药和53例EMB敏感，其中MDR 51株，多重耐药20株，结果见表1。
2.2 基因测序及突变结果本次研究发现embB序列上出现的基因突变位点一共有17个，已被录入tbdreamdb结核分枝杆菌基因数据库［7］的突变位点有306、406、534、328、497（Q→K，Q→R）和1 024位点。
未被记录入tbdreamdb MTB基因数据库的突变位点有113、201、246、319、330、354、405、573、521、609和679位点以及Q497P、Q497H这2个碱基替换类型。
306位点突变有27株菌，26株306位点突变样本的药敏表型为EMB耐药，1株306位点突变的MTB药敏为EMB敏感。
497（Q→K，Q→H，Q→P）、406、328、354、330、319、405、1 024和521位点突变的MTB药敏为EMB耐药。
246、679、113和534突变位点的MTB药敏为EMB敏感。
201和306位点在一个MTB上联合突变，其药敏为EMB耐药；609和330位点在一个MTB上联合突变，其药敏为EMB敏感；246、497（Q→R）和573位点在一个MTB上联合突变，其药敏为EMB敏感。
具体结果如表2所示。
2.3 基因突变与EMB药敏相关性分析101个检测样本中53株MTB发生embB基因突变，其中46株embB基因突变为EMB耐药，占86.8％（46/53），7株embB基因突变为EMB敏感，占13.2％（7/53）；48株embB基因野生型MTB中耐EMB的只有2株，embB基因野生型MTB的EMB耐药率为4.2％（2/48），46株embB基因野生型MTB为EMB敏感菌株。
embB基因突变型与embB基因野生型MTB的EMB耐药率进行比较，有统计学意义，二者有显著性差异，embB突变型MTB的EMB耐药率明显比embB野生型MTB的EMB耐药率高。
详细结果见表3。
2.4 基因突变与MDR⁃TB相关性分析根据表4，101个样本中MDR⁃TB一共有51株，其中embB基因突变型的MDR⁃TB有42株，占82.3％（42/51）；embB基因野生型的MDR⁃TB有9株，占17.6％（9/51）。
MDR⁃TB在embB基因突变型和embB基因野生型之间进行比较，有统计学意义，二者有显著性差异，embB基因突变率MDR⁃TB较非MDR⁃TB更高。
详细结果见表5。
embB基因突变与MTB的EMB药敏表型及MDR的关系：吴雪琼等［2，5］相关研究发现36％～69％的MTB耐EMB分离株有embB基因突变，本次研究深圳市MTB基因检测结果显示耐EMB的MTB分离株中embB基因突变检出率为95.8％（46/48），深圳市MTB耐EMB的embB基因突变率更高。
embB基因突变型与野生型EMB耐药率有统计学意义，embB基因突变型比野生型EMB耐药率明显增高，提示embB基因突变与EMB耐药密切相关，与大多数研究文献的结论一致［5，8⁃12］。
因此笔者认为MTB发生embB基因突变与深圳地区的MTB耐EMB高度相关。
Ramaswamy等［12］和Shi等［13］文献指出embB基因突变可能是MDR流行的原因之一。
本研究中，MDR⁃TB在embB基因突变型与野生型之间比较有统计学意义，embB基因突变型MTB MDR率明显比野生型的MTB MDR率要高，提示embB基因突变与MDR之间高度相关。
