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Solexa测序原理及实验流程(2011-04-19 09:45:04)Solexa 高通量测序原理Solexa 方法是利用单分子阵列测试 genotyping ，此种测序法首先是将 DNA 从细胞中提取，然后将其打断到约 100 － 200bp 大小，再将接头连接到片段上，经 PCR 扩增后制成 Library 。
随后在含有接头的芯片（ flow cell ）上将已加入接头的 DNA 片段绑定在 flow cell 上，经反应，将不同片段扩增。
在下一步反应中，四种荧光标记的染料应用边合成边测序的原理，在每个循环过程里，荧光标记的核苷和聚合酶被加入到单分子阵列中。
互补的核苷和核苷酸片断的第一个碱基配对，通过酶加入到引物上。
多余的核苷被移走。
这样每个单链 DNA 分子通过互补碱基的配对被延伸，利用生物发光蛋白，比如萤火虫的荧光素酶，可通过碱基加到引物后端时所释放出的焦磷酸盐来提供检测信号。
针对每种碱基的特定波长的激光激发结合上的核苷的标记，这个标记会释放出荧光。
荧光信号被 CCD 采集， CCD 快速扫描整个阵列检测特定的结合到每个片断上的碱基。
通过上述的结合，检测可以重复几十个循环，这样就有可能决定核苷酸片断中的几十个碱基。
Solexa 的这种方法，可在一个反应中同时加入 4 种核苷的标签，采用边合成边测序（SBS － sequencing by synthesis），可减少因二级结构造成的一段区域的缺失。
并具有所需样品量少，高通量，高精确性，拥有简单易操作的自动化平台和功能强大等特点，此反应可以同时检测上亿个核苷酸片断 , 因此在同一个芯片或几个芯片上花费很少（只需常规方法的 1 ％）的成本就可测试全基因组。
实验流程1. 文库制备将基因组DNA打成几百个碱基（或更短）的小片段，在片段的两个末端加上接头(adapter)。
2. 产生DNA簇利用专利的芯片，其表面连接有一层单链引物，DNA片段变成单链后通过与芯片表面的引物碱基互补被一端“固定”在芯片上。
mRNA solexa测序结果分析SSC021目录mRNA solexa测序实验分析方案 (3)Solexa Digital Gene Expression (3)分析方案 (3)一、基因注释（必选） (3)二、差异基因筛选（必选） (4)三、样品之间的比较分析（推荐） (4)四、GO(gene ontology)分析（推荐） (4)五、pathway分析（推荐） (5)六、Knowledge-driven Network分析（推荐） (5)七、转录因子分析（推荐） (5)mRNA solexa测序实验分析方案Solexa Digital Gene Expression基因表达方法采用Illumina Digital Gene Expression试剂盒。
选取起始1～2µg总RNA，利用OligodT的beads富集总RNA样本中mRNA，并逆转录为双链cDNA，采用4碱基识别酶DpnII酶切双链cDNA，链接Illumina adapter1，利用MmeI酶切3’端20碱基，并在3’端链接Illumina adapter2。
再加入Primer GX1和Primer GX2, 进行15个循环的PCR扩增（10 seconds at 98°C， 30 seconds at 60°C，15 seconds at 72°C ，10 minutes at 72°C）。
扩增后样本通过6% TBE PAGE 胶回收85碱基条带，纯化后通过Illumina基因表达测序法测序。
分析方案一、基因注释（必选）我们将测序结果进行比对和分析，确定tag代表的基因，用于后续分析。
结果样板：二、差异基因筛选（必选）对样品之间进行差异基因筛选。
筛选到表达有差异变化的基因。
然后对变化基因的趋势进行归类，以方便分析和描述。
实例如下图：三、样品之间的比较分析（推荐）我们将通过曲线拟合的方法，寻找样品之间趋势差异最大的一些基因：四、GO(gene ontology)分析（推荐）对于每一种表达趋势的基因，选择性的进gene ontology:功能分析。
DNA测序技术的发展历史与最新在2002年4月，美国《科学》杂志，登载了一篇长达14页的论文尤其引人注目―――《水稻（籼稻）基因组的工作框架序列图》。
2004年12月，水稻基因组“精细图”全部完成 2004年12月10日，中国科学家在世界上率先完成的家蚕基因组“框架图”及基因组生物学分析成果在世界科学类权威的学术期刊――《Science》杂志上发表。
2009年12月13日，Nature杂志刊登了由深圳华大基因研究院领衔完成的大熊猫基因测序。
DNA测序技术的发展历史与最新进展主讲人：金瑞营第一代DNA测序技术成熟的DNA测序技术始于20世纪70年代中期。
●1977年am 和Gilbert报道了通过化学降解测定DNA序列的方法。
●同一时期, Sanger发明了双脱氧链终止法● 20世纪90年代初出现的荧光自动测序技术将DNA测序带入自动化测序的时代。
这些技术统称为第一代DNA测序技术。
化学降解法在该方法中,一个末端被放射性标记的DNA片段在5组互相独立的化学反应中分别被部分降解,其中每一组反应特异地针对某种碱基。
因此生成5组放射性标记的分子,每组混合物中均含有长短不一的DNA分子,其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA片段上的位置。
最后,各组混合物通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离,再通过放射自显影来检测末端标记的分子。
双脱氧链终止法原理：核酸模板在DNA 聚合酶、引物、4种单脱氧核苷三磷酸 dNTP,其中的一种用放射性P32标记存在条件下复制时,在四管反应系统中分别按比例引入4种双脱氧核苷三磷酸ddNTP ,因为双脱氧核苷没有3′ -OH,所以只要双脱氧核苷掺入链的末端,该链就停止延长,若链端掺入单脱氧核苷,链就可以继续延长。
如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3′端的一系列长度不等的核酸片段。
反应终止后,分4个泳道进行凝胶电泳,分离长短不一的核酸片段,长度相邻的片段相差一个碱基。
经过放射自显影后,根据片段3′端的双脱氧核苷,便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序。
新一代基因测序技术原理和应用基因测序技术是解读生物基因组的重要方法之一，对于深入了解生物基因的结构和功能起着至关重要的作用。
近年来，随着科学技术的不断发展，新一代基因测序技术的出现，进一步提高了测序速度与准确度，为基因研究和应用提供了更多可能性。
一、新一代基因测序技术的原理新一代基因测序技术相比传统的Sanger测序技术，采用了高通量并行测序的方法，能够在短时间内同时测定大量的DNA序列，大大提高了测序的效率和准确度。
目前，常用的新一代基因测序技术主要包括Illumina/Solexa 测序、ABI SOLiD测序、454测序和Ion Torrent测序等。
1. Illumina/Solexa测序原理Illumina/Solexa测序是目前应用最广泛的测序技术之一。
其原理主要基于DNA合成过程中的核酸链延伸和荧光信号的检测。
首先，DNA样本经过片段化处理，生成短小的DNA片段。
随后，这些片段会与具有固定引物的光纤芯片上的端子进行连接。
接下来，在PCR反应中进行扩增，生成成千上万个复制物。
之后，将芯片放入Illumina测序仪中，通过循环终止法进行测序。
在每个循环中，通过在碱基末端发行碱基的可逆终止法，每次只释放一种具有特定荧光标记的碱基，并通过激光检测其荧光信号。
最终，通过分析测序结果的荧光信号，可以获得DNA序列。
2. ABI SOLiD测序原理ABI SOLiD（Sequencing by Oligonucleotide Ligation and Detection）测序技术是一种通过链接寡核苷酸和检测碱基的方法进行测序。
其核心原理是通过两个同时存在的碱基标记对DNA进行测序。
首先，DNA片段经过端修复，再通过连接引物的方法进行适配体制备。
然后，在适配体上引入特定的引物序列，将这些标记不同的适配体引物链接到DNA片段上。
在测序过程中，利用红外线激光对适配体的碱基进行激发，并通过信号检测系统检测每个碱基的颜色和强度，进而确定序列。
第二代测序技术（Next-Generation Sequencing）NGS之基础篇2001年，美、英、法、德、日、中六国合作，历时十年，耗资数十亿美元的人类基因组计划（Human Genome Project，HGP）宣告完成。
转眼又是十年过去，在此期间，各国科学家仍在为解读基因的密码而不懈努力，这其中最大的突破，就是第二代测序技术的推出。
HGP的顺利完成证明了我们有能力对自身的遗传信息进行研究，然而，高昂的成本、漫长的时间、巨大的人力需求，无不限制着对遗传密码的进一步认识。
从HGP开始的第一天期，科学家们就在寻求更好的方法来对基因组进行研究，“鸟枪法”就是其中之一。
2006年，美国X大奖基金会（）设立了奖金高达1000万美元的基因组Archon X大奖，旨在奖励第一个在10天内以低于100万美元的成本完成100个人类基因组测序的民间团队。
而罗氏（Roche）、应用生物系统（Applied Biosystems，ABI）、Illumina三家公司先后推出了各自的第二代高通量测序平台，成为NGS领域的领头羊。
2005年底，454公司推出第一个基于焦磷酸测序原理的高通量基因组测序系统——Genome Sequencer 20 System，这是核酸测序技术发展史上里程碑式的事件。
随后，罗氏公司以1.55亿美元收购了454公司，并在2006年推出了更新的GS FLX测序系统，该系统可在10小时的运行中获得100万条读长（reads），4~6亿个碱基信息（base pair），且准确率达到99%以上。
2008年，GS FLX系统再次升级，通量提高了5倍，读长和准确率也有所增加。
虽然454 GS测序平台也许不是市场占有率最高的测序仪，但截至2011年3月，利用该系统进行研究的论文已发表超过1000余篇，而它在读长上的优势明显胜于另两套系统，因此在从头测序（de novo）和宏基因组测序（meta genome）方面有着不可替代的地位。
A p p l i c a t i o n NN o t e :D N A S S e q u e n c i n gClonal Single Molecule Array ™TechnologySequencing templates are immobilized on a proprietary flow cell surface designed to present the DNA in a manner that facilitates access to enzymes while ensuring high stability of sur-face-bound template and low non-specific binding of fluorescently labeled nucleotides. Solid phase amplification is employed to create up to 1,000 identical copies of each single mole-cule in close proximity (diameter of 1 micron or less). Since the process does not involve photolithography, mechanical spotting or positioning of beads into wells, the Clonal Single Molecule Array technology can achieve densities of up to 10 million single molecule clusters per square centimeter.Sequencing-by-SynthesisSolexa’s Sequencing-By-Synthesis (SBS) utilizes four proprietary fluorescently labeled modified nucleotides to sequence the millions of DNA clusters present on the flow cell surface. These nucleotides, specially designed to possess a reversible termination property, allow each cycle of the sequencing reaction to occur simultaneously in the presence of all four nucleotides (A, C, T,G). In each cycle, the polymerase is able to select the correct base to incorporate, with the nat-ural competition between all four alternatives leading to higher accuracy than methods whereonly one nucleotide is present in the reaction mix at a time. Sequences where a particular base is repeated one after another (e.g., homopolymers) are addressed like any other sequence and with high accuracy.Analysis PipelineThe Solexa sequencing approach is built around a very large number of short sequence reads.Deep sampling of more than ten-fold even coverage is required to generate a consensus and thus ensure high confidence in determination of genetic differences. Such differences are identi-fied by comparison of sequence reads to a reference. Deep sampling allows the use of weighted “majority voting” and statistical analysis, similar to conventional methods, to identify homozy-gotes and heterozygotes and to distinguish sequencing errors. Each raw read base has an assigned quality score so that the software can apply a weighting factor in calling differences and generating confidence scores.The suite of software from Solexa will enable users to align sequences to a reference in rese-quencing applications. Developed in collaboration with leading researchers, Solexa’s software suite includes the full range of data collection, processing, and analysis modules to streamline collection and analysis of data with minimal user intervention. The open format of the software allows for easy access to the data at various stages of processing and analysis using simple application program interfaces.本页已使用福昕阅读器进行编辑。
