染色体步移技术

染色体步移技术(Genome walking）：这是一项重要的分子生物学研究技术，使用这种技术可以有效获取与已知序列相邻的未知序列。

染色体步移技术主要有以下几方面的应用：①根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。

如分离克隆启动子并对其功能进行研究；②步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；③鉴定T-DNA或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；④用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；⑤用于人工染色体PAC、YAC和BAC的片段搭接。

对于基因组测序已经完成的少数物种（如人、小鼠、线虫、水稻、拟南芥等）来说，可以轻松地从数据库中找到某物种已知序列的侧翼序列。

但是，对于大多数生物而言，在不了解它们的基因组序列以前，想要知道一个已知区域两侧的DNA序列，只能采用染色体步移技术。

常用的方法有：1. 反向pCR（reverse PCR）:其基本点是用适当内切酶裂解核心区外分子，使这些酶切片段自身连接形成环状分子，从而将边侧区域转化为内部区域。

用与核心区末端同源的引物，但其3’端趄向未知区域，可以进步用pCR扩增环中的未知区域。

反向pCR程序目前，反向pCR所扩增的片段的大小实际上限为3-4kb。

在许多情况下，首先需要进行Southern杂交来确定内切酶用以产生大小适于环化及反向pCR的片段的末端片段。

能裂解核心区的内切酶使反向pCR只能扩增引物所定模板(依赖于引物)的上游或上游区，而不裂解核心区的酶则使两上边侧序列都扩增，并带有由内切酶和环化类型决定的接点。

对于扩增左翼或右翼序列，初试时最好靠近识别上个碱基位位的酶，并已知在核心区有其方便的裂解位点。

如果用反向pCR 从含有大量不同的克隆片段的同一载体中探测杂交探针，建议事先在载体中引入合适的酶切位点。

用T4连接酶在稀DNA浓度下环化更容易形成单环。

１依赖酶切连接的PCR这类方法首先对基因组DNA酶切之后，然后让酶切产物自我成环或在酶切产物末端加上相应的接头。

以已知序列上的特异引物或接头上的锚定引物，扩增已知序列的上下游侧翼序列。

1.1 反向PCR反向PCR（inversPCR，IPCR）是Triglia等提出的扩增已知序列上游和下游未知序列的方法。

该方法的基本原理是对已知序列进行分析，选择已知序列中没有的限制性内切酶位点，酶切基因组DNA后，酶切片段环化自连，然后利用已知序列设计的反向引物，扩增已知序列两侧的未知序列，原理如图１。

因此，这种方法包含以下３个步骤：（１）基因组DNA 酶切；（２）线性酶切产物环化；（３）已知序列处设计的反向引物扩增目标片段。

在PCR 扩增之前，也可以根据已知序列用合适的内切酶将环化的DNA切割成线性DNA，这样更利于PCR反应的进行。

图1：反向PCR原理图最初，IPCR用于扩增基因组DNA的侧翼未知序列，后来利用T4聚合酶补平双链cDNA 末端后再环化，可以有效扩增已知cDNA的侧翼未知序列。

然而，IPCR存在技术缺点：（１）环化过程难以控制，基因组DNA酶切后，不同的酶切片段连接成线性串联体，致使非特异性扩增；（２）基因组DNA酶切位点随机分布，可能产生过长的酶切片段导致PCR扩增效率下降，成功率降低。

Benkel等在此基础上对IPCR的反应体系改进，可以扩增长达40Kb的片段。

Kohda等在对基因组DNA酶切之后，环化连接过程中，酶切位点之间加上一段桥连片段，有效扩增侧翼片段，这种方法称为桥连反向PCR（BI-PCR）。

BI-PCR扩增的特异性更高，操作更加简便。

最近，Tsaftaris等利用改进的滚环复制反向PCR从植物基因组DNA中成功分离出3Kb的启动子序列。

以IPCR为代表的连接成环PCR策略是首次利用PCR技术进行的染色体步移技术。

以此为基础，对基因组DNA酶切，在酶切末端加上接头或通过相应的方法在酶切末端加上已知序列，获得目标序列的PCR扩增的染色体步移技术大量涌现。

遗传学名词解释第一章遗传：子代与亲代相似的现象。

变异：子代与亲代不相同的现象。

遗传学：研究生物遗传和变异现象与规律的科学。

第二章染色体：完整的包裹在蛋白质基质中的DNA分子。

真核生物细胞处于分裂期，DNA逐渐螺旋化卷曲，呈现有固定形态的棒状小体。

染色质：细胞未分裂时，呈现出伸展和高度分散状态、没有固定形态结构的纤细网状物。

着丝粒：一种盘状结构，2条染色单体连接的部位。

主缢痕：着丝粒不会被染料染色，所以在光学显微镜下表现为染色体上一缢缩部位(无色间隔点)，所以又称为主缢痕。

次缢痕：某些染色体的一个或两个臂上往往还具有另一个染色较淡的缢缩部位，称为次缢痕；通常在染色体短臂上。

随体：次缢痕的末端的圆形或略长形的突出体，称为随体。

核仁组织中心：次缢痕在细胞分裂时，紧密地与核仁相联系。

与核仁的形成有关，因此也称为核仁组织中心(NOR)。

同源染色体：大小及形态相同，分别来源于父本和母本的一对染色体。

非同源染色体：形态结构不同的各对染色体。

性染色体：许多物种中，存在的一对形态和结构不同的同源染色体。

常染色体：除性染色体之外的其它染色体。

染色体组型或核型：由体细胞中全套染色体按形态特征(包括染色体长度、着丝点位置、臂比、随体有无等)和大小顺序排列构成的图形。

染色体带：当染色体被酶或其它化学药品处理后，经过染色显示出的深浅不同的带纹。

带型：不同的染色体具有的不同形态带的组成。

染色体显带：染色体带显示的过程。

由于实验中处理方法的不同，可以获得不同的带型模式，如Q带、G带、N带、R带和C带等。

显带的机制：一般认为所显示的带为异染色质在染色体上分布的区域。

异染色质：在细胞间期染色质线中，染色很深的区段。

常染色质：染色质线中染色很浅的区段。

半保留复制：一个DNA分子经过复制形成两个完全相同的子代DNA分子，子代DNA分子中都保留了亲代DNA双链中的一条，这种方式称为半保留复制。

无丝分裂：指通过细胞核拉长（呈哑铃状），中部缢缩形成2个相似的子细胞的过程。

河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 写出原核表达实验步骤。

答案：原核表达实验步骤如下：（1）按上述步骤提取该组织的RNA，反转录为cDNA。

（2）以cDNA为模板，用上述引物扩增出带酶切位点的A基因片段。

（3）用BamHI和EcoRI分别切割目的片段和表现形式，连接酶将A基因和载体连接起来构成重组质粒。

（4）将并购质粒大肠杆菌转入感受态的大肠杆菌BL21中，涂布，根据载体所携带抗性的标记筛选出稳定遗传重组质粒的单克隆。

（5）摇菌、扩大培养，待菌液繁衍到对数生长期，收集菌体，裂解、收集蛋白质。

（6）将总蛋白制备成溶液通过镍柱，由于A蛋白携带有His标签，可以被吸附在镍柱上以，然后加缓冲液将吸附在镍柱上的A蛋白洗脱下来，即可得到A蛋白溶液。

解析：2、判断题（55分，每题5分）1. 组蛋白基因、rRNA基因和tRNA基因等都属于串联重复基因，它们的产物都是细胞所大量需要的。

（）答案：正确解析：串联重复基因的特点下述：①各成员之间有高度的序列一致性，甚至完全相同；②拷贝数高，常会十几个甚至几百个；③是非转录的间隔区短而一致。

组蛋白基因、rRNA基因和tRNA基因等都属于串联重复基因，它们的产物都是细胞所大量需要有的。

2. 一个基因就是一个转录单位。

（）答案：错误解析：转录单位是一段可被 RNA聚合酶转录成一条已连续的mRNA的DNA，包括转录起始和终止无线电波。

转录单位有别于基因，转录单位可能同时包含一个基因，也可能同时包含几个基因，另外，转录单位还包含启动子，非编码序列等。

所以，转录单位包含的DNA范围比基因广。

3. DNA中AT含量越高，其Tm值越高。

（）[扬州大学2019研]解析：4. 同一种真核mRNA前体，由于在不用细胞或组织中的差异剪辑，可以表达出多种氨基酸序列、长度及糖基化程度不同的多肽。

染色体步移法
染色体步移法是一种基因工程技术，它可以插入、替换或删除特定基因片段，从而改变生物体的基因组成。

该技术已经应用于许多领域，例如医学、工业和农业，它为人类社会带来了巨大的利益。

染色体步移法的基本原理是将外源DNA序列定点引入到宿主染色体的特定位置上。

这种操作需要通过DNA重组技术，将外源DNA片段与宿主DNA片段分别进行切割，生成可互相配对的DNA末端。

然后将外源DNA片段与宿主DNA片段配对，最终在宿主DNA中形成一个新的友好结构，从而完成外源DNA定点插入的目标。

这项技术在医学上的应用非常广泛，例如它可以用于治疗遗传性疾病。

这种疾病是由于某些基因突变而导致的，通过染色体步移法，可以将正常的基因序列替换到缺陷基因的位置上，从而治愈疾病。

染色体步移法还广泛应用于工业和农业领域。

例如，它可以用于生产更加高效、环保的生物工艺产品，如纤维素酶、乳酸菌等。

在农业领域，它可以用于改良农作物，使得其更加耐旱、抗病、高产等。

不过，染色体步移法仍然存在一些道德和伦理问题，例如是否能够接受基因改造的产品在市场上销售，以及如何确保该技术不会被滥用等。

因此，对于染色体步移法的研究和应用，需要进行更加严谨的规范和监管。

总之，染色体步移法是一种很有前景的基因工程技术，它能够为人类社会带来巨大的好处。

但是，面对伦理和道德问题，我们必须认真思考和探讨，以确保该技术的研究和应用在合法和可持续的范围内实现。

染色体步移技术（Genome Walking）染色体步行是一种常用的克隆已知基因旁侧序列的技术。

染色体步行是指由生物基因组或基因组文库中的已知序列出发逐步探知其旁邻的未知序列或与已知序列呈线性关系的目的序列的核苷酸。

现有的染色体步行PCR技术包括反向PCR、锅柄PCR、连接介导PCR、热不对称PCR、SON PCR等染色体步移技术主要有以下几方面的应用：1. 根据已知的基因或分子标记连续步移，获取人、动物和植物的重要调控基因，可以用于研究结构基因的表达调控。

如分离克隆启动子并对其功能进行研究；2. 步查获取新物种中基因的非保守区域，从而获得完整的基因序列；3. 鉴定T-DNA 或转座子的插入位点，鉴定基因枪转基因法等转基因技术所导致的外源基因的插入位点等；4. 用于染色体测序工作中的空隙填补，获得完整的基因组序列；5. 用于人工染色体PAC、Y AC 和BAC 的片段搭接。

其主要原理是根据已知DNA 序列，分别设计三条同向且退火温度较高的特异性引物（SP Primer），与退火温度较低的兼并引物，进行热不对称PCR 反应。

现在有很多Genome Walking Kit，相应的说明书都介绍得很详尽，下面给你发一个原理图：依据TaKaRa的试剂盒，具体的操作步骤如下：1. 基因组DNA 的获取。

基因组DNA 的质量是侧翼序列获取成功与否的关键因素之一。

建议不要使用只经过简单组DNA（例如：只进行细胞热处理或蛋白酶处理）作为模板，而要使用经过充分纯化的完整的基因组DNA。

此外，由于本方法灵敏度极高，模板DNA 一定不要污染，所需的DNA 量不要少于3 μg。

2. 已知序列的验证。

在进行PCR 实验之前必须对已知序列进行验证，以确认已知序列的正确性。

具体方法为：根据已知序列设计特异性引物（扩增长度最好不少于500 bp），对模板进行PCR 扩增，然后对PCR 产物进行测序，再与参考序列比较确认已知序列的正确性。

DNA Walking步移法加速试剂盒（扩增未知侧翼序列的最佳方法）| [<<][>>]品！科研人员已经发展了几种无需建立cDNA库或筛选克隆的PCR技术方法，用于获取与已知序列相连的未知序列。

这些PCR方法包括反向PCR (IPCR)，连接介导PCR (LM-PCR)和随机引物PCR (RP-PCR)。

虽然这些方法有一定的效果并被不断改进，但是仍然受制于繁琐的酶切，适配体连接 (adaptorligation)和纯化步骤。

而且，RP-PCR的随机引物经常会因为非特异性退火而产生多余产物。

DNA步移法加速试剂盒通过应用专利的ACP（复性控制引物）技术，提高了小片断寡聚核苷酸的特异性，可以克服现有基因步移法的缺点。

DNA步移法加速试剂盒由PCR酶混合物与用于捕获未知目标序列的高特异DNA Walking ACP (DW-ACP)引物组成。

据此优化的PCR反应条件（以下称为DW ACP-PCR技术）可以获取长达3kb的未知侧翼序列。

一种全新的扩增未知目标序列的快速PCR方法。

试剂盒由PCR Master Mix和专为高特异度捕捉未知靶点的独特DNA步移退火控制引物(DW-ACPs)组成。

此最优化的PCR条件，称为 DW ACP-PCR TM 技术，可以获取长达3kb的未知侧区。

此试剂盒是直接扩增未知序列的革命性方法。

"Nature 'Product focus-Transgeni cs' September 7, 2006"!特点：*最简单此方法无须建库，无须酶切，无须固定，也无须复杂PCR*最快捷你的目标产物可在一天内获得，此方法超越其他现有方法*最可靠只获取目标产物应用范围：●基因组步移- 启动子区域的克隆或者测序- 基因结构(外显子/内含子结合区) - 已知序列上下游侧翼的扩增- cDNA步移- 裂隙填补(Gap Filling)- 序列标签位点(STSs)和表达序列标记(EST)的双向测序●转基因位点检测- 在转基因生物如转基因植物，动物，昆虫，鱼和细菌中发现转基因或T-DN A的位置或导向- 直接扩增并分离出具有转基因或T-DNA的侧翼区域的DNA片断●缺失/插入/突变体的检测- 检测基因组DNA或cDNA的缺失，插入，或者突变体- 剪切分析●测序- BAC / PAC DNA的末端测序或者步移- BACs或者基因组DNA的直接测序- 基因组DNA，cDNA或质粒DNA (BAC, PAC, YAC)的测序- 无须亚克隆或者鸟枪克隆即可对BA C或PAC克隆测序- 长链DNA的快速测序- 基因组测序计划*基因组步移-启动子区域的克隆或者测序-基因结构(外显子/内含子结合区) -裂隙填补(Gap Filling)客户列表中国科学院上海生命科学研究院中国科学院动物所中国农业科学院中国热带农业科学院云南大学云南农业大学中国农业大学浙江大学南京农业大学西南农业大学......DNA WALKING REFERRENCE1. Characterization of Mutations in AlHK1 Gene from Alternaria l ongipes: Implication of Limited Function of Two-Component Histid ine Kinase on Conferring Dicarbo ximide Resistance. J. Microbiol. Biotechnol. (2008), 18(1), 15–222. Cloning and Expression Analys is of a Chitinase Gene Crchi1 fr om the Mycoparasitic Fungus Clon ostachys rosea. The Journal of M icrobiology, October 2007, p. 42 2-4303. Cloning and phylogenetic anal ysis of the chitinase gene from the facultative pathogen Paecilo myces lilacinus. Journal of Appl ied Microbiology 103 (2007) 2476–24884. Cloning of the gene Lecanicil lium psalliotae chitinase Lpchi1 and identification of its poten tial role in the biocontrol of r oot-knot nematode Meloidogyne in cognita. Appl Microbiol Biotechn ol (2007) 76:1309–13175. New insights into the evoluti on of subtilisin-like serine pro tease genes in Pezizomycotina. B MC Evolutionary Biology 2010, 1 0:686. Purification and cloning of a novel serine protease from the nematode-trapping fungus Dactyle llina varietas and its potential roles in infection against nema todes. Appl Microbiol Biotechnol (2007) 75:557–5657. 刀孢轮枝菌胞外几丁质酶的基因克隆及系统发育分析. 菌物学报, 20 08, 27(3): 368-376Ki-Bum Park and Suk-Heung Oh(200 7)Cloning, sequencing and expressi on of a novel glutamate decarbox ylase gene from a newly isolatedlactic acid bacterium, Lactobac illus brevis OPK-3. Bioresource Technology 98(2): 312-319.Young-Jun Park, Soo Young Choi, and Hee-Bong Lee(2006)A carboxylesterase from the ther moacidophilic archaeon Sulfolobu s solfataricus P1; purification, characterization, and expressio n.Biochimica et Biophysica (BBA) - General Subjects 1760(5):820-828.Andrey A. Perelygin, Andrey A. Z harkikh, Svetlana V. Scherbik an d Margo A. Brinton (2006)The Mammalian 2′-5′ Oligoadeny late Synthetase Gene Family: Evi dence for Concerted Evolution of Paralogous Oas1 Genes in Rodent ia and Artiodactyla. Journal of Molecular Evolution 63(4):562-57 6.C. Nisbet, I. Butzonitch, M. Col avita, J. Daniels, J. Martin, R. Burns, E. George, M. A. Y. Akho nd, V. Mulholland, and C. J. Jef fries (2006)Characterization of Potato roughdwarf virus and Potato virus P: distinct strains of the same vi ral species in the genus Carlavi rus.Plant Pathology 55(6): 803.Koo BC, Kwon MS, Choi BR, Kim J H, Cho SK, Sohn SH, Cho EJ, Lee HT, Chang W, Jeon I, Park JK, Pa rk JB, Kim T.(2006)Production of germline transgeni c chickens expressing enhanced g reen fluorescent protein using a MoMLV-based retrovirus vector.F ASEB J. 20(13):2251-60.Barbet AF, Lundgren AM, Alleman AR, Stuen S, Bjoersdorff A, Brow n RN, Drazenovich NL, Foley JE. (2006)Structure of the expression site reveals global diversity in MSP 2 (P44) variants in Anaplasma ph agocytophilum. Infect. Immun. 74 (11):6429-37.Chunhong Yan and Douglas D. Boyd (2006)Histone H3 Acetylation and H3 K4 Methylation Define Distinct Chr omatin Regions Permissive for Tr ansgene Expression. Molecular and Cellular Biology 26(17):6357-6 371.Alhapel A, Darley DJ, Wagener N, Eckel E, Elsner N, Pierik AJ.(2 006)Molecular and functional analysi s of nicotinate catabolism in Eu bacterium barkeri.Proc Natl Acad Sci U.S.A. 103(33):12341-6..Knopf RR and Trebitsh T.(2006) The female-specific Cs-ACS1G gen e of cucumber. A case of gene du plication and recombination betw een the non-sex-specific 1-amino cyclopropane-1-carboxylate synth ase gene and a branched-chain am ino acid transaminase gene. Plan t Cell Physiol. 47(9):1217-28..Qizhen Shi, David A. Wilcox, Sco t A. Fahs, Hartmut Weiler, Clive W. Wells, Brian C, Cooley, Dras hti Desai, Patricia A. Morateck, Jack Gorski, and Robert R. Mont gomery (2006)Factor VIII ectopically targeted to platelets is therapeutic in hemophilia A with high-titer inh ibitory antibodies. The Journalof Clinicel Investigation 116( 7):1974-1982.Qizhen Shi, David A. Wilcox, Sco t A. Fahs, Hartmut Weiler, Clive W. Wells, Brian C. Cooley, Dras hti Desai, Patricia A. Morateck, Jack Gorski, and Robert R. Mont gomery (2006)Factor VIII ectopically targeted to platelets is therapeutic in hemophilia A with high-titer inh ibitory antibodies. J. Clin. Inv est. 116(7):1974-1982.Ahu Altinkut, Olga Raskina, Evia tar Nevo and Alexander Belyayev (2006)En/Spm-like transposons in Poace ae species: Transposase sequence variability and chromosomal dis tribution. Cellular & Molecular Biology Letters Issue 11(2)214-2 29.Assaf Distelfield, Cristobal Uau y, Tzion Fahima, and Jorge Dubco vsky (2006)Physical map of the wheat high-g rain protein content gene Gpc-B1 and development of a high-throughput molecular marker. New Phyt ologist 169:753-763.Andrey A. Perelygin, Teri L. Lea r, Andrey A. Zharkikh and Margo A. Brinton (2006)Comparative analysis of vertebra te EIF2AK2 (PKR) genes and assig nment of the equine gene to ECA1 5q24-q25 and the bovine gene to BTA11q12-q15. Genet. Sel. Evol. 38:551-563.Jung-Wook Kim, Yasuo Yamakoshi, Takanori Iwata, Yuan Yuan Hu, He ngmin Zhang, Jan C.-C. Hu, James P. Simmer (2006)Porcine dentin matrix protein 1: gene structure, cDNA sequence, and expression in teeth. Europea n Journal Of Oral Sciences114 (1):33-41.Chengshu Wang and Raymond J. St. Leger(2006)A collagenous protective coat en ables Metarhiziumanisopliae to e vade insect immune responses. PN AS 103:6647-6652.EMIKO HAYAMA, SHIN-ICHIRO IMAMURA, CUIJIAO WU, MAKOTO NAKAZAWA, RUMIKO MATSUOKA and TOSHIO NAKAN ISHI(2006)Analysis of Voltage-Gated Potass ium Channel ß1 Subunits in the P orcine Neonatal Ductus Arteriosu s. Pediatric Research 59:167-17 4.M.-C. Domingo, A. Huletsky, A. B ernal, R. Giroux, D. K. Boudrea u, F. J. Picard and M. G. Berger on(2005)Characterization of a Tn5382-like transposon containing the vanB2 gene cluster in a Clostridium strain isolated from human faece s. Journal of Antimicrobial Chem otherapy 55(4):466-474.Perelygin AA, Lear TL, Zharkikh AA, Brinton MA (2005) Structure of equine 2'-5'oligoad enylate synthetase (OAS) gene fa mily and FISH mapping of OAS gen es to ECA8p15 p14 and BTA17q24q2 5. Cytogenet Genome Res 111(1):5 1-6.Park, M., H. J. Shin, S. Y. Lee, and T. I. Ahn.(2005)Characterization of a cDNA of pe roxiredoxin II responding to hyd rogen peroxide and phagocytosis in Amoeba proteus. J Eukaryot Mi crobiol 52:223-30.中文参考文献:1)扬子鳄MHC Ⅱ类基因的位点分离与多态性检测2)扬子鳄基因组BAC文库及MHC Ⅰ类基因BAC克隆重叠群的构建3)利用转基因小鼠模型进行转基因动物安全评价研究4)稻瘟菌四个致病相关突变位点的定位及侵染钉缺陷突变体的初步研究5)Bacillus sp. BSD-8肌酐降解酶系的研究6)一种快速·有效分离T-DNA插入位点的侧翼序列的方法——DW-ACP-PCR 技术7)刀孢轮枝菌胞外几丁质酶的基因克隆及系统发育分析8)稻瘟病菌突变体Y34-0453的表型分析和T-DNA插入位点的定位。

河南农业大学考研专业课《现代分子生物学》课程试卷（含答案）__________学年第___学期考试类型：（闭卷）考试考试时间：90 分钟年级专业_____________学号_____________ 姓名_____________1、分析题（5分，每题5分）1. 写出从组织中抽取RNA的关键步骤，并解释如何判断RNA质量。

答案：（1）从组织中提取RNA的步骤如下：①将组织在液氮中磨碎，每50～100mg组织加入1ml TRIzol 裂解液溶解样品，充分吹打混匀。

②每1ml TRIzol加入2.0ml氯仿，剧烈震荡15s，室温放置5min。

③4℃，10000g离心15min，此时RNA主要集中在水相中。

④将中多水相转移至新的离心管当中，加入等体积异丙醇，室温放置10min。

⑤4℃，10000g离心10min，此时可在离心管底部这时观察到深蓝色沉淀，即为RNA。

⑥用75冷的氯化氢洗涤沉淀，4℃，7500g以下，离心5min，弃上清。

⑦超净台中吹干，加入无RNase的水溶解。

（2）检测RNA质量的方法如下：①凝胶成像：取适量RNA溶液加入电泳缓冲液后，飞奔琼脂糖凝胶电泳，如果28S和18S条带明亮、清晰，并且28S的亮度在18S条带的两倍以上，则认为RNA的质量是好的。

②吸光度检测：换用紫外分光光度计检测RNA样品在260nm、280nm处的吸光度，若两者的比值在1.8～2.0时，可认为RNA纯度良好，蛋白质等其他物质酵素的污染可以接受。

解析：2、判断题（55分，每题5分）1. 真核生物利用polyA聚合酶在新转录出的mRNA3′端加上polyA尾巴形成polyA＋的mRNA。

（）答案：正确解析：DNA序列中没有多聚T的序列，说明细胞分裂后加上了3′尾巴。

加工过程首先是3′末端一些过剩的核苷酸被核酸外切酶切去，然后由多聚腺苷酸聚合酶催化，以ATP为底物，在mRNA3′末端逐个加上腺苷酸，形成polyA尾巴。

基金项目：国家自然科学基金项目（Ｎｏ．３０７７１３８８）收稿日期：２０１２－０８－３０接受日期：２０１２－０９－２４评述与展望ＲｅｖｉｅｗａｎｄＰｒｏｇｒｅｓｓ染色体步移技术克隆已知序列侧翼启动子的研究进展康丹１方小艳１游腾飞１王婷婷１眭安平２＊杨星勇１，３＊１西南大学生命科学学院，重庆４００７１５；２西南大学图书馆，重庆４００７１５；３重庆师范大学生命科学学院，重庆４０１３３１＊通讯作者，ｔｏｂｐｏｌ３＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ；ｙａｎｇｘｙ９４＠ｓｗｕ．ｅｄｕ．ｃｎ摘要启动子是基因表达调控的关键顺式作用元件，也是基因工程表达载体的一个重要元件。

对启动子结构和功能的阐释，有助于基因表达的时空控制。

选择恰当方法克隆序列未知的启动子有着非常重要的意义和广阔的应用前景。

随着ＰＣＲ技术的问世，基于ＰＣＲ扩增的染色体步移技术进行启动子克隆具有较好的可操作性，其在基因的分子生物学和基因工程研究方面也是一项重要的技术策略。

本文讨论了近年来以ＰＣＲ为基础的染色体步移技术克隆启动子的方法，主要包括反向ＰＣＲ、接头介导ＰＣＲ、半随机引物ＰＣＲ三大类，归纳比较了其克隆原理和研究进展，为克隆已知序列旁侧未知启动子序列提供参考。

关键词染色体步移，启动子，反向ＰＣＲ，接头介导ＰＣＲ，半随机引物ＰＣＲＰｒｏｇｒｅｓｓｏｆＣｈｒｏｍｏｓｏｍｅＷａｌｋｉｎｇｔｈｅＵｎｋｎｏｗｎＰｒｏｍｏｔｅｒＳｅｑｕｅｎｃｅｓＦｌａｎｋｅｄｂｙａＫｎｏｗｎＳｅｇｍｅｎｔＫＡＮＧＤａｎ１ＦＡＮＧＸｉａｏ－Ｙａｎ１ＹＯＵＴｅｎｇ－Ｆｅｉ１ＷＡＮＧＴｉｎｇ－Ｔｉｎｇ１ＳＵＩＡｎ－Ｐｉｎｇ２＊ＹＡＮＧＸｉｎｇ－Ｙｏｎｇ１，３＊１ＴｈｅＳｃｈｏｏｌｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４００７１５，Ｃｈｉｎａ；２ＴｈｅＬｉｂａｒａｒｙｏｆＳｏｕｔｈｗｅｓｔＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４００７１５，Ｃｈｉｎａ；３ＴｈｅＣｏｌｌｅｇｅｏｆＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅ，ＣｈｏｎｇｑｉｎｇＮｏｒｍａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｏｎｇｑｉｎｇ４０１３３１，Ｃｈｉｎａ＊Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ，ｔｏｂｐｏｌ３＠ｇｍａｉｌ．ｃｏｍ；ｙａｎｇｘｙ９４＠ｓｗｕ．ｅｄｕ．ｃｎAbstract Ｐｒｏｍｏｔｅｒｉｓａｋｅｙcis －ａｃｔｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔｔｏｒｅｇｕｌａｔｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｗｈｉｃｈｉｓａｌｓｏａｎｉｍｐｏｒｔａｎｔｅｌｅｍｅｎｔｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｉｎｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｕｎｄｅｒｓｔａｎｄｉｎｇｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｐｒｏｍｏｔｅｒｓｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｖｅｃｔｏｒａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｌｉｎｇｔｈｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｆｕｒｔｈｅｒｗｅｃａｎａｃｈｉｅｖｅｔｈｅｇｏａｌｔｈａｔｉｎｄｕｃｅｓｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｅｌｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇａｐｒｏｐｅｒｍｅｔｈｏｄｔｏｃｌｏｎｅｔｈｅｐｒｏｍｏｔｅｒｐｒｅｓｅｎｔｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅａｎｄｗｉｄｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｐｒｏｓｐｅｃｔｓ．Ｓｉｎｃｅｔｈｅｉｎｖｅｎｔｉｏｎｏｆｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎｒｅａｃｔｉｏｎ（ＰＣＲ）ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，ｓｅｖｅｒａｌＰＣＲ－ｂａｓｅｄｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｗａｌｋｉｎｇｍｅｔｈｏｄｓｈａｖｅｂｅｅｎｄｅｖｅｌｏｐｅｄｔｏａｍｐｌｉｆｙｕｎｋｎｏｗｎｐｒｏｍｏｔｅｒｓｅｑｕｅｎｃｅｓｆｌａｎｋｅｄｂｙａｋｎｏｗｎｓｅｇｍｅｎｔ．Ｉｎｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗ，ｗｅｉｎｔｒｏｄｕｃｅｔｈｅＰＣＲ－ｂａｓｅｄｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｉｅｓｆｏｒｔｈｅｒａｐｉｄａｃｑｕｉｓｉｔｉｏｎｏｆｕｎｋｎｏｗｎｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲ，Ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄＰＣＲ，Ｓｅｍｉ－ｒａｎｄｏｍｐｒｉｍｅｒＰＣＲ．Ｔｈｅｓｅｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄｒｅｓｅａｒｃｈｐｒｏｇｒｅｓｓｅｓｏｆｅａｃｈａｐｐｒｏａｃｈａｒｅｄｉｓｃｕｓｓｅｄ．Keywords Ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｗａｌｋｉｎｇ，Ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ＩｎｖｅｒｓｅＰＣＲ，Ｌｉｇａｔｉｏｎ－ｍｅｄｉａｔｅｄＰＣＲ，Ｓｅｍｉ－ｒａｎｄｏｍｐｒｉｍｅｒＰＣＲ启动子是位于结构基因５＇端上游的一段ＤＮＡ序列，能够指导ＲＮＡ聚合酶与模板正确结合，启动基因转录。

分子生物学名词解释最全（3）分子生物学名词解释最全att sites(att位点)：在噬菌体和细菌染色体噬菌体插入或切除细菌染色体的位点。

attenuation (衰减)：控制一些细菌启动子表达中涉及的转录终止调控。

attenuator (衰减子)：衰减发生处的一种内部终止子序列。

autogenous control (自体调控)：基因产物减弱(负自体调控)或者激活(正自体调控)其编码基因表达的作用。

autonomous controlling element(自主控制元件)：玉米中一种具有转座能力的转座元件。

autoradiography(放射性子显影)：通过放射性标记分子在胶卷上留下图像检测分子的方法。

autosomes (常染色体)：除性染色体外的所有染色体。

二倍体细胞拥有两套常染色体。

bb lymphocytes or b cell (b淋巴细胞或b细胞)：合成抗体的细胞。

backcross (回交)：杂交检测的另一种(早期的)说法。

back mutation(回复突变)：逆转产生基因失活效果突变的突变，从而使细胞恢复野生型。

bacteriophage (细菌噬菌体)：侵染细菌的病毒，通常简称为噬菌体。

balbiani ring (b环)：多线染色体条带中一个很大的泡状环。

normal chromosomes(常染色体)：相对较大，一定区域内在特定化学处理下保持着色。

base pair (碱基对)：是dna双链中一对a和t或g和c。

在rna 中特定条件下也能形成其它的配对。

bidirectinal replication(双向复制)：当两个复制叉在同一起始点以不同的方向移动时形成。

bivalent(二价染色体)：在减数分-裂初期一种包括四条染色单体的结构(两个染色单体代表同源染色体)。

blastoderm(囊胚层)：昆虫胚胎发育的一个阶段，其中胚胎周围的一层细胞核或细胞围绕着中央的卵黄。

热不对称交错PCR(TAIl-PCR)热不对称性PCR (thermal asymmetric interlaced PCR, TAIL-PCR)就是建立在PCR技术基础上的染色体步移技术，为扩增已知序列旁侧的未知DNA 片段提供了捷径。

该技术由Liu和Whitter于1995年首先研究并报道[22]。

以基因组DNA为模板，使用高退火温度的长特异引物和短的低退火温度的简并引物，通过特殊的热不对称(高严谨性PCR和低严谨性PCR 交替)循环程序，有效扩增特异产物。

该技术具有简单快速、特异性高、分离出的DNA 序列可以用于图位克隆、遗传图谱绘制和直接测序等优点，近年来，被分子生物学研究者广泛应用，成为分子生物学研究中非常实用的基因侧翼序列克隆技术[23，24]，同时在植物基因克隆方面也取得了很大进展[25]。

TAIL-PCR技术的基本原理是利用目标序列旁的已知序列设计3个嵌套的特异性引物(special prime ,简称sp1 ,sp2 ,sp3 ,约20 bp) ,用它们分别和1个具有低Tm值的短的(14 bp) 随机简并引物(Arbitrary degenerate prime 简称AD)相组合,以基因组DNA作为模板,根据引物的长短和特异性的差异设计不对称的温度循环,通过分级反应来扩增特异引物。

TAIL-PCR包括3轮PCR反应。

第1轮PCR反应包括5次高严谨性反应、1次低严谨性反应、10次较低严谨性反应和12次热不对称的超级循环。

首先5次高严谨性的反应，使长的高退火温度的特异引物SPl与已知的序列退火并延伸，目标序列扩增成直线性型上升，由AD引物结合产生的非特异性产物的浓度则较低。

而后进行1次低退火温度的反应，目的是使简并引物结合到较多的目标序列上，接下来10次较低严谨性的反应可以使两种引物均能与模板退火，从而使原来由高严谨性循环所产生的单链靶DNA复制成双链DNA，为下一轮线性扩增模板做准备。