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母体血浆中DNA的半导体测序技术SSP可作为胎儿亚染色体异常的无创检测
摘要
对母体血浆中胎儿游离DNA的无创产前检查—测序，能在产前精确的检测出非整倍体，并在临床上日益被接受。
我们的研究目的是在无创产前检查中使用半导体测序技术，是否能够可靠的检测出高危患儿中存在的亚染色体的缺失或成倍复制的现象。
首先，我们在异常DNA浓度增加的样本中，加深DNA测序的深度。
其次，我们分析了1456个孕妇的血清，采用了一种基于DNA碎片分布的大小去评估胎儿游离DNA的浓度的方法。
最后，我们收集了1476个孕妇中的血浆，这些孕妇的胎儿经超声检测发现存在结构的异常，同时对他们也进行了有创检查，我们对母体的血浆DNA中使用半导体测序技术去检测亚染色体的异常，并且使用阵列比较基因组杂交aCGH来验证我们的结果。
在3.5百万的阅读量时，SSP的检测率为56 of 78 (71.8%)与用aCGH来检测亚染色体异常相比，当增加序列深度达到10百万的阅读量并限制畸形的尺寸›1Mb时，敏感性变为69 of 73(94.5%).其中有55个假阳性样本，35个是由于母体血浆中DNA存在缺失或成倍复制的现象，提示了验证试验的必要性—去排除母体核型的异常。
这个研究显示胎儿亚染色体异常的检测SSP是无创产前诊断的一个可行扩展，我们相信这种方法在基因的诊断上具有广阔的应用，例如分析环状肿瘤DNA去进行肿瘤的检测方面。
“基于母血浆深度测序的胎儿亚显微染色体异常无创伤性检测”点评胡平【期刊名称】《中国产前诊断杂志（电子版）》【年(卷),期】2013(005)002【总页数】2页(P54-55)【作者】胡平【作者单位】南京医科大学附属南京妇幼保健院,江苏南京 210004【正文语种】中文1 原文摘要The purpose of this study was to determine the deep sequencing and analytic conditions needed to detect fetal subchromosome abnormalities across the genome from a maternal blood sample.Cellfree（cf）DNA was isolated from the plasma of 11 pregnant women carrying fetuses with subchromosomal duplications and deletions，translocations，mosaicism，and trisomy 20 diagnosed by metaphase karyotype.Massively parallel sequencing（MPS）was performed with 25-mer tags at approximately 109 tags per sample and mapped to reference human genome assemblyhg19.Tags were counted and normalized to fixed genome bin sizes of 1Mbor 100 kb to detect statistically distinct copy-number changes compared to the reference.All seven cases of microdeletions，duplications，translocations，and the trisomy 20 were detected blindly by MPS，including a microdeletion as small as 300 kb.In two of these cases in which the metaphase karyotype showed additional material of unknown origin，MPS identified both the translocation breakpoint and the chromosomal origin of the additional material.In the four mosaic cases，the subchromosomal abnormality was not demonstrated by MPS.This work shows that in nonmosaic cases，it is possible to obtain a fetalmolecular karyotype by MPS ofmaternal plasma cfDNA that is equivalent to a chromosome microarray and in some cases is better than a metaphase karyotype.This approach combines the advantage of enhanced fetal genomic resolution with the improved safety of a noninvasive maternal blood test.2 论文核心内容及点评该文章于2013年2月发表于《The American Journal of Human Genetics》杂志。
孕妇血浆游离DNA高通量测序用于胎儿性染色体非整倍体检测的初步探讨林颖;蒋馥蔓;秦岭;马定远;刘立夫;陈芳;张红云;王威;季修庆【摘要】目的初步探讨孕妇血浆游离DNA高通量测序用于产前胎儿性染色体非整倍体检测的效果及临床可行性.方法 2011年至2012年收集早、中孕期单胎孕妇5540例,在知情同意的原则下采集外周血血浆进行游离DNA的高通量测序检测,通过生物信息学分析,获得测序结果；对测序检出的性染色体非整倍体患者行羊水穿刺,进行染色体G显带分析.结果 5540例样本中测序方法共检出10例性染色体非整倍体,其中6例与G带核型分析结果一致,包括3例45,X,1例47,XXY,2例47,XYY,其余4例G带核型正常.结论孕母血浆游离DNA高通量测序可对性染色体非整倍体胎儿进行无创性产前检测,但存在假阳性,还需进一步完善实验方案以提高检测效果.【期刊名称】《临床检验杂志》【年(卷),期】2013(031)006【总页数】3页(P406-408)【关键词】高通量测序;无创性产前诊断;胎儿游离DNA;性染色体非整倍体【作者】林颖;蒋馥蔓;秦岭;马定远;刘立夫;陈芳;张红云;王威;季修庆【作者单位】南京医科大学附属南京妇幼保健院产前诊断研究室,南京210004;深圳华大基因研究院,广东深圳518083;南京医科大学附属南京妇幼保健院产前诊断研究室,南京210004;南京医科大学附属南京妇幼保健院产前诊断研究室,南京210004;深圳华大基因研究院,广东深圳518083;深圳华大基因研究院,广东深圳518083;深圳华大基因研究院,广东深圳518083;深圳华大基因研究院,广东深圳518083;南京医科大学附属南京妇幼保健院产前诊断研究室,南京210004【正文语种】中文【中图分类】R714.5人类性染色体非整倍体主要包括45,X、47,XXY、47,XXX和47,XYY，男性发病率约为1/500，女性发病率约为1/850[1]。
母体血浆靶向性平行测序应用于无创性单基因遗传病的产前诊
断
杜司晨
【期刊名称】《中国产前诊断杂志（电子版）》
【年(卷),期】2012(004)004
【总页数】1页(P52)
【作者】杜司晨
【作者单位】
【正文语种】中文
本文发表在2012年的《Clinical Chemistry》上。
目前，通过对母体血浆DNA 的深度测序可以确定胎儿的遗传基因组和突变基因组，这项技术在许多单基因遗传疾病的无创性产前诊断（NIPD）中有重要应用。
在此
过程中，相关单倍体剂量（RHDO）分析是十分关键的一步，即通过父母的SNP
深度测序数据推断出母体外周血中胎儿的单倍型。
临床上筛选致病基因位点时，RHDO 的靶向应用可能会减少数据分析的成本及复杂性。
因此，证明靶向RHDO 分析在NIPD 中的可行性是十分必要的。
作者运用大规模平行测序技术，对2个经产前诊断为β-地中海贫血家系的β-珠蛋白基因进行测序，之后通过液相杂交实现靶向富集。
同时，运用数字PCR 从理论
上推断亲代的单倍型。
最后，运用RHDO 分析技术，对富集的序列以及推断的亲
代单倍型分析，以此判断胎儿是否患有β-地中海贫血。
结果显示，一对具有相似单倍型结构的亲代家系，其所有的胎儿都是β-地中海贫血基因的携带者。
因此，对靶向富集的基因数据的RHOD 分析是成功的。
综上所述，母亲血浆DNA 靶向测序应用于单基因遗传疾病的无创性产前诊断是成立的。
非整倍体染色体异常的筛查方法非整倍体染色体异常是指个体染色体数目的异常，通常由于发生了染色体缺失、增加或重排等突变导致。
这种异常在人类中较为常见，可以引起多种遗传病和发育异常。
因此，对非整倍体染色体异常的筛查非常重要，可提供早期诊断和干预的机会，有助于改善患者的生活质量。
一、无创产前筛查无创产前筛查是一种非侵入性的筛查方法，通过检测孕妇的血液样本来评估胎儿是否存在非整倍体染色体异常。
这种方法无需取胎儿组织或羊水样本，相对安全且无痛苦，广泛应用于产前筛查中。
无创产前筛查主要通过检测胎儿游离DNA中的染色体异常标志物来进行，如胎儿染色体三体综合征（Down综合征）常见的三体综合征标志物为孕妇血浆中游离DNA中的胎儿染色体21号染色体的片段。
二、羊水穿刺羊水穿刺是一种有创的筛查方法，通过将细针插入孕妇腹部、子宫和羊水囊，取得羊水样本进行检测。
该方法可以提供准确的染色体分析结果，能够明确诊断是否存在非整倍体染色体异常。
然而，由于该方法有一定的风险，如感染、流产等，一般只在无创产前筛查结果阳性或高风险的情况下才会选择进行。
三、绒毛活检绒毛活检是一种有创的筛查方法，通过取得胎儿绒毛组织样本进行检测。
该方法可以提供准确的染色体分析结果，并且可以早期进行，通常在怀孕8-12周进行。
绒毛活检的风险相对较低，但仍存在一定的流产风险，因此一般只在无创产前筛查结果阳性或高风险的情况下才会选择进行。
四、胎盘活检胎盘活检是一种有创的筛查方法，通过取得胎盘组织样本进行检测。
该方法可以提供准确的染色体分析结果，并且可以早期进行，通常在怀孕10-12周进行。
胎盘活检的风险较低，但仍存在一定的流产风险，因此一般只在无创产前筛查结果阳性或高风险的情况下才会选择进行。
五、胎儿超声检查胎儿超声检查是一种无创的筛查方法，通过超声波检查胎儿的形态和结构来评估是否存在非整倍体染色体异常。
该方法可以观察胎儿的脊柱、四肢、头部等部位，判断是否存在明显的异常。
《中国产前诊断杂志（电子版）》 ２０２１年第１３卷第４期·综述· 高通量测序和数字ＰＣＲ应用于无创产前检测胎儿非整倍体研究进展陈桂芳１ 杨佳怡２ 高运华２ 王志栋２ 吴枭２（１．沈阳化工大学，辽宁沈阳 １１０１４２；２．中国计量科学研究院，北京 １０００２９）【摘要】 母体血浆中胎儿游离ＤＮＡ的发现使无创产前检测成为可能。
基于高通量测序的无创产前检测已用于临床筛查常见的胎儿染色体非整倍体疾病。
测序流程复杂，质量控制有助于提高高通量测序无创产前检测的准确性和可靠性。
数字ＰＣＲ作为核酸定量检测的新技术，具有快速准确，流程简单的优势，有望成为无创产前检测胎儿染色体非整倍体更具成本优势的新方法。
本文讨论了高通量测序与数字ＰＣＲ技术在无创产前胎儿非整倍体检测中的应用状况，分析了检测过程中可能的影响因素与质控参考物质研制，为理解针对胎儿非整倍体的无创产前检测研究提供了参考。
【关键词】 高通量测序；数字ＰＣＲ；质量控制；无创产前检测；胎儿染色体非整倍体【中图分类号】 Ｒ７１４．５５ 【文献标识码】 Ａ犇犗犐：１０．１３４７０／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｐｄ．２０２１．０４．０１４基金项目：国家自然科学基金（３１９００４３３）；国家质量基础的共性技术研究与应用（２０１７ＹＦＦ０２０４６０４） 通信作者：杨佳怡，Ｅ ｍａｉｌ：ｙａｎｇｊｙ２０１８＠ｎｉｍ．ａｃ．ｃｎ 胎儿染色体非整倍体是产前筛查检测的主要内容，进行早期产前筛查和诊断有利于优生优育。
非整倍体产前检测是采用无创、微创或有创的技术方法，在一定时间窗口期对孕妇进行检查，以评估胎儿罹患染色体非整倍体疾病的风险或进一步确诊［１］。
传统产前诊断方法具有侵入性，通过羊膜穿刺、绒毛取样以及脐静脉穿刺取样进行染色体核型分析，有潜在的胎儿流产或感染风险［２］，早孕期、中孕期常规产前筛查通过超声检查联合血清学标记分析，同时结合孕妇年龄、孕周、体重以及是否存在糖尿病等多项临床信息，以软件计算风险值进行评估，但敏感度和特异性有限［３，４］。
·综述·《中国产前诊断杂志（电子版）》 ２０１６年第８卷第２期孕妇血浆游离核酸高通量测序检测胎儿遗传异常殷旭阳１ 陈芳１，２ 王威３（１．深圳华大基因研究院，广东深圳５１８０８３；２．哥本哈根大学，丹麦哥本哈根２２００；３：深圳华大临床检验中心，广东深圳５１８０８３）【摘要】 孕妇血浆中胎儿源性的游离ＤＮＡ的发现，为无创产前检测（ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅｐｒｅｎａｔａｌｔｅｓｔｉｎｇ，ＮＩＰＴ）奠定了科学基础。
通过对孕妇外周血中的游离ＤＮＡ进行检测，能够以无创的方式分析胎儿的遗传特征，为产前筛查（ｐｒｅｎａｔａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）和产前诊断（ｐｒｅｎａｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ）提供了有效的手段。
新一代高通量测序技术（ｎｅｘｔｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ，ＮＧＳ）的发展及其在临床的广泛应用，使其在孕妇血浆胎儿游离ＤＮＡ检测中的应用成为必然趋势，并推动无创产前检测技术的迅猛发展。
通过孕妇血浆游离ＤＮＡ的高通量测序，可实现胎儿的染色体非整倍体、单基因遗传疾病、微缺失微重复的检测，也可以对胎儿基因组、ＤＮＡ甲基化组以及转录组等信息进行分析。
【关键词】 孕妇血浆；胎儿游离ＤＮＡ；无创产前检测；产前筛查；产前诊断；高通量测序【中图分类号】 Ｒ７１４．５３ 【文献标识码】 Ａ犇犗犐：１０．１３４７０／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｐｄ．２０１６．０２．０１２基金项目：出生缺陷筛查工程实验室项目［ＪＺＦＮｏ．（２０１１）８６１］ 通讯作者：王威，Ｅ ｍａｉｌ：ｗａｎｇｗ＠ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｃｎ 孕妇血浆中胎儿源性游离ＤＮＡ的发现，为无创产前检测（ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅｐｒｅｎａｔａｌｔｅｓｔｉｎｇ，ＮＩＰＴ）奠定了科学基础。
通过对孕妇外周血中的游离ＤＮＡ进行检测，能够以无创的方式分析胎儿的遗传特征，为产前筛查（ｐｒｅｎａｔａｌｓｃｒｅｅｎｉｎｇ）和产前诊断（ｐｒｅｎａ ｔａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓ）提供了有效的手段。
无创产前DNA检测在性染色体非整倍体筛查中的效果评价目录一、内容综述 (2)1.1 研究背景 (3)1.2 研究意义 (5)二、无创产前DNA检测技术概述 (5)2.1 技术原理 (7)2.2 方法分类 (8)2.3 应用现状与发展趋势 (8)三、性染色体非整倍体筛查的重要性 (10)3.1 生殖健康与遗传优生 (11)3.2 出生缺陷预防 (12)3.3 社会经济影响 (13)四、无创产前DNA检测在性染色体非整倍体筛查中的应用 (13)4.1 适用人群与筛查时机 (14)4.2 检测流程与操作规范 (15)4.3 阳性与阴性结果解读 (16)五、临床效果评价指标体系构建 (17)5.1 评价指标选取原则 (18)5.2 经验性评价指标体系建立 (19)5.3 客观性评价指标体系建立 (20)六、无创产前DNA检测在性染色体非整倍体筛查中的效果评价 (21)6.1 真实性分析 (23)6.2 效率评估 (24)6.3 特异度与灵敏度分析 (25)6.4 临床应用价值探讨 (26)七、案例分析与讨论 (28)7.1 典型病例介绍 (29)7.2 检测结果与分析 (30)7.3 存在问题与挑战 (31)7.4 改进策略建议 (32)八、结论与展望 (33)8.1 研究总结 (34)8.2 未来发展方向 (35)8.3 推广与应用前景 (37)一、内容综述随着科技的飞速发展，无创产前DNA检测技术（NIPT）已成为产前筛查领域的重要工具。
NIPT通过采集孕妇的外周血样本来分析胎儿的游离DNA，进而预测胎儿是否可能患有染色体非整倍体疾病，如唐氏综合征等。
NIPT在性染色体非整倍体筛查中的应用逐渐受到广泛关注。
性染色体非整倍体是指染色体数目异常，包括XYY综合征、XXY综合征和XXX综合征等。
这些疾病的发生与遗传因素、环境因素以及两者相互作用有关，且往往导致胎儿生长发育异常和智力障碍等严重后果。
对性染色体非整倍体进行早期筛查和诊断具有重要的临床意义。
大规模平行测序无创基因检测用于胎儿染色体非整倍体异常产前诊断的临床价值王海;周蕾;王克义;怀磊【期刊名称】《浙江医学》【年(卷),期】2018(040)001【摘要】目的探讨大规模平行测序无创基因检测在胎儿染色体非整倍体异常产前诊断中的临床应用价值.方法选择预约做产前诊断的高危孕妇914例,按危险因素分为唐氏综合征筛查高危组563例,高龄妊娠组245例和其他原因组106例.抽取孕妇外周血,提取血浆DNA,制备测序文库,用高通量测序仪器检测,结果与人类的参考基因组比对;同时采集胎儿羊水,经细胞培养后行羊水细胞染色体核型分析.结果914例孕妇经大规模平行测序技术检出21-三体综合征高风险8例,18-三体综合征高风险3例,13-三体综合征高风险1例;与染色体核型分析相比,产前无创基因检测21-三体综合征、18-三体综合征、13-三体综合征的阳性预测值均为100％,而假阳性率均为0.914例样本中,检出45,X高风险3例、47,XXX和47,XXY高风险各2例;与染色体核型分析相比,产前无创基因检测45,X的假阳性率为0.11％,阳性预测值为66.7％,47,XXY和47,XXX的假阳性率均为0.22％,阳性预测值均为50％.结论大规模平行测序技术对胎儿常染色体非整倍体疾病的诊断,具有极高的阳性预测值,但对胎儿性染色体非整倍体异常的阳性预测值较低;只能作为一种高级筛查性检测而不是确诊方法.%Objective To assess the clinical value of massively parallel sequencing in diagnosis of fetal chromosomal aneuploidy.Methods Nine hundred and fourteen high-risk pregnant women registered in prenatal diagnostic centers of Hangzhou First People's Hospital wereenrolled in the study.The plasma DNA was extracted and sequenced with high-throughput sequencing procedure.The results were compared with the human reference gene-database and statisticallyanalyzed.Simultaneously,the cells isolated from the fetal amniotic fluid were cultured,and chromosomal karyotyping was performed to identify the chromosome aneuploidy.Results Among 914 pregnant women,8 cases of trisomy 21,3 cases of trisomy 18,1 case of trisomy 13 were detected by massively parallel sequencing,which were in full accord with the results of chromosomal karyotype analysis.In addition 3 cases of 45,X,2 cases of 47,XXX and 2 cases of 47,XXY were detected by massively parallel sequencing technology;with chromosomal karyotype analysis as gold standard the positive predictive value of non-invasive prenatal testing was 66.7％ for 45,X,50％ for 47,XXX and 47,XXY,while the false positive rate was 0.11％ for 45X,0.22％ for 47,XXX and 47,XXY.Conclusion Massively parallel sequencing technology is of high positive predictive value for detecting trisomy 21,18,13 and of low positive predictive value for detecting sex chromosome aneuploidies in prenatal diagnosis of the fetus chromosome aneuploidy,indicating that it may be used as an advanced screening test not as diagnostic method.【总页数】4页(P12-15)【作者】王海;周蕾;王克义;怀磊【作者单位】310012杭州,浙江省立同德医院检验科;杭州市儿童医院检验科;杭州市第一人民医院中心实验室;杭州市第一人民医院中心实验室【正文语种】中文【相关文献】1.胎儿无创染色体非整倍体基因检测应用于产前诊断的临床研究 [J], 罗俭权;赵立忠;吕镜雄;李树平;陈春梅2.无创产前基因测序在胎儿染色体非整倍体基因检测中的临床应用 [J], 翁慧男;梁嘉颖;曾伟宏;汤惠霞;孙怡;马将军3.无创胎儿染色体非整倍体基因检测在产前诊断中的临床应用价值分析 [J], 柴惠霞4.大规模并行基因组测序技术应用于无创产前诊断染色体非整倍体的研究 [J], 李玉芝;王威;任景慧;林琳华;姚秋璇;袁红;郭辉;李启运;何薇;张红云5.大规模平行基因组测序技术应用于胎儿常见染色体非整倍体异常无创产前诊断中的价值 [J], 薛海鲸; 李宝; 郑芸芸; 刘阳; 赵秋剑; 张建芳因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
无创DNA产前检测技术无创DNA产前检测，又称为无创产前DNA检测、无创胎儿染色体非整倍体检测等。
根据国际权威学术组织美国妇产科医师学院委员会，无创产前DNA检测（Non-invasive Prenatal Testing）是应用最广泛的技术名称。
无创DNA产前检测技术仅需采取孕妇静脉血，利用新一代DNA测序技术对母体外周血浆中的游离DNA 片段（包含胎儿游离DNA）进行测序，并将测序结果进行生物信息分析，可以从中得到胎儿的遗传信息，从而检测胎儿是否患三大染色体疾病。
一、理论依据母体血浆中含有胎儿游离DNA，为该项目提供现实依据。
胎儿染色体异常会带来母体中DNA含量微量变化，通过深度测序及生物信息可分析检测到该变化，为项目提供理论依据。
新一代高通量测序、信息分析平台为深度挖掘母体血浆中胎儿游离DNA信息提供技术依据。
二、研究进展作为一种对胎儿染色体非整倍体筛查手段，无创产前DNA测试，使用来自于孕妇血浆的无细胞胎儿DNA进行检测。
这些DNA 学术上也被称为循环游离胎儿DNA，浓度约3-13%，被认为主要来自胎盘，并在分娩后数小时内从母体血液中清除。
无创产前DNA 分析已在临床上用于胎儿非整倍体风险检测。
1969年首次报道发现母体外周血中存在胎儿细胞，经过几十年研究发现其含量极低且存在时间较长，这些特点使其在产前诊断领域的应用受到较大的限制。
1997年香港中文大学卢煜明 (Dennis Lo) 教授发现母体外周血浆中存在游离胎儿DNA ，随孕周增加稳定存在，且随孕妇分娩快速消失，可以作为非创伤性产前诊断的理想材料。
母体外周血浆中胎儿游离DNA含量大概占全部游离DNA的3-13%，也有不同研究认为其含量稍高。
由于大量来源于母体背景的游离DNA影响，需要选择超级灵敏的新一代分子生物学技术才可以在大数据量水平上对胎儿游离DNA的碱基序列做出准确判断。
早期的研究中，无创产前DNA分析对三体胎儿检测需要多个胎盘DNA或RNA标记，这使得试验非常耗时和昂贵[2]。
母血浆中游离胎儿 DNA 检测在染色体非整倍体筛查中的应用王传霞;顾茂胜【期刊名称】《航空航天医学杂志》【年(卷),期】2014(000)002【摘要】目的：母血浆中游离胎儿DNA检测在染色体非整倍体的无创产前诊断中的实用价值及临床意义。
方法选择孕中期血清学筛查高风险、高龄妊娠等因素，孕龄在15～26周之间，且拒绝行侵入性产前诊断的孕妇。
进行母血浆中游离胎儿DNA的高通量测序，阳性结果孕妇，通过羊膜腔穿刺、羊水细胞培养、染色体核型分析确定染色体非整倍体情况。
结果1269例孕妇血浆样本经高通量基因测序检测到22个结果异常，羊水染色体核型分析10例21-三体、3例18-三体、性染色体异常6例，3例性染色体误诊。
无创胎儿21-三体、18-三体综合征检出正确率达100％，但胎儿性染色体检测准确率较低，约为66.7％。
结论高通量基因组测序技术具有无创性，且与传统羊水染色体核型分析相比，诊断胎儿21-三体、18-三体综合征的特异性有较高的一致性。
【总页数】2页(P210-211)【作者】王传霞;顾茂胜【作者单位】江苏徐州市妇幼保健院遗传医学中心，徐州221009;江苏徐州市妇幼保健院遗传医学中心，徐州221009【正文语种】中文【中图分类】R446【相关文献】1.母血浆中游离胎儿DNA检测在染色体非整倍体筛查中的应用 [J], 王传霞;顾茂胜;2.孕妇血浆游离胎儿DNA检测在唐氏综合征筛查中的应用价值 [J], 孟金来;王谢桐;陈子江3.孕妇血浆游离胎儿DNA检测在产前筛查中的临床应用 [J], 丁娟;彭艳;丁桂凤4.外周血游离胎儿DNA检测联合唐氏筛查在妊娠中期唐氏综合征胎儿筛查中的应用价值 [J], 吕书博5.无创DNA检测在胎儿染色体非整倍体筛查中的应用与治疗指导价值 [J], 陈文高;钟杰;申时龙;陆劲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
·专家论坛·《中国产前诊断杂志（电子版）》 ２０２３年第１５卷第４期基于二代测序的染色体非整倍体无创产前筛查孕妇血浆中胎儿ＤＮＡ比例的检测和计算方法李粉霞１ 欧阳国军２ 常清贤１（１．南方医科大学南方医院妇产科，广东广州５１０５１５；２．广州市达瑞生物技术股份有限公司，广东广州５１０６６５）【摘要】 孕妇血浆中胎儿游离ＤＮＡ的发现已对胎儿染色体非整倍体异常的无创产前检测产生了巨大的变革，母体血浆中的游离ＤＮＡ越来越被认为是非侵入性检测胎儿发育异常的重要指标。
二代测序技术的发展也使染色体非整倍体无创产前筛查（ｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅｐｒｅｎａｔａｌｔｅｓｔ，ＮＩＰＴ）在临床实践中得到了迅速的开展和推广应用。
在ＮＩＰＴ筛查中，血浆中胎儿游离ＤＮＡ比例是整体检测性能的关键参数，在一定程度上确保对检测结果作出正确的临床解释。
本综述中，我们对目前ＮＩＰＴ中胎儿游离ＤＮＡ比例的检测方法和生物信息学算法进行介绍，并简单讨论各个方法的优缺点。
【关键词】 无创产前筛查，血浆游离ＤＮＡ，胎儿游离ＤＮＡ比例【中图分类号】 Ｒ７１５．５ 【文献标识码】 Ａ犇犗犐：１０．１３４７０／ｊ．ｃｎｋｉ．ｃｊｐｄ．２０２３．０４．００３ 人类的ＤＮＡ主要存在于细胞中，此外还有少量以游离状态存在于循环血中。
１９４８年Ｍａｎｄｅｌ和Ｍéｔａｉｓ发现人体外周循环血中游离ＤＮＡ（ｃｅｌｌｆｒｅｅＤＮＡ，ｃｆＤＮＡ）的存在［１］。
１９７７年，Ｌｅｏｎ等［２］发现机体血循环中存在肿瘤细胞凋亡后释放出的ｃｆＤ ＮＡ，其浓度与肿瘤发展速度相关。
１９９７年，Ｌｏ等［３］在孕有男性胎儿的孕妇外周血血浆中检测到Ｙ染色体性别决定区（ｓｅｘ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｒｅｇｉｏｎｏｆｔｈｅＹｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ，ＳＲＹ）序列，提出了胎儿游离ＤＮＡ（ｃｅｌｌｆｒｅｅｆｅｔａｌＤＮＡ，ｃｆｆＤＮＡ）的概念，证实孕妇外周血中存在ｃｆｆＤＮＡ。
![一种用于检测胎儿染色体非整倍性的无创性产前检测系统[发明专利]](https://img.taocdn.com/s1/m/0b299901856a561252d36ff3.png)
专利名称：一种用于检测胎儿染色体非整倍性的无创性产前检测系统
专利类型：发明专利
发明人：马旭,路建波
申请号：CN201811629579.2
申请日：20181228
公开号：CN109628567A
公开日：
20190416
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种适用于大规模平行测序的DNA片段范围，其特征在于所述DNA片段范围为80‑155bp。
本发明还提供一种用于检测胎儿13、18、21号染色体非整倍性的无创性产前检测系统，该无创性产前检测系统通过对来源于孕妇的外周血中游离DNA进行检测。
本发明的DNA片段范围和无创性产前检测系统用于检测胎儿13、18、21号染色体非整倍性，尤其是13号和18号染色体的非整倍性具有良好的效果。
申请人：国家卫生计生委科学技术研究所
地址：100081 北京市海淀区大慧寺路12号
国籍：CN
代理机构：北京市中伦律师事务所
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通过母系血浆的高通量平行DNA基因组测序来进行胎儿染色体非整倍性的无创产前诊断前言染色体非整倍性是很多配偶选择做产前检查的主要原因。
现在决定性诊断的方法主要靠破坏性的过程，比如绒毛膜取样和羊膜穿刺术，然而这些方法都有流产的风险。
虽然胎儿的DNA可以在母亲的血浆中找到，但是作为其中非常微小的部分，总是伴随着大量母系DNA 背景。
因此胎儿基因组内的非整倍性染色体数量上的不同对于母亲血浆中全部的染色体序列表达就非常的微小。
即使用非常精确的单分子计数方法比如数码PCR，为了达到必要的分析精度仍必须分析大量的DNA分子，即需要大量的母系血浆。
这样我们就证明了使用独立位点的方法比定位于某一基因位点的方法将极大的提高从相同一定容量的血浆中可供分析的非整倍性染色体目标分子的数量。
因此我们为了达到产前胎儿二十一三体综合症的无创检测，应使用高通量平行基因组测序来量化母系DNA序列。
我们检测了28个怀孕六个月内母亲的血浆样本并正确辨别出了其中14个二十一三体综合征胎儿和14个整倍性胎儿，高通量平行血浆DNA测序展示了一个为所有孕妇进行无创产前胎儿染色体非整倍性诊断的新途径。
正文检测胎儿非整倍性是许多孕期妇女做产前诊断的主要原因。
传统的产前检测方法包括绒毛膜取样和羊膜穿刺术，这些具有破坏性的取样方法有可能导致流产，因此许多人都在研究无创取样方法，其中超声波扫描和母亲血清的生物化学标记被证明是有效的筛选方法，然而他们发现的是负现象而不是染色体异常的病理学特征。
这些方法也存在很大的局限性，比如妊娠期适用性和同时需要联合多个标记，甚至需要通过不同的时间节点来达到一个临床上有用的灵敏度和特异性。
为了从母亲血样中直接检测胎儿的染色体和基因组异常，早期的工作聚焦于如何将稀少的胎儿有核细胞从母亲血浆中分离出来。
1997年发现的母亲血浆中无细胞胎儿核酸开创了新的可能，然而胎儿DNA 仅仅占母亲血浆DNA的很小部分。
绝大多数都是孕妇自己的DNA，这点造成了巨大的挑战。
最近，生物学家发明了大量的方法。
一个策略以母亲血浆中胎儿特异性的核酸作为目标，比如说胎盘的mRNA 和DNA分子创造了一个胎盘特异性DNA甲基化信号。
胎儿的染色体剂量然后用目标分子中SNPs的等位基因比率分析来评估，这种策略叫做RNA-SNP等位基因比率法和表观遗传等位基因比率法。
这种基于等位基因比率的方法只能用在被分析的SNPs位点上是杂合的胎儿中，所以为了提高这种方法的覆盖率需要多样的标记。
为了创造一种从母系血浆中检测胎儿染色体非整倍性的单独多态性的方法，我们团队最近提出了使用数码PCR来进行相关染色体剂量（RCD）测量的原则。
数码RCD是用来数母系血浆中可能的非整倍性染色体的一个特殊位点的总数量，比如说二十一三体综合症中的二十号染色体，并且将其与参考染色体比较。
因此我们检测到由三条二十一号染色体带来的基因位点与对照基因的微小增加时，我们就可以诊断出二十一三体综合症，二十一号染色体序列成比例的增加预期就很小，因为胎儿DNA在母亲血浆DNA中仅占很小一部分。
为了可信的检测出这个微小的增加，需要高精度地分析和计数大量确定数量的二十一号染色体和由数码PCR试验定位的位点的对照染色体序列。
因此当部分富集的循环胎儿DNA非常低，比如说在早期怀孕时，就需要大量的母亲血浆。
另一种方法是进行多个遗传位点的多样化分析，然而多路复用的数码PCR法的优化十分具有挑战性。
如果使用荧光标记，我们就能很快地分辨出不同位点的各种标记。
为了克服以上的限制，我们打算用一种独立于任何特定基因位点的方法来计量母系血浆中二十一号染色体序列的数量。
当使用独立位点的方法时，非整倍性染色体的每一个DNA片段都会对这条染色体的数量的计量产生影响。
因此对任何固定容量的母系血浆中可计量的序列都比特定位点基因试验中作为模版的DNA分子多，所以过量或较低的非整倍性染色体的表达更容易被精确地检测出。
我们之前提议高通量平行基因测序（MPGS）平台会是无创产前胎儿染色体非整倍性诊断DNA序列的一种方法。
在这份研究中我们证明＂Solexa＂测序技术（Illumina）可以实现这个目标。
结果过程框架。
母系血浆中的无创胎儿染色体非整倍性检测使用MPGS的过程框架按图示表达在图一中，在这份研究中我们使用了Solexa的合成测序方法。
因为母系血浆中地DNA分子在自然条件下就已经变成碎片了，所以我们无需再将其碎片化。
每个血浆DNA碎片的一个同源衍生拷贝的末端都进行了测序且用Illumina GenomeAnalyzer标准前测序生物信息学分析方法进行处理，后者使用了高效、大范围核苷酸数据库软件分析（ELAND）。
这个测试的目的在于简单辨别测序血浆DNA碎片的染色体来源，但我们并不需要知道他们基因特异性位点的相关细节。
每一个人类染色体上任何特定染色体的序列数量之后会被计数和制表。
在这份研究中我们只数了没有错误配对并且只能和对照人类基因组作一个位点映射的序列，比如说那些在人类基因组中视为特殊的那些序列。
我们根据ELAND序列测试软件（Illumina）的输出数据把这些序列称作U0-1-0-0。
然后我们用某一染色体的U0-1-0-0数除以所有样本中的U0-1-0-0总数，通过该比例得出的值叫做%chrN。
为了确定我们测试的母系血浆样本属于二十一三体综合症，我们需要计算一个叫做Z-score的值，这个Z-score是根据参照组数据平均值的标准偏差得出的。
因此对于二十一三体综合症胎儿来说，我们就会看到其Z-score 要高于整倍体胎儿。
为了使无创产前胎儿非整倍性体染色体检测的过程高效，必须符合几个假设。
首先，MPGS需要足够灵敏来捕捉和产生在母系DNA 的背景下所有胎儿DNA的小片段的序列读数。
其次，捕捉来做测序的血浆DNA碎片必须是在母系血浆中有类似染色体间的分布的具有代表性的样本。
再次，对每条染色体上DNA测序的能力不应有巨大偏见。
当这些假设成立时，%chrN就能反映出母系血浆中母亲和胎儿的基因表达。
更甚的是，如果在母系血浆中，母亲和胎儿的基因是平等表达的，每条染色体上成比例的血浆DNA序列的贡献会产生人类基因组里每条染色体相对大小的关联。
如果%chrN值可以通过测序和点一个够大的血浆DNA库来使其变得足够精确，我们假设可以辨别出大量映射到非整倍体染色体序列表达上的不同。
我们准备分别测试这些假设。
在母系血浆中检测胎儿DNA。
如果MPGS可以可以给母系血浆中胎儿DNA测序，那么我们就应该可以检测出血浆中有y染色体的DNA，如果孕妇怀的是男性胚胎，从四个怀着整倍体胎儿的孕妇获得的血浆样本（三男一女）用Illumina的beta hIP-Seq-protocol进行处理，这个功能包括副本文件中所描述的化学凝胶电泳尺寸分流法步骤之前或之后的适配器绑定的DNA片段的放大。
这四个样本的临床信息和测序的数据详见S1表格。
从每个样本获得的总的序列数约为9*10^6。
每例中总的U0-1-0-0计数范围为1.8*10^6〜2.0*10^6。
映射到每个染色体的U0-1-0-0计数的比例见图S1。
对于这三个怀男性胎儿的孕妇，比如3009、3034和3143完全的和部分的映射到y染色体的计数分别为636（0.032%）、858（0.048%）和1054（0.056%）。
然而没想到177（0.009%）的序列同样映射到了y染色体，包括一个女性胎儿。
对sry基因的实时PCR对着之后的血浆样本产生了否定的结果。
我们然后考虑凝胶电泳时可能有男性序列污染的出现。
血浆DNA的测序方案。
我们创造了一个新的方案来为MPGS准备血浆DNA样本，不需要凝胶电泳和二次放大步骤，这个新的和原来的方案作了对比，并且分别表示为方案A和方案B。
为了将低DNA通量在测序结果中造成的偏差降到最低，三个血浆样本每个都抽取了100ng的DNA。
每个血浆样本的一半（50ng）都用两个方案作了处理，并且进行了同样的测序。
被测试的血浆样本包括一个怀着女性胚胎的孕妇，一个怀着男性胚胎的孕妇,和一个两个男性个体的血浆混合体。
最后一个样本需要做混合那样才能获取100ng的DNA。
这三个样本分别叫作样本1、2、3。
每个样本和每个方案的临床细节和测序结果显示在表格S2中。
总体的U0-1-0-0结果分布在2.0*10^6〜2.2*10^6。
全部和部分的使用新方案的样本1、2、3的映射到y染色体的U0-1-0-0结果是184（0.009%）,1444（0.066%）和3523（0.175%）。
相应的，原来的方案的数值为218（0.011%），1615（0.077%）和3468（0.169%）。
因此污染主要是由凝胶净化产生，而二次放大步骤得不到证实。
我们接下来探索了是否存在一个生物信息学的解释，我们使用Basic Local Alignment Search T ool（BLAST），来分析这三个样本的每一个样本和每一种方案的映射到y染色体的每一个U0-1-0-0序列。
我们用BLAST评估了只能匹配到y染色体的DNA序列的所占比例。
通过BLAST得出的特异性匹配到y染色体的序列的比例，分别用新的和旧的方案进行了对比（表格S3）。
怀着女性胎儿的孕妇的血浆样本，只有30%的通过ELAND映射到y染色体的序列被BLAST确证只映射到y染色体。
这和样本2、3形成了鲜明的对比,他们有超过90%被ELAND映射到y染色体的序列可以被BLAST确证。
尽管如此，怀有男性胎儿孕妇的血浆样本中检测出的y染色体序列可以证明母系血浆中的胎儿DNA可以用MPGS进行测序。
为了确认ELAND 软件得出的U0-1-0-0序列有着比较小的映射错误，我们进行了一个涵盖三个血浆DNA样本的在每一个染色体上的利用新方案进行的基于120个随机选择的U0-1-0-0序列的BLAST分析，正如表格S4所示。
在选取的测试的序列中大于99%的利用ELAND来映射到常染色体的U0-1-0-0序列被BLAST确认只匹配到相应的染色体。
样本一中所有的120个ELAND映射的x染色体序列都被BLAST确认了，它仅包含女性DNA。
样本二和三中超过97%ELAND映射的x染色体序列被B LAST所确认，它们包含男性DNA。
这些数据表明ELAND 所映射的U0-1-0-0序列除去y染色体外还是基本上非常准确的。
母系血浆DNA序列在人类染色体中的分布。
样本一、二、三分别计算了每一个染色体的U0-1-0-0数量占所有序列的U0-1-0-0的比例的贡献。
为了调查是否母系血浆DNA序列在人类基因组重平均分布，我们比较了血浆DNA数据和每条染色体的期望的基因贡献。
我们主要的目的是分析占支配地位的DNA背景为女性的母系血浆DNA。
因此我们计算了一下基因的相对表达，比如说每条染色体的大小，基于一位女性参考者的单倍体人类基因组的每条染色体的核苷酸构成，每条染色体的相对大小和测序的血浆DNA样本的U0-1-0-0序列的染色体贡献的比例被绘在一起。
