神经元细胞培养步骤

神经胶质细胞培养方法
神经细胞（神经元）不易培养，只有在适宜情况下，如接种在胶原底
层上，或加入神经生长因子和胶质细胞因子时，可出现一定程度的分化，长出突起等现象，但很难使之增殖。

而神经胶质细胞是神经组织
中比较容易培养的成分。

人、鼠等脑组织即可用于神经胶质细胞培养，不仅能获得生长的胶质
细胞，也可形成能传代的二倍体细胞系。

一般来说，胶质细胞在培养
中生长不稳定，不易自发转化，但对外界因素仍保持很好的敏感性，
可用劳氏肉瘤病毒（Rous sarcoma virus,ROUS)和SV4等能其诱发转化。

培养方法如下：
1、从手术室无菌取脑髓灰质或白质后，仔细剥除脑膜、血管和纤维成分，置Hanks液中漂洗一至二次。

2、置于30—50倍体积的Hanks液中，此时脑组织比较柔软，反复吹打
即制成细胞悬液。

3、把悬液注入离心管室温中直立5—10分钟后，细胞或细胞团快自然
下沉，脂肪等杂物易漂浮在上层液相中，可吸除上层液体，反复二至
三次，即可排除脂肪成分和其它碎块并获较多细胞。

4、在沉降物中加入适量培养液，通过纱网成纱布过滤，计数并调整细
胞密度。

5、接入培养瓶或皿中，置5%CO2温箱中培养。

该细胞适应环境过程较长，接种后贴壁较慢。

贴壁后短期内也可能不见细胞分裂现象，然而一旦生长后即能迅速进入旺盛的增殖状态。

细胞传代可以 0.25%胰酶消化处理。

海马神经元的培养总结1.新生大鼠海马常规取法：断头，线剪剪去皮肤，组织剪从椎管纵向剪开颅骨，再颅顶横向剪一刀。

暴露两侧大脑半球，用小弯镊翻出大脑，延纵裂分别向两侧翻开大脑半球，在底部可见新月形的海马，用眼科镊取出置于冰浴的盐溶液中，在解剖镜下剥离周围组织和血管膜。

2.培养基：我用的接种培养基是DMEM/F12+10的胎牛血清＋胰岛素＋葡萄糖＋谷胺酰胺，维持培养基里就是多加了5uM的阿糖胞苷。

培养液的pH调至6.8—7.4可，最好不要调至7.4或高。

一般在培养液放置两周后，加入终浓度为2mM的谷氨酰胺3.胰酶：酶用0.125的。

其实一次性消化比较简单，关键是消化时间不要太长，不知你用多长时间，一般是15-20分。

4.多聚赖氨酸的配置：可以用去离子水配, 也可以用D-HANKS也配(我用的配方),或者PBS 效果都差不多. 一般先配成1mg/ml的母液, 用高压过的滤器过滤,最好分装以后放在-20度, 用的时候再稀释至0.01mg/ml.5.铺板：我的办法是将盖玻片直接经泡酸后要反复的洗干净，用单蒸后用双蒸水。

后放在75％的酒精中浸泡半个小时以上，在超净台中取出后用酒精灯烧一下，注意不要太久，以防破碎，后放在24或6孔板中，加入稀释好的多聚赖氨酸，室温放置3小时以上或过夜，切记不要照紫外，可以在上面覆盖东西。

结束后回收多聚赖氨酸，并用灭菌水或PBS等清洗三遍以上即可使用，我用的效果非常好。

6. 1. 盖玻片洗净之后, 需要泡酸过夜处理, 这样玻片会比较干净, 养原代背景会干净的多. 就算是新的也要洗(曾经有过教训).2.包被多聚赖氨酸用之前要用高压的去离子水洗3遍,再用D-HANKS过一遍.3. 多聚赖氨酸包被时,如果有条件可以放在4度振摇过夜,效果更佳.4. 神经元细胞种植之前1小时把种植培养基加进去,会提高细胞活力.7.纯化细胞方法：1.差速贴壁：接种前可将制备的细胞悬液放入底面积为75cm2的培养瓶中（未包被），然后放入37度，5%CO2培养箱中半小时，然后再过滤，转移至培养皿/瓶中。

神经细胞原代培养从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。

一、培养前准备1. 器械和器皿器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。

由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。

器皿：1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖，2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。

3)培养瓶、盖玻片4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用0.2N盐酸浸泡10分钟，用蒸馏水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。

凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。

5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。

6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。

辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。

2. 培养基和培养用液的配制1) 培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。

本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为0.1mg/ml。

2) 平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。

各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。

3) 培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。

神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。

目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。

4) 血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。

分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。

5) 胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。

先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至2.5%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。

用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至0.25%或0.125%。

neurobasal 神经细胞培养步骤
神经细胞培养使用的神经基底培养基（Neurobasal）通常包括
以下步骤：
1. 准备培养器具：将所需的培养器皿（如细胞培养皿、培养瓶等）进行灭菌处理，确保无细菌或其他污染物。

2. 制备培养基：根据厂家提供的说明书，将神经基底培养基配制好。

通常需要将粉末溶解于培养基补充剂（如B27或N2）中，并加入适量的血清等。

3. 细胞分离：将神经组织（如海马、皮质等）分离并收集。

可以使用酶（如胰酶、纤溶酶等）或机械切割方法（如切割刀或离心式分离）。

4. 细胞孵化：将分离的细胞在预先灭菌的培养器皿中分散均匀，加入预先配制好的培养基。

5. 营养物质补充：在培养基中加入适量的营养物质，如氨基酸、维生素等，以促进细胞生长和分化。

6. 培养条件调节：将培养器皿放入恒温培养箱中，并保持适宜的温度（通常为37°C）和湿度，同时提供适量的CO2（通常
为5-10%）。

7. 细胞观察和维护：每天观察细胞的生长情况，检查细胞形态和健康状况。

适量更换培养基，以保持培养环境的稳定。

需要注意的是，具体的步骤可能会因实验设计的不同而有所差异，因此最好参考实验操作手册或厂家提供的指导。

此外，神经细胞培养也需要一定的专业知识和操作经验，对于初学者来说可能需要辅导或指导。

实验五：大鼠神经元细胞的原代培养2010级硕士研究生，周二组，严森，122010000178原代培养的细胞会不可避免地存留少量异质细胞一同生长．为了后续实验结果的针对性和准确性，一般都需要对培养物进行纯化。

纯化神经元的方法有很多种，最简便及常用的是采用有丝分裂抑制剂阿糖胞苷来抑制异质细胞的存活和生长。

神经元的分化增殖完成于胚胎期，大部分神经元在出生后即为永久的分裂后细胞，但其他细胞则仍然不断地进行分裂增殖，使用有丝分裂抑制剂后，非神经元的细胞生长会受到抑制及淘汰，神经元由此得到纯化实验材料：Hanks液，DMEM培养基10ml，有刻度吸管两只，弯头吸管两只，无刻度吸管一只，新生乳鼠（24小时）0.05%胰酶，1%双抗，10%胎牛血清，培养皿，小烧杯，空的离心管，镊子，剪刀，酒精灯，酒精棉，实验前准备工作：肥皂洗手，新吉尔灭擦手，开通风柜，将吸管从套筒中取出放入各自对应的试管内，将橡皮塞安装到各自吸管上，酒精灯分别迅速灼烧，1配液Hanks液近40ml加1%双抗1ml，加完双抗的小吸管留作计数，在DMEM培养基中加10%胎牛血清（已配好，全部加入），从离心管取一滴碳酸氢钠调节pH值至溶液呈紫色，一离心管0.05%胰酶，2.取材。

乳鼠新生24小时。

3，洗涤剪碎，在培养皿中加入少许Hanks液洗涤，将乳鼠头部用酒精棉擦拭消毒，在乳鼠头部位置剪一个工字型切口，将皮肤颅骨沿着切口依次剪开剥离，取出大脑组织，并去除乳鼠的血管脑膜，用弯头吸管将Hanks液与剥离干净的脑组织移走到另一个干净的培养皿中，用弯头吸管洗走洗液，弯头吸管将含有脑组织的Hanks移入到小烧杯中剪碎，每个组织块近似一立方毫米，静置后洗走上面的Hanks液，（吸取Hanks液时勿将下面的组织块洗走），同样方法再用Hanks液洗涤一次4．酶解，加一离心管0.05%胰酶，将上述小烧杯中的组织液移入空置的离心管中，37摄氏度水浴10分钟，观察组织块是否变小，静置2分钟，使组织沉淀下来，弃掉上请胰酶后，加DMEM培养基（全部倒入）来中和胰酶，吹散组织液5.离心1200转每分钟，离心5分钟，弃掉上清液，沉淀后加Hanks液吹散重悬组织液，用同样的转速和时间在离心一次，加完全培养基3-4mL吹散，静置1分钟，以便消化大块组织6.计数，取0.1ml离心后的细胞液加入苔盘蓝染色，加样抢加0.1微升与计数板计数，同时剩余细胞液加入培养瓶中进行培养接种，标注好组别和时间，培养细胞的名称37摄氏度，二氧化碳培养箱中，下周实验课观察细胞培养情况。

海马神经元细胞培养一、实验前准备1.手术器械、培养皿、筛网的消毒2.多聚赖氨酸的配制3.培养板处理：（培养板中可加入小的圆形玻片，多次使用）(1)用多聚赖氨酸室温包被5min，随后吸取多余液体，晾干。

(2)用PBS洗一遍，吸取PBS后晾干备用。

4.胰酶的配制5.PBS的配制二、操作步骤1. 新生一天的小鼠，酒精喷洒全身，置于干净的培养皿中，用手术剪刀剪下头部，放入另外一个干净的培养皿中（五只）。

2.用干净镊子取出全脑放于（冰）的PBS的培养皿（10cm）中，置于解剖显微镜下。

3.移入解剖显微镜下，分离出皮层或海马组织，去除血点，移入盛有HOOD下的培养皿中。

4.将皮层或海马组织剪成1-3mm的小块，用0.25%，2ml胰酶-EDTA 消化，37ºC水浴消化30分钟，每消化10分钟振摇一下。

30分钟后，用移液枪吸取可见组织，放入离心管中，并加入与胰酶等体积的DMEM （HG）+10% FBS培养液终止消化，吹打20次左右，注意动作轻柔，不要吹打出气泡。

5.如果组织明显不能吹散或粘稠的话，过一下200目筛网。

过滤液DMEM，进入大离心管中。

离心800r，3min。

弃去上清，加入DMEM 培养液，分装在培养皿（6cm）中，放入含5% CO2 的37C恒温培养箱内培养。

6.6-8小时（或第二天）后换液，用PBS液先洗两遍，并上下左右摇晃10次左右，去除一些细胞碎片，随后培养液换成Neurobasal 培养液+B27（2%）+谷氨酰胺（0.5mM）（+双抗)继续培养，并且3天半换液一次。

7.到第八天时，将培养液换成新鲜Neurobasal无B27、谷氨酰胺、双抗，开始用于实验。

神经元原代培养方法
从孕17-18天的雌鼠的胎儿分离神经元细胞。

孕雌鼠麻醉然后解剖，胎
儿收集到HBSS-1中然后快速断头。

剥离脑膜和白质后，大脑皮质收集
入 HBSS-2 液中机械磨碎。

皮质碎片移到有0.025%胰酶的HBSS-2液中3 7°C消化15分钟。

胰酶消化后，细胞用含有10%胎牛血清的HBSS-2液冲
洗两次，用神经基础培养液重悬细胞（培养液添加了0.5mM左旋-谷氨
酰胺，25μM左旋-谷氨酸，2%B27和0.12mg/mL庆大霉素）。

以1×105c
ell/cm2接种到事先用多聚赖氨酸包被的培养皿上，放到37°C，5%CO2
湿温培养箱里进行培养。

每3天用吸管换液，一次换0.5mL。

体外培养8
天细胞就能用于实验。

选用17-18天的胎鼠能够提高神经元培养的效率，因为与乳鼠相比胚胎
组织的细胞连接还很少。

因此，用乳鼠会使神经元的分离更加困难，
会造成细胞连接不可逆的损伤，细胞之间的共同的轴突和树突更容易
发生损伤。

另外，用出生后1天内的大鼠皮质培养容易有胶质细胞污染，而用胎鼠则可以避免这种情况。

如果用的是乳鼠，一般是在培养36个
小时后加入阿糖胞苷，抑制胶质细胞生长。

另外，如果把分化的影响看成是考虑的重要因素，可以用培养4天的、
8天的、18天的细胞。

其中一个例子可以是观察毒性物质对小孩和成年
的不同效应。

各类神经元细胞的培养方法神经元细胞是神经系统中的主要细胞类型之一，负责传递神经信息和调控神经功能。

神经元细胞的培养是神经科学研究和临床治疗的重要工具。

通过细胞培养，可以研究神经元的发育、功能和病理机制，同时也可以应用于药物筛选、组织工程和神经修复等领域。

下面将介绍一些常用的神经元细胞培养方法。

1.原代培养2.细胞系培养细胞系是已经建立起来的可持续增殖和培养的细胞株。

细胞系培养可以使用血清或无血清培养基。

通常，将细胞系继代传代，以保持其细胞特性和增殖能力。

细胞系培养可以持续扩大细胞数量，并用于大规模试验和应用，如药物筛选和基因表达研究等。

3.单细胞培养单细胞培养是将单个神经元细胞分离和培养。

首先，通过机械或酶消化方法将神经组织分散为单细胞悬浮液。

然后，通过单细胞分选技术，将单个神经元细胞分离并分配到各个培养孔中。

最后，单个细胞通过培养基提供的营养物和因子进行生长和分化。

单细胞培养是研究神经元个体特性、细胞发育和功能的重要手段。

4.同代培养同代培养是将同一类型的神经元细胞培养在同一培养物中，以形成功能连通的细胞群。

同代培养可以通过多孔膜培养皿、微流控芯片和三维支架等技术实现。

通过细胞之间的相互作用和联结，同代培养可以模拟神经系统的复杂性和功能，用于研究神经网络特性和神经系统发育。

5.共培养共培养是将不同类型的细胞培养在同一文化器皿中，以研究细胞之间的相互作用和信号传递。

常见的共培养方法包括胶质细胞和神经元细胞的共培养，以及神经元细胞和非神经元细胞的共培养。

共培养可以提供更接近体内情况的环境，用于研究细胞间相互作用和细胞发育过程。

成年鼠皮质神经元培养方法
神经元是大脑中最基本的神经细胞类型，对于神经科学研究具有重要意义。

成年鼠皮质神经元的培养和维持对于研究神经系统疾病、药物筛选和神经再生等方面具有重要意义。

下面将介绍一种常用的成年鼠皮质神经元培养方法。

材料和方法：
1. 成年鼠的大脑组织。

2. 无菌生理盐水。

3. 0.25% 胰蛋白酶。

4. 0.1% DNase I.
5. 神经元培养基。

6. 神经元培养补充剂。

7. 聚-L-赖氨酸涂层的培养皿。

8. 离心管。

9. 离心机。

10. 显微镜。

步骤：
1. 收集成年鼠的大脑组织，并迅速置于无菌生理盐水中。

2. 将大脑组织切成小块，加入0.25% 胰蛋白酶和0.1% DNase
I 消化酶液中，在37°C下消化30分钟。

3. 用离心机离心，去除上清液，将细胞沉淀加入神经元培养基中。

4. 将细胞悬浮液均匀地滴加到聚-L-赖氨酸涂层的培养皿中，培养皿预先用神经元培养基预涂。

5. 将培养皿置于37°C的细胞培养箱中，培养2-3周，每周更
换一次培养基。

6. 使用显微镜观察神经元的形态和生长情况。

通过以上方法，可以成功地培养成年鼠皮质神经元，为神经科学研究提供了重要的实验材料。

这种方法可以应用于研究神经系统疾病的机制、药物的筛选以及神经再生的机制研究等领域，对于推动神经科学的发展具有重要的意义。

培养的神经元细胞钙成像步骤《培养的神经元细胞钙成像步骤》神经元细胞的钙成像是一种重要的实验技术，可以帮助研究者观察神经元细胞内钙离子的动态变化，从而了解神经元的活动和功能。

在进行钙成像实验之前，需要先培养神经元细胞。

本文将介绍培养的神经元细胞钙成像步骤。

第一步：获得神经元细胞首先，需要获取神经元细胞。

通常，可以从小鼠或大鼠的胚胎脑组织中获得神经元细胞，也可以使用人类干细胞来培养神经元。

第二步：准备培养基和培养皿在培养细胞之前，需要准备合适的培养基和培养皿。

培养基应包含适当的营养物质和生长因子，以促进神经元细胞的生长和发育。

常用的培养基有DMEM/F12和Neurobasal培养基等。

培养皿应为无菌的培养皿，可以使用培养皿涂覆剂将培养皿表面涂覆成一层胶原蛋白或聚-L-赖氨酸，以增强神经元细胞的附着。

第三步：将神经元细胞接种于培养皿中将获得的神经元细胞加入到培养基中，并将混合物均匀地滴加到培养皿中。

然后，将培养皿放入培养箱中，提供适当的温度（通常为37摄氏度）和气氛（通常为5% CO2和95%空气），以为神经元细胞提供适宜的环境。

第四步：培养神经元细胞将培养皿中的神经元细胞培养在适当的条件下，通常需要一到两周的时间，神经元细胞才能发育成成熟的细胞。

在培养过程中，需要定期更换培养基，以保持营养物质的供应。

第五步：钙成像准备当神经元细胞生长发育良好后，可以进行钙成像实验的准备。

首先，将荧光染料加载到神经元细胞中，一般使用钙指示剂，如Fura-2、Fluo-4等。

将钙指示剂加入到培养基中，与神经元细胞共同培养一段时间，以使钙指示剂进入细胞内。

第六步：钙成像实验完成钙成像准备后，将培养皿放置在显微镜下。

使用荧光显微镜和相应的成像系统，观察并记录神经元细胞内钙离子的动态变化。

通过刺激神经元细胞，如应用药物、光刺激或电刺激，可以观察神经元细胞内钙离子浓度的变化，并记录成像数据。

通过以上步骤，可以成功地培养神经元细胞并进行钙成像实验。

收稿日期262基金项目国家自然科学基金资助项目(366)作者简介杨瑞瑞(82),女,硕士生,专业方向神经及血管电生理。

通讯作者司军强(652),男,教授,从事神经及血管电生理研究。

第25卷　第5期2007年10月石河子大学学报(自然科学版)Journal of Shihezi University (Natural S cience )V ol.25　N o.5Oct.2007文章编号:100727383(2007)0520596203胎鼠DR G 神经元细胞培养方法的建立杨瑞瑞1,石文艳1,骆海舰1,赵　磊1,成洪聚1,司军强1,2(1新疆地方与民族高发病教育部重点实验室,新疆石河子832002;2武汉大学基础医学院生理学系,湖北武汉430071)摘要:目的建立胎鼠背根神经节(dorsal root g anglion ,DRG)神经元原代培养的方法。

方法无菌条件下取E 16天的胎鼠DRG 进行原代培养,观察神经元生长状态并用神经元特异性烯醇化酶(neuronal specific enolase ,NSE )免疫细胞化学染色鉴定细胞。

结果培养的DRG 神经元可存活1个月左右,并长出突起,形成密集的网络。

NSE 鉴定细胞阳性表达率高,神经元达到90%左右纯度。

结论本文建立了DRG 神经元细胞简洁、经济、高效的培养方法并成功鉴定了神经元。

为对神经元的深入研究提供了实验模型。

关键词:神经元;细胞培养;背根神经节;特异性烯醇化酶;免疫细胞化学中图分类号:R338.1 文献标识码:A 细胞培养是从体内组织取出细胞在体外模拟体内环境下,使其生长繁殖,并维持其结构和功能的一种培养技术。

该技术已经成为当今生物医学研究的主要方法之一。

其主要优点在于,体外细胞培养的条件减少了在体神经组织的复杂性以及对细胞环境的操纵性,有利于预测和研究单个细胞在在体的功能[1]。

此外,有大量证据表明,体外培养的神经细胞也能表达许多在体细胞的同样特征,更重要的是培养的细胞的膜特性不变,受体的所有组成成分不变[2]。

1.成年大鼠海马神经元的培养●步骤1.获得海马细胞◆大鼠乙醚麻醉，断头处理；◆迅速解剖海马组织，置于含有2ml 4℃的HibernateA/B27的35mm的培养皿中；◆随后将其移入含有同上培养基的培养皿，去除脑膜及多余的脑白质（？）；◆将海马移入组织切碎机冷处理台面上事先用HibernateA/B27润湿的滤纸上，沿海马长轴将组织切成0.5mm的薄片，随后将其移入含有5ml4℃的HibernateA/B27的离心管中；◆30℃震荡8min。

◆大吸管将其移入含有木瓜蛋白酶（预热至30℃）的离心管，置于170rpm的旋转平台（保持组织片悬浮状态），30℃水域温育30min；◆将海马组织切片移入15ml含有2mlHibernateA/B27的离心管中，30℃温育5min，吸管吹打10次（30s），静置2min，将上清移入另一离心管，重复上述步骤2次；2.梯度分离◆将细胞悬液加入Nycoprep gradient（4ml）的上方，室温，1900rpm，离心15min；去除最上方的碎片；吸管收集含有细胞的部分；用5mlHibernateA稀释；第三层富含神经元；将第四层用2 ml B27:NeurobasalA重悬，1100rpm离心1min；3.盖玻片处理：50ug/mL多聚-D-赖氨酸（无菌水溶解）包被过夜，吸去多余的多聚赖氨酸，无菌水漂洗一次，自然干燥1h；4.◆细胞接种：以目标密度稀释于B27:NeurobasalA，以每盖玻片60到120 Ul 接种，置于5% CO2:9% O2中孵育1h；◆将盖玻片移入24孔培养板中,每孔以0.4ml 37℃B27/NeurobasalA漂洗一次，去除未贴壁细胞及细胞碎片；改用0.4ml的生长培养基；◆培养后4天，每3-4天更换一半培养基；新的培养基中的FGF2含量是远培养基的2倍；1.培养器皿的准备：1）溶液瓶——装配各种溶液——输液瓶；2）螺口瓶——血清或培养基；3）培养瓶——细胞培养——一般采用带螺口的，清洗时注意防止盖子中垫片的丢失；4）培养皿——细胞组织的分离、培养、染色——包括直径为30mm、60mm、120mm5）血球细胞计数板——细胞计数6）移液管——连接上手动（吸耳球）或电动负压吸取装置——在移液管尾部塞入少量脱脂棉；7）离心管——分离、漂洗、收集细胞——一般选用螺口带盖的；Eppendorf ——塑料尖底带盖的离心管8）磁力搅拌器：用于神经细胞的分离机溶液的配置；最好配合使用可调温度的加热装置；可用高压蒸汽消毒。

小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤1.确定实验目的：在进行任何实验之前，首先需要明确实验的目的和研究问题，以确定所需的实验材料和方法。

2.准备实验材料：准备所需的实验材料，包括培养基、细胞培养试剂和培养器具等。

3.小鼠胚胎的取材：通过异交法得到小鼠胚胎，通常在胚胎发育第15-17天时取材。

使用无菌饲料给小鼠提供丰富的营养，使其胚胎发育良好。

4.分离大脑皮层组织：将小鼠胚胎处死后，将其大脑取出并置于无菌的PBS缓冲液中。

然后用剪刀将大脑的外围组织移除，只保留皮层组织。

5. 组织的化学消化：将取出的大脑皮层组织放入含有无菌PBS缓冲液的培养皿中，用Pipettor将组织切碎成较小的块状，并加入含有0.05%胰蛋白酶和0.1%DNA酶的消化液，室温下消化15-20分钟。

6.组织的离心：将消化液中的细胞悬液经过离心处理，用PBS缓冲液洗涤1-2次，去除消化液中的酶和杂质。

7.细胞计数和分装：用显微镜和细胞计数板对细胞悬液进行计数，通过稀释和分装的方法，得到所需的细胞浓度。

8.细胞接种：将细胞悬液均匀地滴加到含有预先涂覆了聚-L-赖氨酸的培养皿中，使细胞均匀附着在培养皿的表面上。

9.培养基的添加：在细胞接种后，将预先配制好的培养基加入培养皿中，以提供细胞所需的营养和生长因子。

10.培养条件的控制：将培养皿放置于恒温培养箱中，温度为37°C，湿度为95%，CO2浓度控制在5%左右。

每隔一段时间，检查培养皿中细胞的生长情况，确保细胞的健康生长。

11.细胞形态观察：使用倒置显微镜观察细胞的形态变化，观察细胞的神经突起、细胞形态和相互作用等。

12.细胞维持和传代：根据实验需要，定期更换培养基以提供细胞所需的营养和生长因子。

当细胞达到80-90%的密度时，可以进行细胞传代，使细胞继续生长。

小鼠大脑皮层神经元原代培养是一项复杂的实验技术，在操作过程中需要注意无菌操作、细胞的取材和处理、培养条件的控制等方面的细节。

新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定新生大鼠大脑皮质神经元原代培养方法的建立及其活性鉴定11 21 1 培养器皿的预处理: 包被D -多聚赖氨酸: 将无菌处理的血盖片放入24孔聚乙烯培养板( Falcon) 或直径为35mm 的塑料培养皿( Falcon) 内, 在培养前24 小时用终浓度为50Lg/ ml 的多聚赖氨酸50Ll/ cm2 包被血盖片及培养皿各孔, 37e 5% CO2 孵箱孵育过夜。

临用前吸弃D- 多聚赖氨酸液, HBSS液清洗2 次即可使用。

1.大鼠大脑皮质神经元的分离及培养2大鼠大脑皮质神经元的形态学观察光学显微镜: 细胞接种后, 每天在倒置相差显微镜下观察神经细胞的生长情况, 拍照记录。

台盼蓝染色计数活细胞取0.1 mL 的体积分数为0.4% 台盼蓝加到0.9mL 细胞悬液中, 充分混匀后立即滴加到血球计数板上并分别计数未染色的细胞数(活细胞) 及染色的细胞数(死细胞)。

用台盼蓝染细胞时, 活细胞拒染, 死细胞可摄取染料。

计算公式: 每mL原液的细胞数= 4个大方格的细胞总数/4 X 104X稀释倍数。

3-1神经元的免疫细胞化学鉴定Dapi + NF3-2大脑皮质神经元纯度的鉴定( Nissl. s 染色)将细胞爬片的小玻片用0. 01 mo l/ L 的PBS 漂洗, 40 g/ L 多聚甲醛固定, 再用10 g/ L 甲苯胺蓝染色, 梯度酒精( 70%、80% 、95% 、100%) 分色, 置倒置相差显微镜下, 随机观察并计数30 个视野( 目镜10 @ , 物镜20 @ , 框面积0. 3 mm2) 内的神经细胞数。

连续观察10 d, 并拍照记录。

神经元比例( % ) = NF阳性细胞数/DAPI(+) 星形胶质细胞比例( % ) = GFAP阳性细胞数/DAPI(+)鉴定②NF 荧光免疫细胞化学染色 : 神经丝( neurofilaments, NF) 蛋白是构成神经轴突和树突的主要结构成分 , 在中枢和外周神经系统的神经元细胞核周、特别是轴突有表达, 也是神经元特异性标志物之一。

神经元细胞实验报告
仪器:CO2细胞培养箱,解剖镜,眼科镊,眼科剪
动物:新生鼠(SD大鼠)
耗材:DMEM/F12培养基、聚赖氨酸
实验步骤:
1包被:培养前一天将培养板或培养瓶或皿用0.01%多聚赖氨酸包被过夜。

第二天早上来吸除包被液在无菌超净台中自然晾干后放置于培养箱中备用。

2配制神经元专用培养基(DMEM/F12培养基中添加1%谷氨酰胺,2%
B27,1%双抗)
3取脑:选取新生24h之内的SD大鼠数只,雌雄不限,75%酒精全身消毒,断头处死,无菌条件下分层剪开头皮,颅骨,用弯镊拉开脑区视野,小心取出全脑,用预冷的PBS洗数次;
4分离:以脑中线为起点,小心拨开大脑颞叶皮层,暴露出新月状海马回,小心夹出海马组织,置于预冷的PBS中,仔细剔除微血管,用眼科剪充分剪碎组织。

5消化:加入同体积0.125%的胰蛋白酶,放入培养箱中消化30分钟,期间每隔5分钟轻摇一下。

6过滤:加入数滴胎牛血清终止消化,用吸管轻轻吹打细胞数分钟,至液体成米糊状即停止吹打,动作务必轻柔,用200目细胞筛过滤收集细胞悬液。

7接种:1000rpm离心5分钟,去除上清,用DMEM/F12完全培养基重悬细胞,轻轻吹打,调整细胞浓度为100000个每毫升,接种于包被好禁止晃动;
8换液:6小时后将DMEM/F12完全培养液全量换成神经元专用培养液,第48小时后加入一定浓度的阿糖胞苷,以抑制非神经元细胞过度生长,随后每3天半量换液。

一、实验目的本研究旨在通过体外培养神经细胞，探讨CA1重组蛋白在神经细胞生存以及学习记忆过程中的生物学功能，并深入了解其调控机制，为神经科学领域的研究提供实验基础。

二、实验材料1. 细胞：大鼠胚胎海马神经元2. 试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素、神经生长因子、抗凋亡因子、CA1重组蛋白、学习记忆相关基因的抗体、荧光标记抗体等3. 仪器：细胞培养箱、倒置显微镜、荧光显微镜、酶标仪、离心机、凝胶成像系统等三、实验方法1. 细胞培养：将大鼠胚胎海马神经元接种于细胞培养皿中，培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于细胞培养箱中培养。

2. CA1重组蛋白表达和纯化：通过基因工程方法表达CA1重组蛋白，并进行纯化。

3. 神经元培养和CA1处理：将培养至一定时期的神经元分为实验组和对照组，实验组加入一定浓度的CA1重组蛋白，对照组加入等体积的DMEM培养基。

4. CA1对神经元细胞凋亡的影响：通过流式细胞术检测CA1处理组与对照组神经元细胞凋亡率的差异。

5. CA1与学习记忆相关基因的表达关系研究：通过RT-qPCR检测CA1处理组与对照组神经元中学习记忆相关基因的表达水平。

6. 穿透式电子显微镜观察CA1对突触结构的影响：通过透射电子显微镜观察CA1处理组与对照组神经元突触结构的差异。

7. CA1对学习记忆行为的影响：通过Morris水迷宫实验检测CA1处理组与对照组小鼠的学习记忆能力。

8. 数据分析与统计：采用SPSS软件对实验数据进行统计分析，包括t检验、方差分析等。

四、实验结果1. CA1处理组神经元细胞凋亡率显著低于对照组（P<0.05），表明CA1重组蛋白具有抑制神经元细胞凋亡的作用。

2. CA1处理组神经元中学习记忆相关基因的表达水平显著高于对照组（P<0.05），表明CA1重组蛋白可能通过调控学习记忆相关基因的表达来影响神经元的学习记忆功能。

3. 透射电子显微镜观察结果显示，CA1处理组神经元突触结构较为完整，而对照组神经元突触结构出现一定程度的损伤。

原代海马神经元细胞培养-CAL-FENGHAI.-(YICAI)-Company One1原代海马神经元细胞培养溶液的配制：(1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤，室温保存。

(2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO412H2O，1.7g；KCl，0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。

用0.2m滤膜过滤，4℃保存。

(3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液冻存。

使用时，用解剖液稀释至0.25%。

(4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。

将上述多聚赖氨酸放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。

(5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP047H20，0.18g；KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。

(6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。

(7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。

(8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg ml-1的母液储存。

用0.2m 滤膜过滤，-20℃储存。

使用时，取6l母液加入2ml培养液中，终浓度为3g ml-1。

（根据实验情况调整浓度）大鼠原代海马神经元细胞的培养(1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解剖液的培养皿中。

(2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。

在分离出全部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。