实验五核酸琼脂糖凝胶电泳
一、实验目的
琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，具有操作方便、经济快速等优点。
本实验学
习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。
、实验原理
琼脂糖凝胶电泳是用于分离、鉴定和提纯DNA片段的标准方法。
琼脂糖是从琼脂中提取的
一种多糖，具亲水性，但不带电荷，是一种很好的电泳支持物。
DNA在碱性条件下（pH8.0 的缓冲液）带负电荷，在电场中通过凝胶介质向正极移动，不同DNA分子片段由于分子和
构型不同，在电场中的泳动速率也不同。
溴化乙锭（EB）可嵌入DNA分子碱基对间形成荧光络合物，经紫外线照射后，可分出不同的区带，达到分离、鉴定分子量，筛选重组子的目的。
但是EB具有致癌性，所以我们选用无毒，高灵敏度是Ex Green染料，。
此核酸染料在紫
外透照仪及可见光透射仪上均可使用。
ExGreen外观呈红色，与核酸结合后，可用300 nm （紫外透射仪）激发。
［琼脂糖凝胶浓度与线n：DN A分离范围参数
■ 凝胶浓度（%）线性DZAK度（bp）
■■0.5
0.7
1000^
800-
—30000
-12000
■ 1.0500宀-10000■ 1.2400^^7000■ 1.5200^-3000■ 2.050〜2000
三、材料、仪器和试剂
1、材料大肠杆菌中提取的质粒DNA
2 、仪器电泳仪；台式离心机；恒温水浴锅；微波炉；紫外透射仪；照相机或者凝
胶成像系统
3、试剂
(1)50 X TAE电泳缓冲液：称取Tris 242g , EDTA 37.2g ,加入约800ml的去离子水，
充分搅拌溶解，加入57.1ml的醋酸，充分搅拌，加去离子水定容至1L ,室温保存。
(2) 6 X电泳上样缓冲液：0.25%溴酚蓝、40% ( W/V )蔗糖水溶液，贮存于4 C。
(3)溴化乙锭(EB)溶液母液：将EB配制成10mg/mL 。
用铝箔或黑纸包裹容器，贮存于室温即可。
( 4)分子量标准DNA ：DNA Marker
四、操作步骤
1、制备1%琼脂糖凝胶(大胶用40ml，小胶用30ml):称取0.7 g(0.5 g) 琼脂糖置于锥形瓶中，加入70 ml(50ml) 1X TAE ，瓶口倒扣小烧杯。
微波炉加热煮沸3次至琼脂糖全部融化，摇匀，即成1.0% 琼脂糖凝胶液。
注意：用于电泳的缓冲液和用于制胶的缓冲液必须是相同的
2、胶板制备：取电泳槽内的有机玻璃内槽(制胶槽)洗干净，晾干，放入制胶玻璃板.取透明胶带将玻璃板与内槽两端边缘封好，形成模子。
将内槽置于水平位置，并在固定位置放好梳子。
在冷却到65 C左右的琼脂糖凝胶液中加入Ex Green染料(10ml:1ul ),混匀后小
心地倒入内槽玻璃板上，使胶液缓慢展开，直到整个玻璃板表面形成均匀胶层。
室温下静置直至凝胶完全凝固，垂直轻拔梳子，取下胶带，将凝胶及内槽放入电泳槽中，添加 1 x TAE 电泳缓冲液至没过胶板1-2伽为止。
注意：必须保证琼脂糖充分完全溶解，否则，会造成电泳图像模糊不清。
加热时如胶液剧烈沸腾发泡，停止加热。
微波炉中加热时间不宜过长。
倒胶时，不要产生气泡，溶液温度太高（＞60 C ），会使得水分过分蒸发，改变凝胶离子
浓度，影响电泳效果。
3、加样：在点样板或EP管中混合DNA样品和上样缓冲液，上样缓冲液的最终稀释倍数应不小于1X。
用10 ul微量移液器分别将样品加入胶板的样品小槽内，每加完一个样品，
应更换一个加样头，以防污染。
加样时勿碰坏样品孔周围的凝胶面。
（注意：加样前要先记
下加样的顺序）。
注意：加样时，要把枪头插入到加样孔里，但是不要插穿加样孔底部凝胶，保证样品尽
量在加样孔中而不外溢。
4、电泳：加样后的凝胶板立即通电进行电泳，电压60-100V ，样品由负极（黑色）向正极（红色）方向移动。
电压升高，琼脂糖凝胶的有效分离范围降低当溴酚蓝移动到距离胶板下
沿约1cm 处时，停止电泳。
5、电泳完毕后，取出凝胶
6、观察照相：在紫外灯下观察，DNA 存在则显示出红色荧光条带，采用凝胶成像系统拍照保存。
注意事项：
1、操作时带一次性手套，避免DNA 酶污染引起DNA 降解。
2、及时更换电泳缓冲液，电泳缓冲液在电泳槽中存放过，多次使用后，离子强度降低，PH 值上升，缓冲能力减弱，从而影响电泳效果。
3、一般情况，电泳电压＜20V/cm ,温度＜30 C；大分子量DNA链电泳，温度应＜15 C。
4、电泳前样品勿受热，以免引起DNA 变性。
5、凝胶中DNA 的上量要合适，太多会引起DNA 条带模糊，太少又会引起条带信号弱或无DNA 条带。
思考题
1 、琼脂糖凝胶电泳中DNA 分子迁移率受哪些因素的影响？
2、如果样品电泳后很久都没有跑出点样孔，你认为有哪几方面的原因？。
