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膜片钳技术参数一、膜片钳放大器系统（1）膜片钳放大器*1. 双电极膜片钳放大器用于细胞内和细胞外记录、膜片钳记录(全细胞、巨膜片、游离膜片)、电流测定法/伏安法、离子选择电极的测量、人工脂双层记录2. 电压钳模式下提供4种反馈电阻（50 MΩ、500 MΩ、5 GΩ、50 GΩ），可以测定0.2 pA～200 nA范围的电流。
电流钳模式下提供3种反馈电阻（50 MΩ、500 MΩ、5 GΩ），可以测定2 nA～200 nA 范围的电流。
3. 膜片钳放大器具有两个相同且独立的探头，为计算机控制，多数功能可通过点击鼠标而自动完成。
4. 全细胞膜电容补偿范围：Rf=500M时，Cm 1-100pF/Rs 400k-1000M串联电阻补偿范围：带宽：0.32-16kHz;校正值：0.4-1000M(500M时)5. 输出增益范围：主输出：1,2,5,10,20,50,100,200, 500, 1000, 2000；主输出滤波频率范围：4－极Bessel低通滤波(Hz)：2Hz-30kHz （2）数模转换器1转换器为即插即用型设备，能被Windows系统自动识别。
*2 为一台单独的仪器，不跟膜片钳放大器组合为一台仪器。
具有丰富数量的模拟/数字输入/输出端口，方便在软件中进行额外的附加控制。
3 16位高分辨率、低噪声转换器。
模拟信号输入通道数：8；模拟信号输出通道数：8；数字输出通道数：8。
4 采样速率：1 Hz - 500 kHz。
5 输入电阻: 1 MΩ；输入型号；TTL兼容制系统,方便外接其他刺激器，隔离器等。
输出电阻：< 0.5Ω6 输出电流：±4mA；数字化噪音< 1 mV7 系统自带消除噪音功能。
最大输入信号±10 V；消除最大噪音幅度20 V；噪音消除：线频率50Hz和谐波至10 kHz；取消相应时间< 1 s（3）记录和分析软件*1. 分析程序可对数据脱机处理，不需要使用密码锁2. 既包含采样程序又包含分析程序3. 膜测试功能在记录每条扫描线时可计算串联电阻Ra和膜电容4. 如果施加了漏减功能，则可同时自动记录下漏减前后的电流5. 在对每条扫描线进行记录时，可采用两个不同的采样频率进行6. 可以设置灵活的基础刺激和条件刺激方式用来不间断记录长时程增强效应和长时程抑制效应（LTP/LTD）。
膜片钳技术原理膜片钳技术是一种常见的实验技术，广泛应用于生物学、药理学、细胞生物学等领域。
它是利用一种特殊的仪器，通过对细胞膜的控制和操作，实现对细胞内外环境的调控和研究。
膜片钳技术的原理主要涉及到膜片形成、膜片钳的构造和工作原理等方面，下面将对这些内容进行详细介绍。
首先，膜片的形成是膜片钳技术的基础。
膜片是由玻璃或石英毛细管制成的，其内外涂有一层导电性金属。
在形成膜片的过程中，需要将毛细管和细胞膜接触，利用毛细管的吸附作用将细胞膜抽附到毛细管上，形成一个微小的膜片。
这一步骤的关键是要保持膜片的完整性和稳定性，以确保后续实验的准确性和可靠性。
其次，膜片钳的构造是实现膜片钳技术的重要工具。
膜片钳通常由微操作系统、压力控制系统、电压控制系统等组成。
微操作系统用于控制膜片的形成和定位，压力控制系统用于控制膜片与细胞膜的接触压力，电压控制系统用于记录和调节膜片与细胞膜之间的电压变化。
这些系统的协同工作，使得膜片钳能够对细胞膜进行高度精准的操作和控制。
最后，膜片钳技术的工作原理是通过对膜片与细胞膜之间的接触和电学特性的测量，实现对细胞内外环境的调控和研究。
在实验中，可以通过改变膜片与细胞膜的接触压力和电压，观察细胞膜的电学特性和通透性的变化，从而研究细胞的离子通道、受体通道等功能。
同时，也可以利用膜片钳技术对细胞内外环境的离子浓度、pH值等进行精准调控，以研究细胞的生理和病理过程。
总之，膜片钳技术是一种重要的细胞生物学实验技术，其原理涉及膜片的形成、膜片钳的构造和工作原理等方面。
通过对这些原理的深入理解和掌握，可以更好地应用膜片钳技术进行细胞内外环境的调控和研究，为生物学、药理学等领域的研究工作提供重要的技术支持。
膜片钳记录法（Patch Clamp Recording）是一种生理学实验技术，用于测量细胞膜离子通道或受体的电生理特性和活动。
该技术的基本原理是使用微型玻璃电极将一个非常小的玻璃管（称为膜片）贴附到单个细胞的表面上，从而形成一个微小的、高阻抗的突触点。
然后在膜片和细胞膜之间形成一个密封，并使用微电极或电极芯片记录跨越这个突触点的电位变化。
这种技术可以测量非常小的电流变化（尤其是亚毫安级别），因此非常适合研究离子通道和受体的活动。
通过控制细胞环境的情况，例如改变温度、pH值或添加化学物质，可以进一步调节离子通道和受体的电生理属性及其响应模式。
这种方法还可以用于研究各种细胞类型的电生理特性，包括神经元和心肌细胞等。
膜片钳记录法是一种十分精密的技术，在操作过程中需要非常小心谨慎，以避免损坏细胞或膜片。
同时，该技术需要一定的专业知识和设备支持，因此通常由有经验的生理学家和技术人员来执行。
总之，膜片钳记录法是一种重要的电生理技术，已经成为研究离子通道和受体的电生理学特性的关键工具之一，对于揭示神经、心血管等多种疾病的发病机制和治疗方法也具有重要意义。
膜片钳技术
1、膜片钳技术原理
膜片钳技术是用玻璃微电极吸管把只含1-3个离子通道、面积为几个平方微米的细胞膜通过负压吸引封接起来，由于电极尖端与细胞膜的高阻封接，在电极尖端笼罩下的那片膜事实上与膜的其他部分从电学上隔离，因此，此片膜内开放所产生的电流流进玻璃吸管，用一个极为敏感的电流监视器（膜片钳放大器）测量此电流强度，就代表单一离子通道电流。
膜片钳的基本原理则是利用负反馈电子线路，将微电极尖端所吸附的一个至几个平方微米的细胞膜的电位固定在一定水平上，对通过通道的微小离子电流作动态或静态观察，从而研究其功能。
膜片钳技术实现膜电流固定的关键步骤是在玻璃微电极尖端边缘与细胞膜之间形成高阻密封，其阻抗数值可达10～100 GΩ(此密封电阻是指微电极内与细胞外液之间的电阻)。
由于此阻值如此之高，故基本上可看成绝缘，其上之电流可看成零，形成高阻密封的力主要有氢健、范德华力、盐键等。
此密封不仅电学上近乎绝缘，在机械上也是较牢固的。
又由于玻璃微电极尖端管径很小，其下膜面积仅约1 μm2，在这么小的面积上离子通道数量很少，一般只有一个或几个通道，经这一个或几个通道流出的离子数量相对于整个细胞来讲很少，可以忽略，也就是说电极下的离子电流对整个细胞的静息电位的影响可以忽略，那么，只要保持电极内电位不变，则电极下的一小片细胞膜两侧的电位差就不变，从而实现电位固定。
膜片钳技术的原理图[51]
Rs是与膜片抗阻串联的局部串联电阻（或称入路阻抗），Rseal是封接阻抗。
RS通常为1~5MΩ，如果Rseal高达10GΩ以上是成为Ip/I=Rseal/(Rs+Rseal)-1。
此Ip可作为I~V转换器（点线）内的高阻抗负反馈电阻（Rf）的电压下降而被检测出。
实际上这是场效应管运算放大器（A1）的输出中包括着膜电阻成分，这部分将在通过第二级场效应管运算放大器（A2）时被减掉。
本实验采用的是全细胞记录模式。
全细胞记录构型(whole-cell recording)高阻封接形成后，继续以负压抽吸使电极管内细胞膜破裂，电极胞内液直接相通，而与浴槽液绝缘，这种形式称为“全细胞”记录。
它既可记录膜电位又可记录膜电流。
全细胞记录模式是向膜片电极施加正压同时使电极尖端接近细胞表面。
此时，将电位固定在0mV，连续给与强度为1mV，间期为10~20ms的去极化或超极化脉冲波，并对此时的电流变化进行监视。
当电极尖端接近细胞表面时，可以看到应答脉冲波的电流减小。
这是将电极内压从正压转变为弱的负压，从而使电流进一步减小，即在电极尖端和细胞膜之间形成了阻抗高的封接。
如将固定电位像负电压侧移动，则可以促进封接的形成。
当将固定电位调到细胞的静息膜电位近傍时，如果流动的电流大致上成为零时，脉冲波波幅增大，把电流测定增益提高就可测定封接电阻。
密闭封接形成之后，封接电阻可达10GΩ以上，这时观测到的电流是单一离子通道电流，他是判断电极阻塞或者已形成很好的密闭封接的良好指标。
与脉冲波向上或向下浮动时，可测定出一过性电流[52]。
2、全细胞记录的程序
（1）玻璃微电极的拉制
拉制微电极用的玻璃毛胚外径在1.5mm，内径在0.86mm，用PB-7电极拉制器分两步进行拉制而成。
第一步热力为13.5时可使玻璃软化，并拉开一个距离，形成一个细管，第二步用热力为9.4拉断电极细管部，成为两个基本相同的玻璃微电极，此步控制电极的尖部。
由于玻璃电极尖端易于粘附灰尘，因此要求现用现拉制。
（2）玻璃微电极的充灌
充灌前，电极内液必须用微孔滤膜（0.2um）进行过滤，目的是除去妨碍巨阻抗封接形成的灰尘。
用1ml注射器在玻璃微电极尾部充灌电极内液，
最后轻弹微电极杆部将其内的气泡排出。
电极内液不可充灌过多，能使Ag/AgCl电极丝达到能与电极内液相接触的长度即可。
过多的电极内液可能会溢出污染电极夹持器，从而增大记录噪声，也可能会增大导电半径（与Ag/AgCl电极丝相比），从而使电极电容增加，同样会增大记录噪声。
将充灌好电极内液的玻璃微电极连接在I-V转换器的电极支架上，确保电极支架的测量电极浸泡在电极内液中。
（3）灌流系统
将消化下来的细胞种在22mm的圆形玻片上，待细胞贴壁之后（约30min），用非熔性油脂（RS Components,Northlands，UK）将圆形玻片贴附在特制的灌流槽中，再将灌流槽安装在倒置显微镜下观察。
灌流槽的容积是0.5ml，各种灌流液安装在倒置显微镜旁边的铁架台上，与有精确刻度、可以调速的静脉输液器相连接，这部分作为灌流系统中的流入系统；流出系统是通过真空抽气泵完成的，通过真空抽气泵的抽吸，将灌流槽中的液体抽吸出来。
（4）高阻抗封接的形成
在实验准备工作就绪之后，就可以进行实验操作了。
首先将膜片钳放大器的记录调到SEARCH档，用2mV电压脉冲，在示波器上观察电极电流。
由于浴池内的浴液表面是相当的肮脏，故使电极内有液体从电极尖端流出，直至电极与细胞接触，为了避免此情况，可以用注射器对电极轻轻加以小正压，而且电极进入液面后，在没有形成封接之前，不要移出液面。
在微电极入水之前，示波器上的电流呈现一条直线微电极入水之后，与参考电极形成了一个回路，示波器上显示的电流将增至150-200pA。
此时电极与液体接触产生了所谓的“接触电位”，消除的方法是边按RESET档边调节Vp-OFFSET旋钮，使电极电压（Vp）补偿到零。
在倒置显微镜下，调节三维微操纵器引导电极靠近细胞，当电极接触到细胞时电流突然减少，此时应将关闭三维微操作器，改用注射器轻轻抽吸，对电极施加负压，此时电流噪声减少，表明封接电阻增大，在示波器上可以看到电流近似于一条直线，用20mV电压脉冲，使电极与细胞膜形成高阻封接（电阻可达10GΩ），此时便可以得到细胞贴附式膜片钳模式。
（5）全细胞实验数据记录
当高阻抗封接形成之后，可另加负压以吸破细胞的膜片。
在记录实验结果之前，要进行参数补偿，以期获得符合实际的结果。
在全细胞记录模式下，电极与细胞形成一个等效电路，细胞膜在其中相当于一个电容器（Cm）与一个电阻（Rm）并联。
在电极腔下膜片被打破的同时，20mV脉冲波上下浮动产生大的一次过电流，这是来自细胞膜的电容性电流。
对这个细胞膜的电容性电流分析，可以求出细胞膜电容Cm和膜阻抗Rm。
通过调节G-SERIES和C-SLOW旋钮可以补偿电容性电流，使其尽可能变少。
记录到的电流通过膜片钳放大器和1401数模转换器发送至示波器和计算机进行显示、记录和分析。
计算机内的各种刺激通过数模转换器转换成电压脉冲，由放大器送至电极，这样就可以检测电极电阻以及变化的电流。
指令电压由放大器Vp/Vcomm输出，再经1401转换器送至示波器和计算机。
1401转换器再将放大器中的电压和电流信号数字化时，它的取样频率是1KHz。
全细胞模式建立之后，细胞开始钳制在氯平衡电位（0mV）。
指令电压按照0，±40，±80mV的顺序进行去极化，每一个电位持续200ms，两电位之间间隔4s。
此实验按照这样的顺序持续记录。
3、容积激活性氯电流实验程序
（1）全细胞记录形成，测定电容之后，继续用等渗灌流液灌流3min；（2）灌流47%低渗液，低渗液可将氯电流激活；
（3）当低渗液激活的氯电流到达峰值并平稳之后，在换回高渗液将电流抑制下来；
（4）标准化的全细胞电流计算如下：
标准化电流（pA/pF）＝所测电流值（pA）÷细胞电容（pF）
4、氯通道阻断剂抑制氯电流实验程序
（1）全细胞记录形成，测定电容之后，继续用等渗液灌流3min；
（2）灌流47%低渗液，低渗液可将氯电流激活，待其达到峰值并平稳；（3）灌流含有氯离子阻断剂的47%低渗液，待其到最小值水平并平稳3min；
（4）换47%的高渗液灌流（约5min），观察电流是否还能被抑制；
（5）换47%低渗液，观察电流是否还能够恢复；
氯通道阻断剂抑制容积激活性氯电流的抑制率计算如下：
抑制率（%）≡[(C ctr l—C Iso)—(C blocker s—C Iso)]／(C ctrl—C Iso)×100%
C ctr l:47%低渗灌流时对照标准化电流；
C Iso：等渗液灌流时标准化电流；
C blocker s：加入氯离子阻断剂后标准化电流；。
