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海洋浮游病毒生态学研究方法概述【摘要】海洋浮游病毒是海洋生态系统中丰度最大的生物有机体，在海洋生态系统中发挥着中要的作用。
海洋浮游病毒的生态学研究一直是海洋生态学研究的热点。
其研究方法也在不断发展和完善。
本文分别对病毒丰度、生产力的测定方法、多样性的检测方法以及分离培养鉴定方法及其发展等方面进行了总结和阐述，并对各部分研究方法的优缺点进行了讨论分析。
【关键词】海洋浮游病毒；研究方法；丰度；生产力；多样性；分离培养海洋浮游病毒是海洋生态系统中丰度最大的生物实体[1]。
海洋浮游病毒在海洋生态系统中发挥着重要的作用，对宿主的侵染和裂解作用，介导着大约20% 的宿主死亡率，大大加快了物质循环的速度[1]，并且调节着宿主群落结构的组成。
与此同时，病毒也扮演着介导水平基因转移，促进宿主类群进化的重要角色[1]。
除此之外，海洋病毒宏基因组学的研究表明海洋浮游病毒类群有着巨大的多样性，并且包含着大量未知的基因[1，2]。
海洋浮游病毒重要的生态作用必然使海洋浮游病毒生态学的研究成为热点。
目前，海洋浮游病毒的生态学研究主要从丰度，多样性，病毒介导的宿主死亡率，病毒与宿主的相互作用等方面开展。
而目前在各方面生态学研究中使用的方法可总结如下。
1. 海洋浮游病毒丰度的检测方法目前用于水生生态环境中浮游病毒丰度的测定方法主要有以下3种：透射电子显微镜技术（TEM），表面荧光显微镜技术（EFM）和流式细胞分析检测技术（FCM）[3，4]。
1.1 透射电子显微镜技术（TEM）透射电子显微镜技术是早期海洋病毒学研究中病毒定量最常用的方法。
使用这项技术时，要求浓缩海水中的病毒，把浓缩液滴置于铜网上，负染后镜检观察。
这项技术在检测病毒丰度的同时还能获取病毒形态方面的信息[5]。
但该项技术的检测的下限高，涉及到海水浓缩，染色，观察等诸多可能产生误差的环节，并且步骤繁琐，对操作人员的技术，仪器的要求都较高[6]。
1.2 表面荧光显微镜技术（EFM）表面荧光显微镜技术是目前检测病毒丰度使用最为普遍的方法。
海洋浮游病毒最主要的组成部分海洋中有病毒吗？有，而且数量惊人。
近一个世纪以来，海洋生物学家一直认为海洋中是没有病毒的。
当他们在显微镜下观察海水时，他们根本没有发现任何病毒，因此他们得出结论，海洋环境太恶劣，病毒无法大量存活。
但是总是有较真儿的人。
1986年，一位名叫丽塔· 普罗科特的生物学家决定进行一次更仔细、更系统的观察。
她对加勒比海和马尾藻海等地的海水进行了调查，发现了数量惊人的病毒。
此后，其他研究人员也陆续证实，海洋确实是一种病毒汤。
病毒是海洋生态系统的重要组成部分1990年1月，海洋传播病毒生态学的先驱福尔曼和丽塔· 普罗科特合作发表在《自然》杂志上的论文，以及一组挪威科学家的另一篇论文，首次证实了病毒是海洋生态系统的重要组成部分。
但是到这个阶段，科学家们只是模糊地意识到海洋病毒圈的惊人规模，但许多关于它的最简单的问题多年来一直没有得到解答。
比如，科学家甚至不能说出海洋中有多少种病毒。
学术界逐渐认识到，海洋中大约存在着10000000000000000000000000000000(1×10³¹)个病毒颗粒我们该如何理解这一长串几乎数不过来的数字呢？勉强做一些类比。
在海洋中，病毒的数量是其他所有海洋居民总量的15倍，而它们的总重量则相当于7500万头蓝鲸，如果你把海洋中所有病毒挨个儿排成一排，会延长到4200万光年之外。
蓝鲸是世界上最大的哺乳动物海水中怎么会有这么多病毒呢？海洋病毒具有与陆地病毒相同的增殖方式，它们无法自我复制，而是利用被感染的细胞进行繁殖。
以一种主要的海洋浮游病毒——噬菌体为例，我们看看它是怎么繁殖的。
显微镜下的噬菌体噬菌体是一种病毒，由于病毒在自然界中不能生活以及繁衍，所以病毒需要找一个宿主生存。
地球上绝大多数病毒的宿主是生物，但是噬菌体是个例外，它们的宿主是细菌。
噬菌体其实是这类病毒的统称，在噬菌体家族中，存在着许多种类的噬菌体，而每一种噬菌体只能对应一种细菌，有时也能对应这种细菌的近亲。
海洋生物学中的海洋浮游生物调查技术海洋浮游生物调查技术是海洋生物学中的重要分支之一，它涉及海洋生态系统的各个方面，包括海洋的营养物质循环、能量流动以及生物多样性的维持等。
本文将从多个方面介绍海洋浮游生物调查技术的原理、方法和应用。
一、海洋浮游生物的分类海洋浮游生物是指在海水中漂浮的微小生物群体，通常包括浮游植物（如藻类）、浮游动物（如浮游动物门、桡足类、甲壳类等）以及微生物（如细菌、病毒等）。
它们生活在开放海洋、沿海水域和深海等各种环境中，是海洋生态系统中不可或缺的组成部分。
浮游生物通常被分为多个类群，如浮游植物、浮游动物和细菌等，具有多样的形态和特征。
根据它们的生长环境和特征，可以进一步将其分类为浮游植物门、浮游动物门、细菌门等。
二、浮游生物的调查方法1. 网采网采是最常用的浮游生物调查方法之一，其原理是利用各种网类捕捉海水中的浮游生物。
通常使用的是水平拖网或竖直拖网，不同网的特点在于网的大小、网孔大小和网的类型不同。
对于不同种类的浮游生物，通常选择不同的网来捕捉。
网采的主要优点在于操作简单，能够捕捉到多种类型的浮游生物。
但是，它也有缺点，如会捕捉到大量的非目标物种，以及可能导致捕捉到的生物受到破坏。
2. 漂流器漂流器是一种针对浮游生物调查的被动样品收集方法。
漂流器通常会随着海流、气流或风流进行漂流，因此它可以收集到具有广泛分布的、来自各个方向的浮游生物。
漂流器的主要优点在于样本不会被破坏，并且可以收集到散布在广阔水域中的生物群体。
但是漂流器只能在表层水域进行采集，不能获取深水区域的样本。
3. 过滤器过滤器是一种主动样品收集方法，其原理是将水样经过一个过滤器，在过滤器上收集被过滤物质中的生物。
通常使用的过滤器有滤膜、滤管和凝胶等。
过滤器的主要优点在于它能够采集到很小的生物体，而且可以过滤掉许多非浮游生物，但它在样品的收集量有局限。
过滤器可以采集到深层水样，但需要注意采样层数。
4. 浮标/浮球浮标/浮球是一种在海面上悬浮的浮游生物调查方法。
浮游生物群落的监测与分析近年来，随着环境污染的日益严重和海洋生态环境的恶化，对浮游生物群落的监测与分析变得越来越重要。
浮游生物群落是指在海洋中漂浮的细小生物，如浮游植物、浮游动物和浮游细菌等。
它们是海洋生态系统中重要的组成部分，对海洋生态环境的稳定和生物多样性维护起着重要作用。
因此，及时监测和分析浮游生物群落的变化，具有非常重要的意义。
一、浮游生物群落监测方法目前，常用的浮游生物群落监测方法包括采用水下显微镜、细胞计数、分子生物学、机器学习等技术。
水下显微镜可以直接观察到微小的浮游生物，如藻类、浮游动物等。
细胞计数则通过在海水中采集一定量的样本，通过显微镜观察和计数细胞数量来获得浮游生物数量和种类的信息。
分子生物学技术则可以通过分析浮游生物DNA序列和蛋白质结构，来了解它们所代表的种类和浓度等信息。
机器学习技术则可以根据浮游生物群落的特征，预测出未来的变化趋势。
二、浮游生物群落分析方法除了监测方法之外，对浮游生物群落的分析方法也十分重要。
分析方法主要包括多样性和功能分析。
多样性分析可以通过浮游生物样本的DNA或RNA序列分析来了解样本中存在哪些种类和数量。
功能分析则可以通过分析浮游生物的代谢物组合来评估它们对环境的响应和功能。
三、应用前景目前，浮游生物群落的监测和分析在海洋环境监测、生态环境保护、生态系统恢复等领域得到了广泛的应用。
例如，在海洋环境监测方面，通过对浮游生物群落的监测和分析，可以及时发现和预测污染事件对海洋生态环境的影响。
在生态系统恢复方面，可以通过引入一些浮游生物种类来改善海洋生态系统的生态环境，促进海洋生物的生长和繁殖，增加生物多样性。
此外，浮游生物群落监测和分析还可以用于科学研究和教育培训等领域，为生态保护和可持续发展提供更加精细化的数据和理论支持。
总之，浮游生物群落的监测和分析是维护海洋生态系统稳定和生物多样性的重要手段。
在未来，我们需要运用现代科技手段以及多学科、全方位的视角来深入研究、分析和应用浮游生物群落监测和分析技术，推动海洋生态保护和可持续发展。
海洋浮游病毒最主要的组成部分是什么
海洋浮游病毒是细菌和原核生物中最小的常见微生物，全部或部分部分由RNA组成的一类病毒。
它们在全球的海洋和淡水里广泛分布，种类繁多。
海洋浮游病毒通常由一个外壳和一个核酸病毒分子组成，主要由脂质和糖代谢产物组成，病毒核酸类型不同，可以是RNA，也可以是DNA。
海洋浮游病毒的结构是无核的，直径大约在20~400nm，形状是不规则的球，尺寸不一，平均分子质量大约在1000Da到2000Da之间，有足够的尺寸和结构，以便识别和控制海洋中其它有机体的活动。
研究表明，海洋浮游病毒主要由脂质、核酸和糖代谢物组成，其中包括脂质，如磷脂类、脂类和脂肪酸，核酸可以是DNA也可以是RNA，糖代谢物主要有烷脂、单糖、多糖和脂类，这些化合物结构都是非常简单的。
当脂质接触到核酸、糖代谢物等其它原料时，就会出现大量病毒，它们可以在海水中传播。
使用病毒进行海洋生物学考察是一种十分有效的工具，可以促进我们对海洋生物的理解，并有助于我们推断环境的演变。
海洋浮游病毒的多样性不仅表现在它们的结构外，而且也体现在它们的遗传学特征上。
研究表明，海洋浮游病毒具有很高的多样性，它们的核心结构和功能也有所不同，可以利用这种多样性来帮助人们鉴别海洋浮游病毒的分布，以及海洋生物的分类和分类学研究。
海洋浮游动物群落结构与生态功能研究海洋浮游动物是海洋生态系统中一大类重要的生物群体，它们具有多样的群落结构和生态功能。
本文将探讨海洋浮游动物群落结构及其对海洋生态系统的生态功能。
一、海洋浮游动物群落结构的组成海洋浮游动物群落结构主要由浮游植物和浮游动物两大类组成。
浮游植物包括浮游藻类和细菌等微小植物，而浮游动物包括浮游甲壳动物、虾类、鱼类等。
1. 浮游植物群落结构浮游植物主要由硅藻、硅藻类、硅藻虾和甲藻等组成。
它们是海洋生态系统中重要的初级生产者，通过光合作用将太阳能转化为化学能，并释放氧气。
浮游植物的生长和分布受到水温、光照、营养盐和浮游动物的控制。
2. 浮游动物群落结构浮游动物包括浮游性无脊椎动物和鱼类等。
无脊椎动物主要有浮游甲壳动物、虾和瓢虫等，它们是浮游动物群落中的重要捕食者，通过摄食浮游植物和其他浮游动物来获取能量。
鱼类在浮游动物群落中处于更高的营养级别，它们通过摄食浮游动物和无脊椎动物来获取能量。
二、海洋浮游动物群落的生态功能海洋浮游动物群落在海洋生态系统中发挥着重要的生态功能，包括能量传递、物质循环、气候调节和环境监测等。
1. 能量传递海洋浮游动物群落是海洋生态系统的能量传递桥梁。
浮游植物通过光合作用转化太阳能为化学能，成为海洋食物链的起点。
浮游动物摄食浮游植物，并成为更高营养级别的生物摄食对象，将能量传递给更高级别的捕食者，实现能量的流动。
2. 物质循环海洋浮游动物群落在生物地球化学循环中发挥着重要作用。
浮游植物通过吸收和固定二氧化碳，将其转化为有机碳，并通过死亡和沉降将有机碳沉入海洋底部，促进碳的储存；同时，浮游动物通过摄食和排泄作用，将营养盐和有机物质重新释放到海洋中，参与了氮、磷等关键元素的循环。
3. 气候调节海洋浮游动物群落通过影响海洋生态系统的光学特性和气溶胶的生成释放，对气候调节起到重要作用。
浮游植物通过光合作用，吸收二氧化碳并释放氧气，稳定大气中的气体成分；同时，浮游动物的代谢作用产生的气溶胶影响大气中的能量和湍流，对气候和气候变化起到调节作用。
海洋浮游病毒最主要的组成部分【摘要】海洋浮游病毒是海洋生态系统中丰度最大的生物有机体，在海洋生态系统中发挥着中要的作用。
海洋浮游病毒的生态学研究一直是海洋生态学研究的热点。
其研究方法也在不断发展和完善。
本文分别对病毒丰度、生产力的测定方法、多样性的检测方法以及分离培养鉴定方法及其发展等方面进行了总结和阐述，并对各部分研究方法的优缺点进行了讨论分析。
【关键词】海洋浮游病毒；研究方法；丰度；生产力；多样性；分离培养海洋浮游病毒是海洋生态系统中丰度最大的生物实体[1]。
海洋浮游病毒在海洋生态系统中发挥着重要的作用，对宿主的侵染和裂解作用，介导着大约20% 的宿主死亡率，大大加快了物质循环的速度[1]，并且调节着宿主群落结构的组成。
与此同时，病毒也扮演着介导水平基因转移，促进宿主类群进化的重要角色[1]。
除此之外，海洋病毒宏基因组学的研究表明海洋浮游病毒类群有着巨大的多样性，并且包含着大量未的基因[1，2]。
海洋浮游病毒重要的生态作用必然使海洋浮游病毒生态学的研究成为热点。
目前，海洋浮游病毒的生态学研究主要从丰度，多样性，病毒介导的宿主死亡率，病毒与宿主的相互作用等方面开展。
而目前在各方面生态学研究中使用的方法可总结如下。
1. 海洋浮游病毒丰度的检测方法目前用于水生生态环境中浮游病毒丰度的测定方法主要有以下3种：透射电子显微镜技术（TEM），表面荧光显微镜技术（EFM）和流细胞分析检测技术（FCM）[3，4]。
1.1 透射电子显微镜技术（TEM）透射电子显微镜技术是早期海洋病毒学研究中病毒定量最常用的方法。
使用这项技术时，要求浓缩海水中的病毒，把浓缩液滴置于铜网上，负染后镜检观察。
这项技术在检测病毒丰度的同时还能获取病毒形态方面的信息[5]。
但该项技术的检测的下限高，涉及到海水浓缩，染色，观察等诸多可能产生误差的环节，并且步骤繁琐，对操作人员的技术，仪器的要求都较高[6]。
1.2 表面荧光显微镜技术（EFM）表面荧光显微镜技术是目前检测病毒丰度使用最为普遍的方法。
CARD-FISH在海洋细菌鉴定中的应用摘要用辣根过氧化物酶(HRP)标记寡核苷酸探针和信号扩增系统，称为记者催化沉积(CARD)的荧光原位杂交(FISH)，目前并非普遍适用于海洋异养细菌样本。
HRP分子渗透到细菌细胞需要通透过程，这很可能会造成物种选择性细胞丢失。
在这里，我们提出了一种CARD-FISH的改进方案，用于鉴定海洋浮游和底栖微生物。
在样品过膜浓缩之后，滤膜过滤器嵌入到低凝胶点琼脂糖中，在90min 的溶菌酶孵育（10mg/mL，37℃）过程中，没有观察到细菌细胞数目减少。
用普通的细菌探针（EUB338-HRP）通过CARD-FISH方式所测定的北海沿岸浮游细菌的检出率（平均值：总细胞数的94%；范围：85%--100%）显著高于用单一标记的探针（EUB338-mono；平均值，48%；范围：19%--66%)所测出的检出率。
在用反义EUB338-HRP CARD-FISH之后，几乎没有观察到非特异性染色。
海洋SAR86分支的成员用单一标记的探针FISH是检测不到的；然而，一个大量种群却可以通过CARD-FISH被可视化(平均值：7%；范围：3%--13%)。
EUB338-HRP 在Wadden海洋沉积物中的检出率(平均值：81%；范围：53 %--100%)，几乎是EUB338-mono检出率的两倍(平均值：44%；范围：25 %--71%)。
增强的荧光强度和信号背景比率使CARD-FISH优于FISH——用直接标记的寡核苷酸来染色海洋环境中低rRNA含量的细菌。
1.引言细菌的荧光原位杂交（FISH）在十几年以前被一次提及，并被誉为微生物生态学的一项突破。
然而，研究人员在将该方法应用于除了高度富营养化系统的环境样品中时遇到了困难。
水生生境中的大多数细菌个体体积小，生长缓慢，或饥饿，浮游细菌细胞杂交的信号强度往往低于检测限或迷失在高背景荧光中。
过去几年中，在增强FISH的灵敏度上已作出许多努力，包括使用明亮荧光染料、图像增强影像显微镜、氯霉素处理处于生长状态细菌的rRNA、用不止一个的荧光标记寡核苷酸探针杂交、寡核苷酸探针助手、多标记多核苷酸探针、通过级级联酶扩大信号。
探索海滋奇观海洋浮游植物的生态功能海洋浮游植物是海洋生态系统中至关重要的一部分，它们具有丰富的生态功能。
海洋浮游植物是指那些随海流漂浮在海洋中的微小植物，包括各类藻类和细菌。
它们在海洋中扮演着重要的角色，对整个海洋生态系统的稳定性和可持续性发挥着重要的作用。
首先，海洋浮游植物是海洋生态系统的主要生产者之一。
它们通过光合作用将太阳能转化为有机物质，为海洋中的其他生物提供养分。
海洋浮游植物通过吸收二氧化碳并释放氧气，调节海洋中的氧气含量，维持海洋生态系统的氧气平衡。
同时，它们还是海洋食物链的基础，为其他浮游生物和海洋动物提供食物来源。
这些生物通过摄食海洋浮游植物，将能量转移到更高级别的生物中，形成食物链，维系整个海洋生态系统的生态平衡。
其次，海洋浮游植物对海洋生态系统的碳循环具有重要影响。
它们通过光合作用吸收二氧化碳，将其转化为有机碳，并在其体内进行碳储存。
这些有机碳随着海流的流动沉积到深海底部，形成了巨大的碳汇。
海洋浮游植物的生长和死亡过程中释放出的有机物质，也为深海生物提供了重要的碳源。
这些过程参与着全球碳循环，影响着海洋和大气中的二氧化碳浓度，对全球气候起着调节作用。
另外，海洋浮游植物还对海洋生态系统中的营养循环起着重要的调节作用。
它们在海洋中吸收和存储了大量的无机营养物质，如氮、磷等。
这些营养物质在浮游植物死亡后释放到海洋中，提供了其他生物所需的养分。
同时，海洋浮游植物的盛衰周期也会影响海洋中的营养盐含量，进一步调节海洋生物的生长和繁殖。
这种营养循环的平衡对于维持海洋生态系统的稳定性和生物多样性至关重要。
此外，海洋浮游植物还对水体的光线透明度和水质进行调节。
它们通过光合作用吸收水中的光线，降低水体的透明度，减少有害浮游植物和藻华的生长。
同时，浮游植物通过吸收废弃物和有毒物质，促进水质的净化和改善。
它们作为一个过滤器，对水体中的有害物质起到了一定的净化作用。
总之，海洋浮游植物作为海洋生态系统中的重要组成部分，具有丰富的生态功能。
海洋浮游细菌研究1 引言海洋细菌是海洋生态系统中的重要组成部分，在海洋物质循环、能量流动以及生态调控等方面具有重要作用.海洋细菌的群落结构与种类组成直接影响整个海洋生态系统的健康发展，同时细菌群落结构又与其栖息的环境密切相关.海洋细菌的分类鉴定及其群落结构的分析方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类(金光，2011)，表型鉴定法包括细菌形态和生理生化水平、细胞组分水平、蛋白质水平上的鉴定，分子遗传学鉴定法是在核酸水平上的鉴定，包括核酸杂交、PCR 技术、16S rRNA序列分析、全基因组测序等.变性梯度凝胶电泳(Denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE)技术最早是由Fischer和Lerman于1983年创立的，是根据在不同浓度的变性剂中DNA片段解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将片段大小相同而碱基组成不同的片段分开.近年来PCR-DGGE技术已经广泛运用于细菌的群落结构分析中.大亚湾位于南海北部，是广东省重要的养殖基地，也是大亚湾核电站和惠州港所在地.由于近些年该海域污染日趋严重，海洋环境状况发生显著变化，浮游细菌群落结构也会发生明显变化.目前有关大亚湾浮游细菌方面的报道不多，尚未有浮游细菌DNA指纹及分子多样性方面的报道.为了了解大亚湾海域浮游细菌群落结构以及分子多样性，本文采集了大亚湾海域表层水样，利用PCR-DGGE技术对浮游细菌的DNA指纹进行了研究，以揭示DGGE技术等分子手段在浮游细菌群落结构多样性分析上的应用.2 材料与方法2.1 样品的采集与处理在广东省大亚湾海域设置的9个采样点(图 1).S1～S3位于大亚湾澳头海域，该海域毗邻惠州市澳头镇，是重要网箱鱼类养殖基地;S4～S6位于大鹏澳海域，该海域位于深圳市大鹏镇，湾内有鱼类和贝类养殖区，同时也是大亚湾核电站和岭澳核电站所在地;S7～S8位于大亚湾湾口，受到养殖和人类活动的影响较小.分别于2010年12月15日(2010年冬)、2011年6月8日(2011年夏)采集表层水样，每个采样点采集水样9 L，并在现场用中性鲁哥试剂固定.固定的水样先用孔径为10 μm网筛过滤，然后再依次用GF/A滤膜(Whatman)以及 0.2 μm 聚醚砜滤膜(Millipore)过滤，滤膜上的样品置于1.8 mL SET裂解缓冲液(20% 蔗糖，50 mmol · L-1 Tris-HCl pH 7.6，50 mmol · L-1 EDTA)中，储存在-20 ℃待分析.图1 大亚湾采样点的设置2.2 水环境因子的测定水温、盐度、电导率、溶解氧(DO)、pH值等理化因子通过采用美国YSI-561多参数水质分析仪进行现场测定，透明度用萨氏盘测定.2.3 DNA的提取及16S rRNA基因V3区的PCR扩增利用美国Omega公司细菌基因组DNA的提取试剂盒提取细菌基因组DNA，方法参照产品说明书.采用原核生物通用引物Eubac341F(5′-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)和Eubac517R(5′- ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′)对细菌rRNA基因16S V3区的保守序列进行PCR扩增(Muyzer et al., 1993; Celussi et al., 2008)，并在Eubac341F 5′端添加GC2夹子:5′- CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC-3′)，扩增体系为30 μL，扩增体系中各组分含量为别为：10×buffer 3 μL，dNTP 1 μL，上下游引物各0.3 μL，Taq DNA聚合酶0.4 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 21 μL.PCR扩增反应程序：95 ℃ 4 min，94 ℃ 30 s，65~55 ℃ 30 s，72 ℃25 s每个循环降0.5 ℃，(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s)× 20个循环，72 ℃ 7min，4 ℃∞.扩增产物用1%琼脂糖凝胶进行检测，用1×的gelgreen工作液进行胶前染色.2.4 DGGE分析取PCR产物30 μL，在Bio-Rad公司的DcodeTM通用突变检测系统对PCR产物进行DGGE分析，DGGE条件为：丙烯酰胺质量分数 8%，变性梯度40%～64%(100%的变性剂浓度为7 mol · L-1尿素和质量分数40%去离子甲酰胺)，并在上述两种凝胶液中分别加入100 μL 10%的过硫酸铵(ASP)和10 μL的四甲基乙二胺(TEMED).先用200 V预电泳20 min左右以去除胶空中的杂质，然后加入PCR产物样品，200 V电泳5 h.200 V电压电泳20 min，然后再用 200 V电压电泳5 h，缓冲液为1 × TAE，电泳结束后用超纯水冲洗两次，后置于1×SybrGreen工作液中避光染色30 min，用 Bio-Rad公司凝胶成像系统(GelDoc2000TM)进行拍照，DNA指纹图谱用Quantity one软件进行分析.2.5 数据分析与处理2.5.1 Shannon-Weaver多样性指数(H′)式中，n为每个泳道的条带数目，Pi=Ni/N，Ni为第i条条带的峰面积，N为该泳道所有条带的峰面积总和.2.5.2 Pielou均匀度指数(J)其中，H′为某泳道的Shannon-Weaver多样性指数，S为对应泳道的DNA指纹条带数.2.5.3 统计分析利用SPSS 18.0对冬季和夏季浮游细菌DNA指纹条带数、H′和J值进行显著性差异t检验，对DNA指纹条带数与环境因子进行Pearson相关性分析.3 结果3.1 水环境因子表 1列出了两次调查中大亚湾海域各站位的水环境因子，可以看出大亚湾海域水温较高，即使在12月份的冬季，水温仍可以达到20 ℃左右;夏季水温则高达29 ℃左右.各站位间水温差异不大，一般小于1 ℃.两次调查期间盐度相近，在33~34之间.冬季pH值略高于夏季，而DO 值和透明度则明显高于夏季.表1 2010年冬及2011年夏大亚湾海域水环境因子3.2 DGGE指纹图谱分析2010年冬季和2011年夏季大亚湾海域浮游细菌的DNA指纹图谱见图 2.结果显示，条带分离较好，冬季条带亮度较夏季弱，冬季浮游细菌丰度较低.从带型模拟图(图 3)中可以更清楚看到各站位浮游细菌DNA指纹图谱，冬季和夏季样品中分别共得到32条和33条条带.图2 大亚湾海域浮游细菌16S rDNA V3区DNA图谱(a. 2010年冬，b. 2011年夏)图3 大亚湾海域浮游细菌16S rDNA V3区DGGE图谱分析带型图(其中水平轴上的数字(1～9)为站点编号，百分比是与标准泳道的匹配度; 垂直轴上的数字为DNA条带编号(a. 2010年冬，b. 2011年夏))冬季样品共有的优势条带较多，如灰度较大的优势菌群条带1、2、5、8、10、11、12在各个站位均有出现，条带1和条带2为最为常见优势条带，条带11和12在S2以及S5~S8站位较为丰富(图 3a).以S7为标准，其余站位与之匹配度为49.8%~76.7%之间，位于大鹏澳海域的几个站位与S7的匹配度较高，而位于澳头海域的S1~S3与之匹配度较低，说明这两个海域浮游细菌存在一定空间异质性，但整体来说比较均一.夏季样品中共同的优势条带较少(图 3b)，条带2在每个站点均出现，且灰度值比较大，为优势菌群;但有些灰度值较大的条带(优势菌群)只在部分采样点出现，如条带3、10、21、31.以S3为标准，所有泳道与S3的匹配度差别不大，在60.0%~68.6%之间(图 3b)，说明夏季浮游细菌空间分布差异较低.3.3 浮游细菌DNA指纹多样性大亚湾海域浮游细菌DNA指纹条带数见图 4.各站位条带数变化不大，冬季为18~22条，平均为20条;夏季较高，为19~25条，平均为23条.夏季指纹条带数明显高于冬季(p<0.01).图4 大亚湾浮游细菌DNA指纹条带数与DNA指纹条带数不同，冬季DNA指纹的Shannon-Weaver多样性指数(H′)略高于夏季(p>0.05)，冬季和夏季H′值的变化范围分别为2.51~2.88和2.48~2.79;而均匀度(J)则在冬季明显较高(p<0.01)，冬季和夏季分别为0.83~0.93以及0.80~0.88.3.4 浮游细菌DNA指纹与环境因子的关系从浮游细菌与环境因子之间的相关关系可以看出，DNA指纹条带数与环境因子密切相关，其中与温度和盐度明显正相关(p<0.05)，而与pH、DO以及透明度明显负相关(p<0.05或p<0.01)，结果说明高温高盐可促进浮游细菌多样性，而pH、DO、透明度下降等水质恶化现象则可降低浮游细菌的种类丰富程度.H′值仅与J值呈明显正相关;而J则与水温明显负相关，与pH和DO明显正相关.各种环境因子之间几乎均呈现出明显的相关关系，其中水温与pH、DO、透明度均明显负相关(p<0.05或p<0.01)，说明夏季水质较冬季差;而DO又与pH和透明度明显正相关(p<0.01).图5 大亚湾浮游细菌DNA指纹的Shannon-Weaver多样性指数(H′)和PieLou均匀度(J)(a.H′，b. J)表2 浮游细菌DNA指纹及其多样性指数与环境因子的相关关系4 讨论4.1 大亚湾海域浮游细菌多样性浮游细菌种类丰富程度以及DNA指纹条带数与海域环境状况以及富营养化程度密切相关，在富营养化海区细菌丰度较高，但种类数和多样性下降.在本研究中，DNA指纹条带数与pH、DO以及透明度均呈明显的负相关关系，说明水质能影响浮游细菌的种类数.大亚湾海域浮游细菌种类较丰富，每个样品观察到的DNA条带数为18~25条，冬季和夏季分别检测到32和33条带.在同期的可培养浮游细菌调查中，共分离培养了70株菌株，根据16S rDNA序列分析，获得了35个不同序列，细菌种类数与本研究相近.大亚湾海域浮游细菌的DNA指纹条带数明显高于以往的研究报道，如黄海冷水团海域的浮游细菌DNA指纹条带数仅17条左右(刘敏等，2008)，东海长江口赤潮高发区各站位浮游细菌指纹条带数不超过20条，葡萄牙的Ria de Aveiro海域浮游细菌的条带数与本研究相近，为17~24条;而与地中海西北部海域浮游细菌的DNA指纹条带数相近，为26~36条.但是大亚湾海域浮游细菌的Shannon-Weaver多样性指数(H′)较低，平均仅为2.63，低于其他海域浮游细菌多样性指数，并且低于同期调查的本海域可培养浮游细菌的多样性指数.大亚湾海域DNA指纹条带较丰富，说明该海域物种数较丰富，但某些耐受能力较强的物种在数量上占据优势，致使细菌菌落结构多样性下降.从DNA指纹图谱和带型模拟图中也可看出，优势种类亮度较高，优势度明显.大亚湾海域曾被认为是我国近岸海域水质较好的港湾之一，但近年来富营养化程度明显上升，而且营养盐补充及时，初级生产力较高(孙翠慈等，2006).在近年来的浮游植物调查中，也发现大亚湾浮游植物种类丰富，数量较高，浮游植物种类多样性指数较低的现象.虽然夏季浮游细菌的DNA指纹条带数明显高于冬季，但冬季的种类多样性指数和均匀度指数略高于夏季.一般在温带海域浮游细菌季节变化明显，冬季细菌种类多样性和数量均明显低于夏季.大亚湾位于亚热带，全年平均水温在25 ℃以上，冬季水温也较高，即使在12月份水温也达到20 ℃左右.因此，浮游细菌的生长不会受到冬季低温的影响，但浮游细菌DNA指纹条带数仍与水温呈明显的正相关关系，而H′则与水温负相关，结果说明高温能促进细菌种类数，但种类多样性下降.大亚湾海域浮游植物群落结构与浮游细菌相近，同样是夏秋季节浮游植物种类丰富，数量较高，但是多样性指数较低;冬季虽然种类数下降，数量也同时下降，各物种分布更加均匀，种类多样性上升.而浮游细菌群落结构变化主要由水体中营养物质引起以及有机质有关，大亚湾属于一个封闭性养殖内湾，有机物质含量丰富，而冬季浮游植物高峰也为浮游细菌提供了丰富的有机质.4.2 DGGE技术在细菌群落结构研究中的应用DGGE技术能在一定程度上较全面反映浮游细菌群落结构，不能培养的细菌特别是未能培养的优势菌群能在DGGE图谱中得到反映.如与本研究同时采集的大亚湾水样，用培养法一个样品最多能培养出12个菌株(江晓亮等，2013)，而DGGE技术则能显示出18~25个条带.但是利用PCR-DGGE技术对细菌群落结构进行分析尚存在一些不足，在PCR-DGGE过程中，优势种对非优势种具有屏蔽作用，DNA样品中低于1%的种类无法在DGGE图谱中显现出来(Muyzer et al., 1993);而不同细菌之间基因的拷贝数以及基因组大小的差异性也会对细菌DNA指纹数及亮度产生影响，从而导致该技术对浮游细菌群落结构的评价产生偏差.此外PCR-DGGE技术不能对细菌进行准确的分类鉴定，仅能相对反映细菌的种类多样性.如果需要对细菌进行进一步分类鉴定，需要切胶测序.而且PCR-DGGE技术不能准确对细菌进行定量分析，DGGE条带的强弱程度只能表示不同种类的细菌之间的相对丰度.虽然本研究未对DGGE条带进行切胶测序，但在同期调查中对可培养细菌进行了16s rDNA 序列测定(江晓亮等，2013)，分析鉴定了35种可培养细菌，其中以α-变形菌纲(Alphaproteobacteria)和放线菌纲(Actinobacteria)为分离最多的两大类，此外还包括β-变形菌纲(Betaproteobacteria)、盖球菌属(Kytococcus)以及间胞囊菌属(Intrasporangium)的菌株.由此可见，虽然PCR-DGGE技术在研究群落动态和多样性方面存在优势，但该技术无法给出细菌的代谢活性、数量和基因表达水平方面的信息，必须与其他技术相结合以弥补其本身的不足，如酶学分析均可以提供群落代谢活性特征，荧光原位杂交技术可以提供细菌的相对数量，而通过与荧光定量PCR结合，可以对群落的细菌数量进行定量分析.因此，PCR-DGGE技术与其他分类以及分子生物学技术结合后，可更好地反映海洋细菌群落结构与功能.具体参见污水宝商城资料或更多相关技术文档。
