重组质粒构建(protocol)

重组质粒的构建经验 [技巧]重组质粒的构建经验~~~昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。

重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。

在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。

但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。

在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。

所涉及内容如下: 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。

一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。

首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。

然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。

这是常识，不赘述。

2、保护碱基数目的问题。

在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。

但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。

这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。

一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。

如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。

下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。

NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4 案例分析一:本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。

同源重组构建质粒原理
同源重组构建质粒原理是广泛应用的一种分子克隆技术，它是通过以一种支配者DNA （终受者）为被复制的物质，把它和稳定地选择自模板DNA（发起者）结构共同复制到新的DNA支配者中去来实现的，从而制备出一条含有模板DNA内容的载体，也就是质粒。

在这种构建质粒原理中，主要涉及到三个部分：基因组工程技术、质粒形成技术和载体技术，所有这些技术合一起来完成目标基因的表达。

在基因组工程技术里，利用保守酶以及脱氧核糖核酸酶将目标基因从来源物种中分离出来，并通过基因改造、基因重组来获得理想基因。

质粒形成技术是一种以DNA结合胞嘧啶为主的构建技术，大体来说，它主要是把所需要的基因引物酶及基因改造材料结合在一起形成质粒。

载体技术则是把质粒转移到另一种有定位作用的目标载体上，这样就可以准确选择和组装基因。

此外，在构建质粒过程中，还会加入一些酶，比如胞嘧啶去氧核糖核酸酶等，来有效促进和加强复制过程中质粒，协助把复制后的DNA片段定位与模板DNA上，形成可合成的质粒。

通过上述步骤，就可以把特定的基因克隆到所需的质粒中，从而完成对基因的表达分析，以及下一步的功能分析。

同源重组构建质粒原理在分子克隆技术中占有不可替代的重要地位，是决定新型载体能否稳定表达基因的关键技术。

转化及转化子的鉴定11243224 周雨一、感受态细胞的制备1、材料：E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA: 购买或实验室自制,eppendorf 管。

2、设备：恒温摇床,电热恒温培养箱,台式高速离心机,无菌工作台,低温冰箱, 恒温水浴锅, 制冰机, 分光光度计,微量移液枪。

3、试剂：LB固体和液体培养基，Amp母液，含Amp的LB固体培养基，麦康凯培养基(Maconkey Agar)，0.05mol/L CaCl2溶液，含15%甘油的0.05mol/L CaCl2。

4、受体菌的培养：从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。

将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。

5、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。

弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。

弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。

感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-70℃可保存半年。

二、转化1、DNA和感受态细胞都置于37度恒温水浴锅中激活，然后将DNA转移到感受态细胞悬液中，反复吹打，使其均匀接触（由于细菌可以从环境中直接吸收DNA）；2、运用热胀冷缩的原理，将混悬液放在冰水浴中半个小时到40分钟（最短时间），使得DNA 与细胞表面受体结合；3、轻轻的将混悬液置于37到45度的水浴锅45秒；4、平稳快速的转入冰水浴中2分钟；5、取出，加入900ul 的37℃预热的LB培养基，混匀；6、放入37度的培养箱1小时，让菌苏醒，恢复生长；7、取适当离心（3000至4000r/min，1min，弃部分上清液200微升）的管中细胞均匀地接种在选择培养基（LB培养基+某种抗生素）；8、提前一天进行抗生素平板，培养基灭菌，之后，加入抗生素（青霉素），分布均匀，冷却至60度以下，适当摇瓶，摇着冷却，混匀后，涂平板，冷却凝固，再放入冰箱充分凝固，再在37度培养箱1 小时，烘干水，离心，3000-4000 r/min 1 min ，去上清；9、挑选部分的菌落，至少5个（随机）单菌落，进行扩大培养，以便于鉴定；10、将菌作为PCR模板进行扩增（菌落PCR)；11、进行菌种保藏，在液体培养基上；12、再将菌种送到公司测序，如果是碱基突变、引起氨基酸变化等，就需要重新开始做。

重组质粒的构建【目的】1. 验证基因工程的基本理论和聚合酶联链反应的基本原理。

2. 熟悉重组质粒的构建和利用聚合酶联链反应法获取目的基因的方法。

3. 了解 PCR 仪的使用方法。

【原理】1.DNA 的分离与纯化原理基因组 DNA 因来源不同、性质不同以及用途不同，其分离纯化的方法也不相同。

哺乳动物细胞基因组 DNA 的分离与纯化的方法主要有酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻棒缠绕法以及各种快速方案。

本实验以哺乳动物细胞为例，介绍制备高分子量DNA 样品的酚抽提法。

酚抽提法可用于多种来源标本的高分子量 DNA 样品的制备，包括单层培养细胞、悬浮生长细胞、新鲜的组织以及血液标本等。

本实验所用的酚抽提法源自对 1976 年 Stafford 及其同事提出的方案的改进。

它以含 EDTA 、 SDS 及 RNA 酶（无 DNA 酶）的裂解缓冲液裂解细胞，经蛋白酶 K 处理后，用 pH8.0 的 Tris 饱和酚进行抽提，离心分层后，蛋白质因变性位于有机相与水相的界面，而 DNA 进入水相，重复抽提 DNA 至一定纯度，根据不同需要进行透析或沉淀处理，获得所需范围的高分子量 DNA 样品。

分离过程中 EDTA 为二价金属离子螯合剂，可以抑制 DNA 酶的活性，同时降低细胞膜的稳定性。

SDS 为生物阴离子去垢剂，主要引起细胞膜的降解并能乳化脂质和蛋白质 ,SDS 与这些脂质和蛋白质的结合可以使它们沉淀 ,SDS 的非极性端与膜磷脂结合，极性端使蛋白质变性和降解，所以 SDS 同时还有降解 DNA 酶的作用。

无 DNA 酶的 RNA 酶可以有效水解 RNA ，而避免 DNA 的消化。

蛋白酶 K 则有水解蛋白质的作用，可以消化 DNA 酶和 DNA 上的蛋白质，也有裂解细胞的作用。

酚可以使蛋白质变性沉淀，也可抑制 DNA 酶的活性。

pH8.0 的Tris 缓冲液能保证抽提后 DNA 进入水相，而避免滞留于蛋白质层。

多次抽提，可提高 DNA 的纯度。

一、引物设计:1,选择合适的载体。

酶切位点及其顺序（酶切位点的顺序一定不能颠倒）。

2，在NCBI上再次确认目的片段的碱基序列，进行primer blast，确定其特异性。

1，使用primer5排除目的片段里含有的酶切位点，或利用其本身含有的酶切位点，最后确定所使用的酶。

2，设计引物：primer-up：Primer-down：3，核对----送公司合成。

4，对公司合成的引物离心，10000rpm、5-10分钟、at 4℃，在超净台按照管子上标注的体积加入1*TE，为100uM，再用ddH2O稀释成10uM，-30℃保存。

二、PCR（）：（一）、引物Tm值titrate：pcr（15ul小体系）Sence：0.3ul 一般titrate5个温度值，并设一Anti sence：0.3ul 个NC（不加template）DNTP：0.3ul cDNA一般为Hela或293T Taq：0.1ul10*buffer： 1.5ulTemplate（cDNA）：1ulH2O：11.5ul（二）、pcr（50ul大体系）Sence：1ul Tm温度用titrate时得到的条带Anti sence：1ul 最亮的温度DNTP：1ulTaq：0.5ul 10*buffer：5ul Template（cDNA）：2ul H2O：39.5ul三、跑胶，胶回收:称1.2g的琼脂糖加入100ml的plasmid越小胶浓度越大）胶凝固后，即可点样跑胶。

2、跑胶：120V、40min。

3、泡EB溶液20min后，紫外灯下观察，切胶（要带防护手套和口罩）4、做胶回收:（1）加入400ul溶胶液，55℃溶胶；（2）待胶全溶后，过胶回收柱，12000rpm，1min；（3）DNA Wash Buffer 500ul，12000rpm，1min，twice；（4）开盖离心，15min；（5）换新的1.5ml EP管，加Elution Buffer 30ul，12000rpm，1min，重复吸取，12000rpm，1min；（Elution Buffer使用前65℃温热）（6）测浓度四、连接：2x Buffer 5ul10ul的体系T Vector 0.5ul 16℃水浴过夜Insert 4ulLignase 0.5ul若insert浓度较大，应加的量小于4ul，则其余部分用水补齐。

重组表达质粒的构建重组表达质粒的构建1．原核表达载体选择质粒载体是重组蛋⽩表达的关键⼯具，其结构如下图。

重组蛋⽩表达，我们⾸先要将基因插⼊到表达载体上，插⼊的位置为多克隆位点。

质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋⽩的表达都是⾄关重要的。

尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋⽩不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。

这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动⼦和融合标签的差异。

蛋⽩表达优化主要⼯作也就是尝试构建不同融合表达标签，使⽤不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。

常⽤的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。

福因德⽣物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。

我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋⽩怎么表达成功，更要考虑蛋⽩怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。

以上为原核表达常⽤的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业⽹站或专业书籍已对此做详尽解释，科研⼯作者可根据具体实验设计⽅案，组合设计以上标签和酶切位点的使⽤。

特别值得注意的是，选⽤和设计蛋⽩酶切位点的时候⾸要考虑的是序列内部有没有蛋⽩酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋⽩酶试剂成本。

⼀般商业化载体，在标签蛋⽩与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。

标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签⾼效翻译起始位点带动插⼊蛋⽩的表达,可溶性标签的⾼效表达更可促进蛋⽩的可溶性表达;同时,⼤部分的蛋⽩内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。

在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引⼊了可与别的蛋⽩相互作⽤的序列或者蛋⽩酶切位点。

重组质粒的构建实验流程—质粒构建实验操作一、LB培养基配置LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。

其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子，NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。

【试剂】胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、NaCl、琼脂（Agar）【实验步骤】1、LB固体培养基配方（配置100ml培养基）胰蛋白胨（Tryptone） 1g酵母提取物（Yeast Extract）0.5gNaCl 1g琼脂（Agar）1.5g单蒸水100ml蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药品，瓶盖也不要盖错。

2、液体培养基除不加琼脂外，其余同固体培养基一样。

3、包扎用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。

4、灭菌将上述培养基以1.05kg/cm2、121.3℃、20min高压蒸汽灭菌。

如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4℃冰箱内暂存。

灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。

5、LB固体培养基倒板○1配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。

○2抗生素的加入：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培养基温度降至55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。

○3倒板：一般10ml倒1个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10—15min。

○4保存:将培养皿倒置放于4℃保存，一个月内使用。

二、质粒的提取（protocol）1、大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至5ml的含有抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。

【注：培养液不宜过量，过量时会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。

】2、5ml菌液倒入5ml离心管中，10,000xg，1min离心，弃上清。

重组质粒构建生物学——屠仁军(新浪) 一、载体与外源片段（PCR产物）的双酶切为了保证做连接反应时有足够的外源DNA片段，应该加入1ug的DNA进行酶切反应；两种酶分别加1ul，10×buffer 2ul，1ug的DNA，加水至20ul。

（因此要跑胶分析DNA以及载体的浓度，取1-2ul，电泳检测其含量。

1ul体积太少，可以将其稀释在9ul水中，再加loading buffer。

6ul 15000bp的marker，2500bp条带的亮度约是100ng DNA。

可对比marker的亮度算出酶切回收的DNA的浓度，以便于确定连接反应时的用量。

Image J软件可以做灰度分析。

）双酶切反应结束后，使用PCR cleanup试剂盒回收DNA与载体。

回收完之后用同样的方法分析其浓度。

（也可以用分光光度计直接测量DNA的浓度，但是，一般酶切反应之后其浓度会比较小，取1ul 稀释100倍之后浓度很低，可能已经低于仪器的测量围，而电泳灵敏度很高，还可一排除杂带、RNA、蛋白质等对浓度的干扰。

）二、连接反应载体100ng，DNA片段根据大小，1ul buffer，1ul T4连接酶，加水至10ul；16℃连接12-16h。

载体（约0.03pmol）与外源DNA的摩尔比大约1：3-1：10之间，根据载体与DNA片段的长度，可算出需要的量。

因为载体的大小一般在5kb-10kb，因此，严格的算出0.03pmol的载体的质量意义不大，大约100ng即可。

如果时间比较紧，可以25℃连接15min，之后可取5ul进行转化，剩余5ul于16℃继续连接。

三、质粒转化到感受态大肠杆菌中从-70℃中取出感受态，指尖轻转融化后立即插入冰上，5ul连接产物+100ul感受态大肠杆菌，充分混匀后冰浴30min，然后42°热激90s，热激时不要晃动EP管。

然后立即插入冰上，静置2min。

（连接产物的量尽量不超过感受态体积的5%，否则会降低转化效率，从而得不偿失。