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![重组质粒的构建经验 [技巧]](https://img.taocdn.com/s1/m/f026746187c24028915fc3fa.png)
重组质粒的构建经验 [技巧]重组质粒的构建经验~~~昨天我在版中我看很多谷友询问重组质粒的构建问题，有些谷友说构建质粒需要一个月，甚至更长时间，这让我联想我刚做分子生物学时候的曲折。
重组质粒构建是常用的分子生物学手段，其实只是最基本的方法，一般一个星期同时构建三二个组质粒是没有问题的。
在国内先进的实验中，也大都是由实验员搞定。
但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。
在这里将我的心得分享于大家，这也是我本人几年来一线工作时的经验积累，以期能为谷友提供借鉴，让大家在实验中少走弯路。
所涉及内容如下: 1) 克隆基因的酶切位点问题 2) 载体酶切的问题 3) 连接片段浓度比的问题在阐明上述问题同时，本人尽可能举些实验中的问题案例予以说明。
一、克隆基因的酶切位点问题 1、克隆位点选择的问题。
首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。
然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。
这是常识，不赘述。
2、保护碱基数目的问题。
在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。
但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。
这种忽视碰可能会大大影响后续的实验进展。
一般情况下，普通的内切酶只加入两个保护碱基，其内切反应就可以正常进行;而有一类，仅仅只加入两个保护碱基，其内切反应就不能正常进行，这是因为内切酶不能正常结合DNA片段上。
如NdeI就属这类，需要加入至少6个保护碱基，常用的HindIII也要三个。
下面是我提供这类酶的列表及其所需最少的保护碱基数，相信下列将有助于大这家的实验设计。
NcoI 4 NdeI 6 NheI 3 NotI 8 PmeI 6SacI 3 SalI 3 SmaI 3 HindIII 3 BstI 8 SphI 4XhoI 3 XbaI 3 SmaI 4 案例分析一:本人最初曾选用NdeI克隆位点，未注意到保护碱基数目的问题，设计PCR引物时，引入NdeI酶切位点后，只加上两个保护碱基，一个月内没有进展，始终不能成功构建重组载体。
重组质粒的构建重组质粒的构建是基因工程的核心步骤之一，其目的是将目的基因插入到质粒载体中，以实现目的基因的稳定表达和克隆化。
以下是重组质粒构建的主要步骤：1.目的基因获取首先需要获取目的基因。
目的基因可以从基因文库、PCR、基因组测序等方法中获取。
根据需要选择合适的方法，将目的基因克隆到质粒载体中。
2.载体质粒选择选择适合的质粒载体是重组质粒构建的关键步骤之一。
根据目的基因的特点和表达要求，选择适合的质粒载体。
常见的质粒载体有pET、pUC、pBluescript等。
3.限制性酶切限制性酶切是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过限制性酶切，将目的基因和质粒载体分别切开，露出粘性末端，以便于连接反应。
4.连接反应将切好的目的基因和质粒载体的粘性末端连接在一起，形成重组质粒。
连接反应需要使用T4DNA连接酶或其它连接酶进行催化。
连接反应需要在适宜的温度和pH 条件下进行一定时间，以确保重组质粒的正确构建。
5.转化宿主细胞将连接反应得到的重组质粒转化到宿主细胞中。
常见的宿主细胞有细菌、酵母、昆虫等。
转化方法有多种，如电穿孔法、化学转化法等。
转化后需要在适宜的培养条件下进行培养，以获得大量的重组质粒。
6.克隆筛选克隆筛选是重组质粒构建的重要步骤之一。
通过克隆筛选，可以确定重组质粒是否正确构建。
常见的克隆筛选方法有蓝白斑筛选、酶切法等。
7.序列验证最后需要对重组质粒进行序列验证，以确保目的基因的正确插入和序列的准确性。
序列验证可以通过Sanger测序等方法进行。
实验目的1.学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能用限制性核酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。
2.学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。
3.学习利用T4 DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。
4.掌握利用Cacl2制备感受态细胞的方法。
5.学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。
6.学习并掌握使用红白菌落法筛选获得重组子以及α互补筛选法的原理及方法。
7.学习并掌握使用Omaga试剂盒抽提质粒的方法及进一步确定重组质粒中含有外源目的DNA片段。
实验原理：（一）限制性核酸内切酶的酶切反应体外构建重组DNA分子，首先要了解目的基因的酶切图谱，选用的限制性内切酶不能在目的基因内部有专一的识别位点，否则当用一种或两种限制性内切酶切割外源供体DNA时不能得到完整的目的基因。
其次要选择具有相应的单一酶切位点质粒或者噬菌体载体分子。
常用的酶切方法有双酶切法和单酶切法两种。
本实验采用单酶切法，即只用一种限制性内切酶切割目的DNA 片段，酶切后的片段两端将产生相同的黏性末端或平末端，再选用同样的限制性内切酶处理载体。
在构建重组子时，除了形成正常的重组子外，还可能出现目的DNA片段以相反方向插入载体分子中，或目的DNA串联后再插入载体分子中，甚至出现载体分子自连，重新环化的现象。
单酶切法简单易行，但是后期筛选工作比较复杂。
各种限制性内切酶都有其最佳反应条件，最主要的因素是反应温度和缓冲液的组成。
在双酶切体系中，如果两种酶对盐离子的浓度和温度要求一致，原则上可以将这两种酶同时加入一个反应体系中同步酶切；如果不一致，则酶切反应最好分步进行，常用的酶切顺序是：先低盐后高盐，先低温后高温。
酶切与连接是两个密切相关的步骤，要达到高效率的连接，必须酶切完全，酶切的DNA数量要适当。
重组表达质粒的构建——原核表达载体选择质粒载体是重组蛋白表达的关键工具，其结构如下图。
重组蛋白表达，我们首先要将基因插入到表达载体上，插入的位置为多克隆位点。
质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋白的表达都是至关重要的。
尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋白不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。
这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动子和融合标签的差异。
蛋白表达优化主要工作也就是尝试构建不同融合表达标签，使用不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。
常用的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。
福因德生物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。
1）促表达/促溶标签2）信标标签3）纯化标签我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋白怎么表达成功，更要考虑蛋白怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。
4）酶切位点以上为原核表达常用的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业网站或专业书籍已对此做详尽解释，科研工作者可根据具体实验设计方案，组合设计以上标签和酶切位点的使用。
特别值得注意的是，选用和设计蛋白酶切位点的时候首要考虑的是序列内部有没有蛋白酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋白酶试剂成本。
一般商业化载体，在标签蛋白与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。
标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签高效翻译起始位点带动插入蛋白的表达,可溶性标签的高效表达更可促进蛋白的可溶性表达;同时,大部分的蛋白内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。
在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引入了可与别的蛋白相互作用的序列或者蛋白酶切位点。
重组表达质粒的构建——基因的克隆长片段基因在大肠杆菌中表达往往比较困难，作为抗原使用的重组蛋白可以考虑选择抗原性好的区段原核表达，前文已作阐述。
对整个蛋白结构研究，必须全长表达该蛋白，此时最好考虑真核表达系统，特别是含有跨膜区的蛋白。
选定要克隆的区段，需先富集纯化之后才方便插入载体，常用的富集方法是PCR或者质粒繁殖复制。
为了防止在PCR扩增过程中引入碱基错误或者碱基缺失，PCR扩增基因时候必须使用高保真Taq酶。
为了满足科研工作者不同实验需求，福因德生物将高保真Taq酶优化为即用型Mix，使用时直接加引物和模板就可以扩增。
除此之外，福因德生物还开发出LA Taq、S-Taq Mix以及SYBR荧光定量PCR Mix(需要更高品质的可选用SYBR PCR SuperMix)。
原核重组表达常用克隆技术主要有以下几种：1）酶切连接这个是目前应用最为广泛的的克隆技术，主要优点是技术稳定；缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的成败。
如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，比如，批量克隆基因到某个载体上，可一次性大量双酶切将载体线性化后保存备用，每次构建载体只需酶切外源基因片段，载体可直接取用，不必每次都酶切，省时省力（此处需特别留意的是基因内部不能有与上述所用冲突的酶切位点）。
2）TA克隆TA克隆必须使用商业的线性化载体，线性载体3´末端有一个T碱基，与PCR扩增产物3´末端A正好匹配。
这种克隆策略最大的优点是载体使用方便，扩增产物可以直接克隆到载体上，不需要酶切位点等冗余序列；缺点是：必须依赖商业化载体，载体选择受限；扩增外源片段所使用的Taq酶也必须是可以在3´末端加A，这种Taq酶的保真度不高；外源片段插入之后还必须鉴定方向。
目前，这种构建表达载体的策略已经逐渐被淘汰。
3）TOPO克隆TOPO克隆载体利用DNA拓扑异构酶I识别序列中的CCCTT松弛双螺旋并重新连接，同时兼具限制性内切酶和连接酶的功能。
重组质粒构建流程导言在分子生物学研究中，质粒是一种重要的工具，可用于携带外源DNA，转导到靶细胞内进行表达或操纵基因。
在许多应用中，需要从头开始构建特定的质粒来满足实验需求。
本文将介绍重组质粒的构建流程，包括质粒设计、DNA片段的合成、连接和转化等步骤。
质粒设计重组质粒的构建首先需要进行质粒设计。
在设计过程中，需要考虑以下几个方面：质粒拓扑结构、宿主细胞、选择标记、启动子、终止子等。
其中，质粒拓扑结构是质粒构建的基础，可以选择环状质粒或线性质粒；宿主细胞是质粒的宿主细胞，需要考虑宿主细胞的特性和适用范围；选择标记是用于筛选携带外源DNA的宿主细胞，可以选择抗生素抗性标记、荧光蛋白标记等；启动子和终止子则是用于调控外源DNA的表达水平。
DNA片段的合成在质粒构建中，需要合成一系列DNA片段，包括载体骨架、选择标记、启动子、基因、终止子等。
DNA片段的合成可以通过多种方法进行，包括化学合成、PCR扩增、酶切和连接等。
在合成过程中，需要确保DNA片段的正确性和纯度，以保证后续的连接和转化效率。
连接连接是质粒构建的关键步骤，通过连接不同的DNA片段来构建目标质粒。
连接的方法包括酶切和连接、PCR扩增和连接、重组DNA技术等。
在连接过程中，需要确保连接效率和准确性，避免产生错误连接或杂交产物。
此外，对于大片段DNA的连接，还需要考虑连接的稳定性和转化效率。
质粒的放大和提取连接完成后，需要将质粒放大到足够的数量，并提取纯净的质粒DNA。
放大的方法可以选择细菌发酵、真菌发酵等，根据质粒的特性选择合适的宿主细胞进行放大。
质粒提取的方法包括碱裂解法、隐式裂解法等，确保提取的质粒DNA的纯度和完整性。
质粒的转化最后一步是将构建好的质粒转化到目标宿主细胞中，进行表达或操纵基因。
转化的方法可以选择化学转化、电转化、热激转化等，根据宿主细胞的特性和实验需求选择合适的转化方法。
在转化过程中，需要考虑转化效率、亲和性和表达水平等因素，确保转化的质粒可以稳定存在和表达。
质粒重组实验报告质粒重组实验报告引言：质粒重组是一种重要的实验技术，可以将外源基因导入到宿主细胞中，用于研究基因功能、蛋白质表达等方面。
本实验旨在通过质粒重组技术，将外源基因成功导入到大肠杆菌中，并通过酶切、连接、转化等步骤验证重组质粒的构建。
材料与方法：1. 外源基因：选择了编码了绿色荧光蛋白（GFP）的质粒pGFP。
2. 宿主细胞：采用大肠杆菌作为宿主细胞。
3. 酶切酶：使用限制酶EcoRI和BamHI进行酶切反应。
4. 连接酶：使用T4 DNA连接酶进行连接反应。
5. 培养基：含有抗生素的LB培养基。
实验步骤：1. 酶切反应：将pGFP质粒和EcoRI、BamHI酶切酶按照指定条件进行酶切反应，以得到线性化的质粒和目标基因片段。
2. 连接反应：将线性化的质粒和目标基因片段加入连接酶缓冲液中，按照指定条件进行连接反应，形成重组质粒。
3. 转化：将重组质粒加入含有大肠杆菌的培养基中，通过热激转化法使质粒进入细胞。
4. 筛选：将转化后的细胞均匀涂布在含有抗生素的LB平板上，筛选出含有重组质粒的菌落。
5. 验证：通过PCR、酶切等方法对筛选出的菌落进行验证，确认质粒重组成功。
结果与讨论：经过酶切、连接、转化等步骤，成功构建了质粒重组实验系统。
在LB平板上筛选出了多个抗生素耐受的菌落，表明转化成功。
通过PCR验证，检测到了目标基因片段的特异扩增带，证明重组质粒中成功导入了外源基因。
进一步进行酶切验证，发现重组质粒经过连接反应后，酶切位点发生改变，与未连接的质粒有明显差异。
这些结果表明，质粒重组实验成功构建了重组质粒，并将外源基因导入到大肠杆菌中。
质粒重组实验的成功对于基因功能研究和蛋白质表达具有重要意义。
通过重组质粒，可以将外源基因导入到宿主细胞中，进而研究其在生物体内的功能和表达情况。
例如，可以通过重组质粒实现基因敲除、基因表达调控等功能，从而深入了解基因在生物体内的作用机制。
同时，重组质粒还可以用于蛋白质表达，通过外源基因的转录和翻译，使宿主细胞产生目标蛋白质，用于研究其结构、功能等方面。
重组表达质粒的构建重组表达质粒的构建1．原核表达载体选择质粒载体是重组蛋⽩表达的关键⼯具，其结构如下图。
重组蛋⽩表达，我们⾸先要将基因插⼊到表达载体上，插⼊的位置为多克隆位点。
质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋⽩的表达都是⾄关重要的。
尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋⽩不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。
这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动⼦和融合标签的差异。
蛋⽩表达优化主要⼯作也就是尝试构建不同融合表达标签，使⽤不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。
常⽤的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。
福因德⽣物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。
我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋⽩怎么表达成功，更要考虑蛋⽩怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。
以上为原核表达常⽤的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业⽹站或专业书籍已对此做详尽解释，科研⼯作者可根据具体实验设计⽅案，组合设计以上标签和酶切位点的使⽤。
特别值得注意的是，选⽤和设计蛋⽩酶切位点的时候⾸要考虑的是序列内部有没有蛋⽩酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋⽩酶试剂成本。
⼀般商业化载体，在标签蛋⽩与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。
标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签⾼效翻译起始位点带动插⼊蛋⽩的表达,可溶性标签的⾼效表达更可促进蛋⽩的可溶性表达;同时,⼤部分的蛋⽩内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。
在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引⼊了可与别的蛋⽩相互作⽤的序列或者蛋⽩酶切位点。
重组质粒的构建实验流程—质粒构建实验操作一、LB培养基配置LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。
其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子，NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。
【试剂】胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、NaCl、琼脂（Agar）【实验步骤】1、LB固体培养基配方（配置100ml培养基）胰蛋白胨（Tryptone） 1g酵母提取物（Yeast Extract）0.5gNaCl 1g琼脂（Agar）1.5g单蒸水100ml蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药品，瓶盖也不要盖错。
2、液体培养基除不加琼脂外，其余同固体培养基一样。
3、包扎用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
4、灭菌将上述培养基以1.05kg/cm2、121.3℃、20min高压蒸汽灭菌。
如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4℃冰箱内暂存。
灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。
5、LB固体培养基倒板○1配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。
○2抗生素的加入：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培养基温度降至55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
○3倒板：一般10ml倒1个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10—15min。
○4保存:将培养皿倒置放于4℃保存，一个月内使用。
二、质粒的提取（protocol）1、大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至5ml的含有抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。
【注：培养液不宜过量，过量时会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。
】2、5ml菌液倒入5ml离心管中，10,000xg，1min离心，弃上清。
重组质粒的构建实验流程—质粒构建基因提取—1、2、3基因提取—1、2、3PCR反应扩增目的基因—4、3PCR反应扩增目的基因—4、3DNA片段回收—5、3DNA片段回收—5、3重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5重组质粒检测：（1）PCR (2)双酶切—8、5测序测序重组质粒提取—2、 3重组质粒提取—2、 3菌种保藏—7菌种保藏—7目的片段与载体连接及转化—6目的片段与载体连接及转化—6实验操作1、 LB培养基配置LB培养基用于一般细菌培养，特别用于分子生物学试验中大肠杆菌的保存和培养。
其中蛋白胨、酵母膏粉提供氮源、维生素和生长因子，NaCl维持均衡的渗透压，葡萄糖提供碳源，琼脂是培养基的凝固剂。
【试剂】胰蛋白胨（Tryptone）、酵母提取物（Yeast Extract）、NaCl、琼脂（Agar）【实验步骤】1、 LB固体培养基配方（配置100ml培养基）胰蛋白胨（Tryptone） 1g酵母提取物（Yeast Extract） 0.5gNaCl 1g琼脂（Agar） 1.5g单蒸水 100ml蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速，另外，称药品时严防药品混杂，一把药匙用于一种药品、或在称取一种药品后，洗净、擦干，再称取另一种药品，瓶盖也不要盖错。
2、液体培养基除不加琼脂外，其余同固体培养基一样。
3、包扎用报纸封住瓶口，再用皮筋捆扎好，用记号笔注明培养基名称、组别、日期。
4、灭菌将上述培养基以1.05kg/cm2、121.3℃、20min高压蒸汽灭菌。
如因特殊情况不能及时灭菌，则应放入4℃冰箱内暂存。
灭菌后，将锥形瓶放入烘箱烘干，烘干后，4℃保存。
5、 LB固体培养基倒板配置：如上述配方配置100ml的LB固体培养基。
抗生素的加入：将凝固的培养基放入微波炉内加热至完全融化，然后置于55℃的水浴中，待培养基温度降至55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。
倒板：一般10ml倒1个板子，培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10—15min。
保存:将培养皿倒置放于4℃保存，一个月内使用。
二、质粒的提取（protocol）1、大肠杆菌的培养：从平板培养基上挑选单菌落接种至5ml的含有抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养。
【注：培养液不宜过量，过量时会因菌量太大而溶菌不充分，纯化时会影响质粒的纯度。
】2、5ml菌液倒入5ml离心管中，10,000xg，1min离心，弃上清。
（实验室用的离心机转速达不到，故将其调到最大转速12,000rmp，离心2min）【注：rmp（转速）与rcf= ×g（相对离心力）,RPM只是一个习惯用法，g才是衡量转速的通用标准：不同的转子，RPM是不能通用的，g值则是通用的，也就是说，只要你在不同的离心机上用相同的g，他们的离心效果原则上是一样。
】3、加入250ul SolutionⅠ（使用前加入RNase A1，冰箱4℃冷藏），充分悬浮细菌沉淀。
【注：注意不要残留细小菌块，可以使用振荡器Vortex 等剧烈震荡使菌体充分悬浮。
】4、加入250ul SolutionⅡ【裂解细胞】（提前放入37℃孵育箱内预热）轻轻地上下翻转混合5—6次，使菌体充分裂解，形成透明溶液。
【注：此步骤不宜超过5min】5、加入350ul SolutionⅢ【变性蛋白】，轻轻上下翻转混合5—6次，直至形成紧实凝集块。
6、将上面液体倒入1.5ml的EP管中，13,000xg，10min离心。
7、将上述离心得到的液体倒入柱内，10,000xg，1min离心，弃液体。
8、加入500ul bufferHB，10,000xg，1min离心，弃液体。
9、加入700ul DNA wash buffer（提前加入指定体积的100%乙醇），10,000xg，1min离心，弃液体。
（重复一次）10、空离，13,000xg，2min离心。
11、将离心柱放入1.5mlEP管内，置于孵育箱内3min烘干。
12、加入60ul ddH2O（提前在60℃水浴箱内预热），60℃摇2min。
13、13,000xg，1min离心，得液体。
14、测浓度。
15、DNA经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
【注：提好的质粒需标明时间、名称等，-20℃保存。
】3ul 质粒（DNA ） 10xLoadingBuffer 1xTAE 3ul 1ul 6ul 6ul 质粒（DNA ） 10xLoadingBuffer 20ul 2.2ul三、琼脂糖凝胶电泳【试剂】琼脂糖（Agarose ），1xTAE 电泳缓冲液，染料（SyBR Safe DNA Gel Stain ）,DL2000 DNA Marker, 10xLoading Buffer【实验步骤】1、配置50ml （大样）、25ml （小样），1.5%的琼脂糖凝胶。
称取50x1.5%=0.75g 琼脂糖粉末于锥形瓶中，加入50ml 1xTAE 缓冲液，染料2ul （边加染料边倒TAE 缓冲液于装有琼脂糖的锥形瓶中），封口。
2、放在微波炉中加热，沸腾2次，直到看不到油滴，形成均一的溶液。
（一般中低档，5min ）3、插入梳子，倒入制胶槽中。
4、放在抽屉里室温、避光静置20min 。
5、按下表加样。
适用于检测DNA （小孔）：Marker （DL2000） 样品适合回收DNA(大孔)Marker （DL2000） 样品6、120V ，电泳25min 左右。
7、检测：将凝胶板放入检测仪中检测。
新建→选染料（SyBR safe ）→选颜色（SyBR Green ）→勾除高亮选项→检测→文本注释(字体14，颜色白色)→保存（酶切后的质粒会出现两条色带，上面的一条是载体较暗，下面的一条是目的质粒较亮，根据Marker显示，证明是否是所需质粒）【注】1、当加入浓度的样品量小于5ul时，10xLoadingBuffer均加1ul。
2、电泳的加样空宽度小于6mm时，每次取5ul制品电泳便可得到清晰条带，如果加样空增宽，需适当增加Marker制品的加样量。
3、对DNA电泳而言，琼脂糖的纯度对DNA条带的清晰度影响很大。
4、进行琼脂糖凝胶电泳时，琼脂糖的浓度与DNA片段的分离性能关系密切。
琼脂糖的浓度越大，对短片段的分离性能越好，反之，琼脂糖浓度越小，越有利于长片段DNA的分离。
5、当电泳后片段需回收时，选用大孔胶，当电泳只起检测作用时，选用小孔胶。
6、若电泳产物需要回收，则需换新的缓冲液。
7、实验室有两种常用的Marker分别为DL2000 DNA Marker和λ-EcoT14 digest DNA Marker。
琼脂糖电泳图像示意图如下：四、PCR【试剂】灭菌水、10xbuffer、混合的寡核苷酸（dNTPS）、引物（上、下）Taq DNA聚合酶、模板DNA（质粒）【操作步骤】加样前应先打开PCR仪预热。
1、在0.5mlPCR管中加入依次下列试剂：25ul体系（EGFP扩增）：灭菌水： 9.5ulLA混合物： 12.5上引物： 1ul下引物： 1ul模板DNA（PCDHA）： 1ul总体积： 25.0ul2、将上述PCR反应混合物放入PCR仪中。
3、设定程序进行扩增：94℃变性5min后，开始以下循环94℃变性-----------------------------------------30s55℃退火（退火温度不固定，根据引物进行调整）-----1min72℃延伸-----30s（延伸时间根据目的片段的长度进行调整）共30个循环最后循环结束后72℃反应7min，4℃冷却。
4、PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳进行检测。
【注】1、当PCR反应后的产物目的片段还需要进行后续操作时，选用LA Taq 酶；当PCR反应用于检测时选用EX Taq酶。
2、buffer的选择应与酶的选择相对应，例如：LA Taq酶对应的buffer为10xLA PCR Buffer。
3、在PCR小管中加样时，应先将各试剂加到管壁上，最后混匀。
这样既节省时间，又节省枪头。
五、PCR产物的回收纯化1、将PCR产物稍微离心片刻。
2、将PCR扩增产物转移至1.5ml EP管中，然后加入4-5倍体积的Buffer CP,若PCR产物<200bp则加入6倍体积的Buffer CP。
3、充分振荡混合。
4、然后转移至DNA离心柱中，10,000xg离心1min，倒回重复一次，弃液体。
5、加入700ul的DNA Wash Buffer，10,000xg离心1min ，弃液体。
6、空离，13,000xg，2min离心。
7、将离心柱放入1.5mlEP管内，吹风吹干。
8、加入15-30ul ddH2O（提前在60℃水浴箱内预热），60℃摇2min。
9、13,000xg，1min离心，得液体。
六、与T载体连接10ul体系2xRapid Ligation Buffer，T4 DNA Ligase 5ulPGEM-T Easy Vector（50ng） 1ulPCR product（150ng） 150/C ulT4 DNA Ligase 1ulWater 3-150/C ul总体系 10ul放入4℃冰箱内过夜。
七、DNA片段的回收纯化【实验步骤】1、实验前将水浴锅调到55℃-60℃，将灭菌水60℃水浴锅内预热。
2、使用TAE缓冲液制作琼脂糖凝胶，然后对目的DNA进行琼脂糖凝胶电泳。
3、在紫外灯下切出还有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶表面的液体。
此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶，尽量减小凝胶体积，提高DNA的回收率。
（注：切胶时请注意不要将DNA长时间暴露于紫外灯下，以防DNA损伤，先切后验证。
）4、切碎胶块。
5、向胶块中加入胶块融化液Binding buffer 500ul。
6、均匀混合后55℃-60℃加热融化胶块7min，此时应间断振荡混合。
（注：胶块一定要充分融化，否则将会影响DNA的回收率。
）7、将上述胶块融化液倒入柱子内，10,000xg 1min离心，倒回，重复一次。
8、加入300ul Binding buffer，10,000xg 1min离心，弃滤液。
9、加入700ul DNA wash buffer，10,000xg 1min离心，弃滤液。
10、空离，13,000xg，2min离心。
11、将离心柱放入1.5mlEP管内，吹风吹干。
12、加入30ul ddH2O（提前在60℃水浴箱内预热），60℃摇2min。
13、13,000xg，1min离心，得液体。
八、目的片段与载体的连接及转化【试剂】PMD-18载体、目的片段、SolutionⅠ、感受态细胞、LB液体培养基（加氨苄青霉素抗体AMP）、含AMP的LB固体培养基【实验步骤】1、连接、实验前水浴准备。
