重组质粒的构建经验 [技巧]

同源重组构建质粒原理及方法一、引言同源重组构建质粒是基因工程领域的关键技术，它通过将外源基因片段与适当的质粒DNA相连接，实现外源基因的表达和遗传转移。

本文将详细介绍同源重组构建质粒的原理和方法，以及常用的实验步骤和注意事项。

二、原理同源重组构建质粒的原理是通过内切酶在两个同源DNA片段上切割，然后连接起来形成一个新的质粒DNA。

同源DNA片段通常由外源基因和质粒DNA提供，通过互补的粘性末端序列将它们连接起来。

三、方法以下是同源重组构建质粒常用的方法和步骤：1. 选择合适的质粒和酶切位点首先，需要选择一个适合的质粒，根据实验需要选择带有合适酶切位点的质粒。

同时，还需要选择适合的内切酶用于切割质粒和外源基因片段。

2. 切割质粒和外源基因片段将选择好的质粒和外源基因片段与相应的内切酶一起反应，将其切割为互补的粘性末端序列。

切割后的质粒和外源基因片段会留下粘性末端。

3. 进行连接反应将切割好的质粒和外源基因片段加入连接反应中，可以使用DNA连接酶来催化连接。

4. 转化宿主细胞将连接好的质粒转化到宿主细胞中，常用的方法有热擦法、电穿孔法和化学法等。

宿主细胞可以是大肠杆菌等常用的实验宿主细胞。

5. 筛选转化子将转化到宿主细胞中的质粒进行筛选，可以通过选择性培养基或进行基因标记（如荧光蛋白等）来筛选转化子。

四、注意事项在同源重组构建质粒过程中，需要注意以下事项：1. 同源重组效率同源重组的效率是影响质粒构建成功率的关键因素。

需要合理选择酶切位点，确保质粒和外源基因片段有足够的同源性。

2. DNA连接酶的选择DNA连接酶的选择也是非常重要的。

不同的DNA连接酶在连接效率和酶切位点的要求上有所区别，选择适合的连接酶能提高连接效率。

3. 转化宿主细胞选择转化宿主细胞的选择也会影响质粒构建的成功率。

不同的宿主细胞对质粒的转化效率和表达能力有所不同，需要根据实验要求选择合适的宿主细胞。

4. 合理设计实验对照组为确保实验结果的可靠性和准确性，需要设计适当的对照组，验证质粒构建的成功性和外源基因的表达情况。

重组质粒的构建重组质粒的构建是基因工程的核心步骤之一，其目的是将目的基因插入到质粒载体中，以实现目的基因的稳定表达和克隆化。

以下是重组质粒构建的主要步骤：1.目的基因获取首先需要获取目的基因。

目的基因可以从基因文库、PCR、基因组测序等方法中获取。

根据需要选择合适的方法，将目的基因克隆到质粒载体中。

2.载体质粒选择选择适合的质粒载体是重组质粒构建的关键步骤之一。

根据目的基因的特点和表达要求，选择适合的质粒载体。

常见的质粒载体有pET、pUC、pBluescript等。

3.限制性酶切限制性酶切是重组质粒构建的重要步骤之一。

通过限制性酶切，将目的基因和质粒载体分别切开，露出粘性末端，以便于连接反应。

4.连接反应将切好的目的基因和质粒载体的粘性末端连接在一起，形成重组质粒。

连接反应需要使用T4DNA连接酶或其它连接酶进行催化。

连接反应需要在适宜的温度和pH 条件下进行一定时间，以确保重组质粒的正确构建。

5.转化宿主细胞将连接反应得到的重组质粒转化到宿主细胞中。

常见的宿主细胞有细菌、酵母、昆虫等。

转化方法有多种，如电穿孔法、化学转化法等。

转化后需要在适宜的培养条件下进行培养，以获得大量的重组质粒。

6.克隆筛选克隆筛选是重组质粒构建的重要步骤之一。

通过克隆筛选，可以确定重组质粒是否正确构建。

常见的克隆筛选方法有蓝白斑筛选、酶切法等。

7.序列验证最后需要对重组质粒进行序列验证，以确保目的基因的正确插入和序列的准确性。

序列验证可以通过Sanger测序等方法进行。

构建重组质粒基本方法1.cDNA编码区片段的PCR扩增50ul ×2模版 15‘引物 13‘引物 1dNTP 110×buffer 5Taq 1Milliq H2O 402．PCR产物纯化1、加5倍体积的PB2、将Spin柱放于2ml收集管上3、加样液，14Krpm，离心1min4、弃去排出液5、加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min6、弃去排出液,14Krpm,离心1min7、将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中O),静置2min, 14Krpm，8、往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq H2离心1min3．双酶切载体和PCR产物分别用一下条件进行双酶切（反应体系均为30ul，37℃，酶切n4．双酶切后的载体用试剂盒割胶回收1.割胶并称重，加3倍体积的QG（胶块每100mg约合100μl的体积）2.50℃，恒温10min，等到胶完全被溶解3.将一个Spin柱放在一个2ml的收集管中4.加样液，14Krpm，离心1min5.弃去排出液6.加0.75ml PE, 14Krpm，离心1min7.弃去排出液,14Krpm,离心1min8.将Spin柱放在洁净1.5ml的Epp管中9.往Spin柱的膜中央加入50μl的EB(或milliq HO),静置2min, 14Krpm，2离心1min5．连接上述双酶切产物经过纯化（其中载体酶切产物割胶回收，PCR片段酶切后纯化步骤与上述PCR产物纯化步骤相同），在T4 DNA连接酶作用下16℃连接过夜。

连接体系如下：载体 2ulPCR 片段 6ul10xT4 buffer 1ulT4 DNA ligase 1ul6．转化取上述连接液5μl转化到预先制备的DH5α化学感受态细胞中，冰浴30分钟，42℃热激2min,置冰上5min，加入1mlLB培养液37℃摇床45min，离心5000rpm，1-5min（不要离心太久，以免太实），最后均匀涂布在含有100 ng/ml 抗生素的LB平板上（100-150 ul）。

重组质粒构建注意事项重组质粒构建是现代生物学中常用的技术手段，其能够利用DNA重组技术将感兴趣的基因片段插入到质粒中，从而探究基因的功能、调控及其在生物体中的作用。

下面是重组质粒构建中需要注意的一些关键问题。

1.选择合适的质粒载体：质粒是一种能够自主复制的小型DNA分子，其可以含有多个对基因表达有重要影响的元件，如启动子、终止子、选择性标记基因等。

因此，选择合适的质粒载体对于重组质粒构建至关重要。

一般而言，常用的质粒载体有pUC19、pBR322、pBluescript等，根据实验需要选择适合的质粒载体。

2.选择合适的限制性内切酶：限制性内切酶是能够识别特定的DNA序列并具有切割作用的酶。

在重组质粒构建中，常需要利用限制性内切酶切割质粒载体和目标基因片段的DNA，从而产生互补的粘性末端，便于二者连接。

因此，选择适合的限制性内切酶对于重组质粒的构建是非常重要的。

3.设计合适的引物：引物是在PCR扩增反应中用于识别目标DNA序列的短小DNA片段。

在重组质粒构建中，利用引物扩增目标基因片段是必不可少的步骤。

因此，设计合适的引物非常重要。

引物应具有良好的特异性，能够特异性地扩增目标基因片段，并且不会与质粒载体序列发生非特异性扩增。

此外，引物还可以设计一些限制性内切酶切割位点，以便于后续的连接工作。

4.进行寡核苷酸连接反应：连接反应是指将质粒载体和目标基因片段进行连接的步骤。

常用的方法有T4 DNA连接酶的连接反应和PCR引物连接法。

在连接反应中，需要注意合适的反应条件，例如连接反应的时间、反应体系的pH值、温度等，对连接效果有重要影响。

5.转化宿主细胞：转化是指将重组质粒导入宿主细胞中。

在进行转化实验时，需要注意选择合适的宿主细胞，例如大肠杆菌（E. coli）等，以及适当的培养基、适宜的温度和容器。

此外，还需要注意进行适当的筛选压力，如在含有选择性抗生素的培养基中进行培养，筛选能够稳定带有重组质粒的转化子。

两大方法帮你搞定质粒构建质粒构建是分子生物学研究中最常用的实验技术。

原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA 连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体 DNA 进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。

质粒构建方式多样，常规的 T4 连接酶，以及最近更受欢迎的重组酶方式。

下面小编就总结一下 T4 连接酶与重组酶构建质粒方法，通过比较，其最大的不同点可能在于目的基因的设计以及连接体系。

壹一. T4 DNA Ligase 即 T4 DNA 连接酶，可以催化粘端或平端双链 DNA 或 RNA 的5’-P 末端和3’-OH 末端之间以磷酸二酯键结合，该催化反应需 ATP 作为辅助因子。

1. 质粒载体的制备既可以选择单酶切也可以选择双酶切，一般推荐使用双酶切。

其实目的就只有一个，尽量使载体的末端具有特异性，防止自连。

[可选酶切体系]VECTOR 3 ugCutSmart Buffer 5 ul限制性内切酶 1 1 ul限制性内切酶 2 1 ul酶切体系一般选择 50ul，试剂加好之后37°C 孵育 6~8 小时，或适当延长时间，保证质粒酶切完全。

每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。

酶切后载体通过切胶回收线性化载体。

2.根据目的序列构建引物后，引物设计原则简单总结一下:（1）前向引物：5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶 1 酶切位点序列+基因正向引物序列 -3’ 端（2）反向引物：5’ 端-保护碱基序列+限制性内切酶 2 酶切位点序列+基因反向引物序列 -3 ’端如果目的基因片段较长的话，可以选择 PCR 方式扩增目的基因片段[可选 PCR 扩增体系]ddH2O：14ul10xTaq buffer：2ul10um DNTP：1ul10um primer F：0.5ul10um primer R：0.5ul模板 DNA：1ulTaq 酶：1ul[可选 PCR 扩增条件](1)95℃：5min(2) 35cycle95℃：30s55℃：30s（退火温度可以根据目的引物TM值决定，一般退火温度根据引物TM值降低5度）72℃：40s(3)72℃：10min(4)16℃：hold引物扩增之后，首先要进行琼脂糖凝胶电泳验证条带大小，然后通过胶回收，获得纯化目的片段产物.由于加入保护碱基，回收产物需要进行双酶切，双酶切方法与质粒酶切方法相同。

构建重组质粒基本方法重组质粒是一种重要的遗传工程工具，用于将外源基因导入到宿主细胞中，从而实现特定基因的表达与功能研究。

构建重组质粒的基本方法可以概括为：选择质粒骨架、引物设计与合成、PCR扩增外源基因片段、DNA连接与重组、质粒扩增与提取、质粒鉴定与筛选，以下分别进行详细介绍。

一、选择质粒骨架在构建重组质粒时，首先需要选择一个合适的质粒骨架。

质粒骨架是指一个可复制的质粒DNA分子，常见的质粒骨架有pUC、pBR322、pET等。

质粒骨架上通常包含有宿主细胞可以识别的起始子和起始子附近的终止子，用于启动和终止转录过程，同时还包含选择标记基因，如抗生素抗性基因，以及其他在分子克隆中常用的诸如多克隆位点、限制酶切位点等。

二、引物设计与合成在构建重组质粒时，需要利用引物来扩增并克隆外源基因片段。

引物一般是两条DNA可控引物，其中一条是正向引物，另一条是反向引物。

引物的设计需要注意以下几点：引物的长度通常为15-30个碱基对，引物应该具有合适的Tm值，并且在引物双链的末端至少有2个碱基对是纯G或纯C。

引物可以使用商业引物合成公司合成。

三、PCR扩增外源基因片段使用引物扩增外源基因片段是构建重组质粒的一个关键步骤。

PCR反应一般包括DNA模板、引物、dNTPs和DNA聚合酶。

根据需要，可以使用特异性引物对目标基因进行PCR扩增，然后通过凝胶电泳检查PCR产物长度和纯度，并使用PCR产物进行下一步处理。

四、DNA连接与重组将PCR扩增得到的外源基因片段与质粒骨架进行连接和重组。

连接通常通过使用限制酶切和连接酶来实现。

限制酶切是利用限制酶切剪切DNA，生成具有互补粘性末端的DNA片段，然后将外源基因片段与质粒骨架进行连接。

连接酶可以使DNA片段之间的末端骨架参与phosphodiester结合反应，从而形成连体分子。

五、质粒扩增与提取将重组质粒转化到宿主细胞中，通过培养和培养基筛选来扩增质粒。

质粒扩增一般在含有抗生素的琼脂糖平板上进行，抗生素可以选择对宿主细胞有毒作用但不对重组质粒有毒的抗生素。

原核表达重组质粒pUC57-CTP-PTEN的构建及鉴定
质粒是一种常见的DNA分子，在分子生物学研究中被广泛应用。

本文旨在介绍如何构建和鉴定一种基于原核表达重组质粒pUC57-CTP-PTEN。

1. 构建方法
该质粒的构建主要包含四个步骤：
1）设计引物。

设计包含目标肽段的引物用于PCR扩增。

2）PCR扩增。

使用目标肽段的DNA模板，利用引物进行PCR扩增，生成包含目标肽段的DNA片段。

3）连接。

将PCR扩增产物与pUC57-CTP质粒进行连接，得到重组质粒pUC57-CTP-PTEN。

4）转化。

使用化学方法将重组质粒转化到大肠杆菌中。

2. 鉴定方法
接下来需要对重组质粒进行鉴定，主要包括以下几个方面：
1）限制性内切酶切割。

使用限制性内切酶对重组质粒进行酶切，验证重组质粒的存在。

2）PCR鉴定。

利用引物对重组质粒进行PCR扩增，验证重组质粒中是否包含目标肽段。

3）测序验证。

将重组质粒进行测序，验证其序列与设计的目标序列是否一致。

4）原核表达验证。

利用质粒进行原核表达，检验目标肽段是否得到表达。

以上鉴定结果均符合预期，表明成功构建了基于原核表达重组质粒pUC57-CTP-PTEN。

该质粒在分子生物学以及其他领域中具有较广泛的应用前景。

重组表达质粒的构建重组表达质粒的构建1．原核表达载体选择质粒载体是重组蛋⽩表达的关键⼯具，其结构如下图。

重组蛋⽩表达，我们⾸先要将基因插⼊到表达载体上，插⼊的位置为多克隆位点。

质粒载体上有很多的功能元件，这些元件对于蛋⽩的表达都是⾄关重要的。

尽管我们经过系统的分析和预测，但是仍有很多蛋⽩不能顺利表达、表达量很低或者表达状态不好。

这个时候我们需要尝试构建不同的表达载体以期得到最好的效果，这些载体的主要区别是启动⼦和融合标签的差异。

蛋⽩表达优化主要⼯作也就是尝试构建不同融合表达标签，使⽤不同的宿主表达菌，测试不同的表达条件，筛选出最优表达体系。

常⽤的融合标签有GST、MBP、Trx、6His、SUMO等，这些标签主要功能是促表达、促可溶、信号标记或助纯化。

福因德⽣物可以提供以下系列载体以供科研表达研究。

我们选择表达载体的时候不但要考虑蛋⽩怎么表达成功，更要考虑蛋⽩怎么纯化出来，纯化的问题主要是考虑纯化标签和酶切位点的选择，下表我们列举了常见的纯化标签和酶切位点。

以上为原核表达常⽤的标签和酶切位点,其性质也都作了简要的介绍，各专业⽹站或专业书籍已对此做详尽解释，科研⼯作者可根据具体实验设计⽅案，组合设计以上标签和酶切位点的使⽤。

特别值得注意的是，选⽤和设计蛋⽩酶切位点的时候⾸要考虑的是序列内部有没有蛋⽩酶位点，同时要考虑酶切的效率和蛋⽩酶试剂成本。

⼀般商业化载体，在标签蛋⽩与载体多克隆位点之间都设计有酶切位点。

标签可设计在N-端也可在C-端,设计在N-端的优势是,可通过标签⾼效翻译起始位点带动插⼊蛋⽩的表达,可溶性标签的⾼效表达更可促进蛋⽩的可溶性表达;同时,⼤部分的蛋⽩内切酶的切割位点在C-端,所以标签设计在N-端可将标签切割完全。

在设计标签序列与酶切位点的时候还要考虑N-端稳定性原则，也就是所谓宿主细胞的N-端规则（N-end rule）,这个要避免；同时，还应该检查是否引⼊了可与别的蛋⽩相互作⽤的序列或者蛋⽩酶切位点。

重组质粒的构建[实验原理]外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。

重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。

DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。

两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有—种大肠杆菌连接酶没有的特性，即能使两个平末端的双链DNA分子连接起来。

但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。

T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶—AMP复合物；然后，酶—AMP复合物再结合到具有5’磷酸基和3’羟基切口的DNA上，使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。

DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法，为了防止载体本身的自连，可以通过(牛小肠碱性磷酸酶)CIP处理克服。

连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性。

但是在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。

因此人们找到了一个折中温度，即12-16℃，连接12-16h(过夜)，这样既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。

[仪器、材料与试剂]恒温摇床、紫外线透射仪、移液枪、pH计、电泳槽、T4DNA连接酶、T 4DNA连接酶缓冲液、载体、目的DNA片段[实验步骤]1、在微型离心管中混合以下试剂：试剂体积（uL）目的DNA 4载体分子1T4DNA连接酶及缓冲液52、混合液于16℃保温2-4h或过夜，取2uL做电泳检查，鉴定反应连接产物，做完DNA重组后，暂放冰箱保存，迅速做转化实验。