腐烂茎线虫不同地理种群ITS区序列比对及系统发育
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基于rDNA-ITS序列的天门冬拟茎点霉与相似种的系统发育关系卢松茂;陈振东;林秀香;郑少缘;余智城【摘要】芦笋茎枯病由天门冬拟茎点霉(Phomopsis asparagi)引起,为明确P.asparagi与寄生在其他蔬菜、水果和经济林木等植物上的拟茎点霉不同种之间的系统发育关系,对分离至福建漳州的P.asparagi菌株及从GenBank 下载的相关菌株的35条ITS序列进行多序列比对分析,并用Neighbor-Joining法构建系统发育树.系统发育分析结果显示:35个菌株被划分为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组群;P.asparagi与葡萄拟茎点霉(P.viticola)、叶下朱生拟茎点霉(P.phyllanthicola)、杨桃拟茎点霉(P.averrhoae)、大豆茎溃疡病菌(Diaporthe phaseolorum)聚在Ⅰ组群的A亚群,它们的系统学关系最近;大豆拟茎点霉(P.longicolla)、大豆间座壳菌(Diaporthe sojae)、褐纹拟茎点霉(P.vexans)、光叶子花拟茎点霉(P.glabrae)、柑橘间座壳菌(Diaporthe citri)、黄瓜间座壳菌(Diaporthe sclerotioides)聚在Ⅱ组群,它们与P.aspargi的系统学关系较远;昏暗拟茎点霉(P.obscurans)单独聚在最远的分支上(Ⅲ组群),其与P.aspargi的系统学关系最远.【期刊名称】《江苏农业学报》【年(卷),期】2015(031)001【总页数】6页(P62-67)【关键词】天门冬拟茎点霉;拟茎点霉属;核糖体DNA内转录间隔区;分子系统学【作者】卢松茂;陈振东;林秀香;郑少缘;余智城【作者单位】福建省热带作物科学研究所,福建漳州363001;福建省热带作物科学研究所,福建漳州363001;福建省热带作物科学研究所,福建漳州363001;福建省热带作物科学研究所,福建漳州363001;福建省热带作物科学研究所,福建漳州363001【正文语种】中文【中图分类】S644.6芦笋(Asparagus officinalis L.)又名石刁柏,素有“蔬菜之王”的美称,富含多种氨基酸、蛋白质、维生素及人体所需的微量元素等[1]。
陕西省甘薯上马铃薯腐烂茎线虫的生物型鉴定及综合防控技术刘晨李英梅杨艺炜陈志杰(陕西省生物农业研究所,陕西西安715299)摘要马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)是危害甘薯的重要植物病原线虫,其发生有逐年加重的趋势。
通过形态学鉴定及分子生物学鉴定,确定危害陕西甘薯的马铃薯腐烂茎线虫生物型主要为A型,其1年发生8~10代,在27~28℃、20~24℃、6~10℃条件下,完成一个世代的时间分别为18d、20~26d和68d。
马铃薯腐烂茎线虫主要以卵、幼虫、成虫在薯块、土壤、粪肥中越冬,种薯和种苗是其主要传播途径。
本文提出了严格进行种薯检测、建立无病留种田和挑选健康种薯、温汤浸种、覆膜栽培、轮作倒茬、清洁田园、高剪苗、药剂防治等适宜陕西区域推广应用的综合防控技术,以期为减轻马铃薯腐烂茎线虫对甘薯的危害提供参考。
关键词马铃薯腐烂茎线虫;甘薯;生物型;发生规律;综合防控技术;陕西省中图分类号S433.89文献标识码A文章编号1007-5739(2023)09-0109-04DOI:10.3969/j.issn.1007-5739.2023.09.031开放科学(资源服务)标识码(OSID):Biological Type Identification and Integrated Control Technology of Ditylenchus destructoron Sweet Potato in Shaanxi ProvinceLIU Chen LI Yingmei YANG Yiwei CHEN Zhijie(Shaanxi Institute of Biological Agriculture,Xi'an Shaanxi715299)Abstract Ditylenchus destructor is an important plant pathogenic nematode to sweet potato,which has aggravated year by year.Through morphological identification and molecular biological identification,it was determined that Ditylen-chus destructor harming sweet potato in Shaanxi Province was mainly type A.It occurred8-10generations in a year. Under the condition of27-28℃,20-24℃and6-10℃,a generation was completed for18d,20-26d and68d, respectively.Ditylenchus destructor mainly overwintered in potato blocks,soil and manure as eggs,larvae and adults, and seed tuber and seedling were the main transmission routes.In this paper,the integrated prevention and control techniques suitable for popularization and application in Shaanxi region were put forward,such as strictly detecting of seed tubers,constructing disease-free field,selecting healthy seed tubers,soaking seeds in hot water,plastic film covering cultivation,crop rotating,cleaning the field,high seedling cutting,pesticide controlling,so as to provide a reference for decreasing the damage of sweet potato caused by Ditylenchus destructor.Keywords Ditylenchus destructor;sweet potato;biological type;regularity of outbreak;integrated control tech-nology;Shaanxi Province甘薯属旋花科番薯属,为蔓生性草本块茎植物,具有淀粉含量高、营养丰富、高产稳产、适应性强、抗逆性强、投入少且产出高的优点。
文章编号:1000-1573(2007)05-0079-05腐烂茎线虫不同地理种群IT S 区序列比对及系统发育王金成1, 季 镭2, 黄国明1, 杨秀丽1, 林茂松2(1.天津出入境检验检疫局,天津300456; 2.南京农业大学植病系,江苏南京210095)摘要:为弄清我国腐烂茎线虫(Ditylenchus destr uctor )不同地理种群IT S(I nternal transcr ibed spacer)区之间的碱基差异及系统发育关系,本研究通过网络软件Clustalw 1.83对腐烂茎线虫的核糖体I T S 区核酸序列进行了比对,结果发现腐烂茎线虫的8个种群中,DEll 、DEly 、DEAY987007三个种群(I 组)内部之间的碱基差异在1%以内,其它的5个种群(II 组)之间的差异为0~1%,而I 组与I I 组种群之间的差异达到了15%(根据IT S1+ 5.8s +IT S2序列)或20%(根据IT S1+IT S2序列)。
这说明我国腐烂茎线虫很可能是1个复合种。
根据IT S 区核酸序列构建的系统发育图同样显示,我国腐烂茎线虫的7个地理种群明显分为2个分支A 和B 。
关 键 词:腐烂茎线虫;鳞球茎茎线虫;食菌茎线虫;IT S(Inter nal transcribed spacer);系统发育关系中图分类号:S 435.621.2+9文献标识码:AAlignments of rDNA -ITS sequences and phylogeny of differentgeo populations of Ditylenchus destructor in ChinaWAN G Jin cheng 1,JI Lei 2,HU ANG Gu o ming 1,YAN G Xiu li 1,LIN Mao song 2(1.T ianjin Entr y-Exit Inspection and Quar antine Bureau,T ianjin 300456,China;2.Dept.of Plant P atholog y,N anjing A gricultural U niversity ,N anjing 210095,China)Abstract :The IT S sequences of 8populations of sw eet potato stem nematode,Ditylenchus destr uctor ,w ere analyzed.The pair-w ise divergences for IT S1+ITS2sequences and IT S1+5.8s +IT S2sequences of 3populations (group I),DEll,DEly and DEAY987007,are w ithin 1%.T he pair-w ise divergence w ithin other 5populations (group II),DEjl,DEsg ,DEws,DEw y,DEhblf,varied from 0~1%.However,the divergence betw een group I and group II is 15%for ITS1+5 8s+ITS2sequences or 20%for ITS1+IT S2sequences.T he MP analysis divided the 8above-mentioned populations into tw o clades.The clade B includes DEll,DEly and DEAY987007(group I),and the other 5populations in group II belong to clade A.Key words:Ditylenchus destr uctor ; D.dip saci; D.myceliop hagus;ITS (Internal Transcribed Spacer);phy logenetic relationships收稿日期:2006-11-10基金项目:天津自然科学基金资助项目(05YF JM JC10800)作者简介:王金成(1978-),男,山东潍坊人,硕士,农艺师,主要从事植物线虫方面的研究.E mail:goldcit ywang @yahoo.通讯作者:林茂松(1948-),男,江苏徐州人,博士,教授,主要从事植物线虫方面的研究.E mail:linms@第30卷第5期2007年9月河北农业大学学报JOURNAL OF AGRICULT URAL UNIVERSIT Y OF H EBE IVol.30No.5Sep .2007腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)为农业上重要病原线虫,也是我国重要的植物检疫性有害生物。
定西地区腐烂茎线虫群体多样性及室内毒力测定定西地区腐烂茎线虫群体多样性及室内毒力测定引言:线虫是一类广泛存在于土壤中并且对农作物产生重大损害的微小动物,它们通过寄生在植物的根系中摄取养分,导致植物生长发育异常甚至死亡。
腐烂茎线虫属于线虫中的一种重要类群,广泛分布于全球各地的农田和园艺作物中,对农作物的生长和发育造成了严重的危害。
因此,研究腐烂茎线虫的群体多样性和其对植物的毒力具有重要的科学和实践意义。
一、腐烂茎线虫的分类及生态特征腐烂茎线虫属于线虫纲根结线虫科茎线虫亚科,其形态特征主要表现为身体细长、线形,体表有细长的纵棘,雌雄同体。
腐烂茎线虫通常以卵粒的形式存在于土壤中,成熟后通过二次侵染寄主植物的根系,对植物造成危害。
二、定西地区腐烂茎线虫的多样性调查为了了解定西地区腐烂茎线虫的多样性,我们在该地区的不同农田和园艺作物上进行了采样和观察。
通过取样并在实验室中分离,我们鉴定了一系列的腐烂茎线虫种类和数量,包括某某种、某某种等。
结果显示,定西地区的腐烂茎线虫种类相对较多,但主要以某某种和某某种为主。
这些线虫主要寄生于玉米、小麦等作物的根系中,对作物的生长和发育造成了明显的危害。
多样性调查结果为进一步研究腐烂茎线虫的生活史、生态习性及其对植物的毒力提供了重要的基础数据。
三、腐烂茎线虫的室内毒力测定为了进一步探究腐烂茎线虫对植物的毒力和致病机理,我们进行了室内毒力测定实验。
首先,我们从田间采集到的腐烂茎线虫中筛选出一定数量的某某种作为实验对象。
然后,我们分别将其接种到不同作物的幼苗上,通过比较其对不同作物的影响,评估腐烂茎线虫的毒力。
实验结果显示,某某种腐烂茎线虫对玉米、小麦等作物的毒力较强,能显著抑制作物的生长和发育。
同时,我们观察到腐烂茎线虫在寄主根系中繁殖迅速,形成大量的卵粒,进一步加剧对植物的危害。
结论:本研究对定西地区腐烂茎线虫的群体多样性和对植物的毒力进行了调查和测定,结果显示定西地区腐烂茎线虫种类相对较多,对玉米、小麦等作物具有较强的毒力。
基于ITS序列对两株野生大型真菌的鉴定及系统发育分析李春霖;肖强;张瑛;万松胜;李双龙
【期刊名称】《湖北林业科技》
【年(卷),期】2024(53)2
【摘要】为进一步确定菌种鉴定的准确性和科学性,通过采用传统形态学分类法与ITS序列分析法对采自湖北省武陵山地区恩施市境内的2株野生真菌进行分类鉴定与系统发育分析。
结果表明:依据其形态特征初步鉴定该2株菌株为绒盖牛肝菌属菌种;对2株菌株样本的ITS全区序列进行PCR扩增测序,并在NCBI数据库中进行Blast比对,采用NJ邻接法构建出系统发育树,通过探究其与已知菌种的相关性进行分析鉴定。
确定样本HBES1003为绒盖条孢牛肝菌,样本HBES1096为黑斑绒盖牛肝菌。
【总页数】5页(P46-50)
【作者】李春霖;肖强;张瑛;万松胜;李双龙
【作者单位】湖北民族大学林学园艺学院;恩施州林业科学研究院;生物资源保护与利用湖北省重点实验室
【正文语种】中文
【中图分类】Q938.2
【相关文献】
1.一株野生大型真菌的菌种分离及ITS序列鉴定
2.基于ompB基因序列的立克次体精河株的系统发育分析与鉴定
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系统地位研究4.一株野生大型真菌的分离与鉴定5.基于ITS序列对几株野生大型真菌的鉴定
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不同地理来源腐烂茎线虫种群杂交后代致病力测定王宏宝;毛佳;李茹;赵桂东;林茂松【摘要】利用室内人工接种方法对腐烂茎线虫杂交后代进行致病力、繁殖力的测定,结果表明:同一基因型内各组合中均能杂交成功,比较发现各种群的后代数目与对照亲本的数目有显著差异,各杂交组合中杂交率与F1数量均低于对照组(对照组为亲本自交);各杂交群体在致病力、繁殖力表现方面与对照DeSD种群在P0.05水平上均存在差异;各种群正反交群体致病力、繁殖力与对照相比,对照DeSD种群所在的反交组合表现特征均高于其正交组合;相关性分析,腐烂茎线虫两类基因型各种群基因型内杂交群体致病力与繁殖力均存在正相关.本研究对模拟我国不同地理来源腐烂茎线虫种群扩散后所产生杂交代的致病力分化情况,腐烂茎线虫遗传多样性具有重要的应用价值,并为不同地理来源有害生物入侵分险评估提供理论依据.%Using artificial inoculation methods, on offspring of Ditylenchus destructor, the pathogenicity, fecundity of that were determination, the results showed that: hybrids combinations within the same genotype can successfully. Compared of the number of descendants, found in the various groups and control parents were significantly different, the hybridization rate and the number of F, hybrid were lower than the control group (the control group as the parents selfed) ;The hybrid groups and control DeSD population, in pathogenicity, reproductive performance, there were differences at the P0.05 level;Compared with groups of reciprocal groups and the control population in the pathogenicity, fecundity, performance characteristics of the anti-crosses was higher than the orthogonal on the control DeSD; Correlation analysis was showed thatpathogenicity and fecundity of Ditylenchus destructor hybridization groups were positively correlated. This study has important applications on the genetic diversity of Ditylenchus destructor and the virulence differentiation of simulating proliferation of hybrids of Ditylenchus destructor populations in different geographical origin, at the same time, This was provided a theoretical basis on the risk assessment of pest invasion from different geographical origin.【期刊名称】《华北农学报》【年(卷),期】2011(026)006【总页数】5页(P212-216)【关键词】生物学杂交;腐烂茎线虫;致病力;繁殖力【作者】王宏宝;毛佳;李茹;赵桂东;林茂松【作者单位】江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所,江苏淮安223001;南京农业大学植保学院,江苏南京210095;南京农业大学园艺学院,江苏南京210095;江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所,江苏淮安223001;江苏徐淮地区淮阴农业科学研究所,江苏淮安223001;南京农业大学植保学院,江苏南京210095【正文语种】中文【中图分类】S435腐烂茎线虫(Ditylenchus destuctor)是一种迁移性的内寄生线虫,主要为害植物的地下部分(根瘤、匍匐茎、球茎、根茎和块根),很少为害地上部分,缺少高等植物时,可以取食土壤真菌存活。
甘肃定西马铃薯腐烂茎线虫的发生、病原学研究及品种抗性评价马铃薯腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)是马铃薯贮藏期的一种重要病害,也是一种重要的全球检疫性有害生物,严重威胁马铃薯的生产。
本研究对甘肃省定西地区马铃薯腐烂茎线虫(D.destructor)的发生危害、种类鉴定、培养条件、侵染规律和抗性评价等方面进行了研究,主要研究结果如下:1.2014年12月和2015年3月,采集甘肃省定西地区马铃薯腐烂茎线虫病样,对马铃薯腐烂茎线虫为害马铃薯的症状进行观察和描述,并采用随机抽样的方法对该病在甘肃省定西地区的发生情况进行调查。
调查结果表明,甘肃定西地区马铃薯腐烂茎线虫病的发病率为2-11%,病情指数为0.72-5.33;品种间的发病程度差异较大,其中青薯9号和荷兰15号的发病程度显著高于其它品种。
2.采用形态学结合分子生物学的方法对甘肃定西马铃薯上的4个线虫群体进行了鉴定,利用UPGMA法构建线虫群体ITS序列的系统发育树,并按照柯赫氏法则进行了致病性测定。
结果表明,4个线虫群体在形态学上与马铃薯腐烂茎线虫一致,但群体DX27与群体DX11、DX16、DX19存在差异。
利用通用引物TW81/AB28扩增rDNA-ITS 序列获得了长度均为915 bp的片段;序列比对分析表明,群体DX27与其它3个群体相比,在ITS1区的96-255 bp片段内有25个位点的差异;系统发育树显示,群体DX27与马铃薯腐烂茎线虫C型群体聚为1支,群体DX11、DX16、DX19与马铃薯腐烂茎线虫B型群体聚为1支。
根据形态学特征及rDNA-ITS序列分析结果,将该病原线虫确定为马铃薯腐烂茎线虫,其中群体DX27属于C型,群体DX11、DX16、DX19属于B型。
3.选用茄镰刀菌(Fusarium solani)、轮枝镰刀菌(F.verticillioides)、尖孢镰刀菌(F.oxysporum)、半裸镰刀菌(F.semitectum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、交链孢(Alternaria alternate)和茄链格孢(A.solani)等8个真菌菌株,在15℃、20℃、25℃和30℃4个温度梯度下对马铃薯腐烂茎线虫的最佳室内培养条件进行筛选。
文章编号:1000-1573(2007)05-0079-05腐烂茎线虫不同地理种群IT S 区序列比对及系统发育王金成1, 季 镭2, 黄国明1, 杨秀丽1, 林茂松2(1.天津出入境检验检疫局,天津300456; 2.南京农业大学植病系,江苏南京210095)摘要:为弄清我国腐烂茎线虫(Ditylenchus destr uctor )不同地理种群IT S(I nternal transcr ibed spacer)区之间的碱基差异及系统发育关系,本研究通过网络软件Clustalw 1.83对腐烂茎线虫的核糖体I T S 区核酸序列进行了比对,结果发现腐烂茎线虫的8个种群中,DEll 、DEly 、DEAY987007三个种群(I 组)内部之间的碱基差异在1%以内,其它的5个种群(II 组)之间的差异为0~1%,而I 组与I I 组种群之间的差异达到了15%(根据IT S1+ 5.8s +IT S2序列)或20%(根据IT S1+IT S2序列)。
这说明我国腐烂茎线虫很可能是1个复合种。
根据IT S 区核酸序列构建的系统发育图同样显示,我国腐烂茎线虫的7个地理种群明显分为2个分支A 和B 。
关 键 词:腐烂茎线虫;鳞球茎茎线虫;食菌茎线虫;IT S(Inter nal transcribed spacer);系统发育关系中图分类号:S 435.621.2+9文献标识码:AAlignments of rDNA -ITS sequences and phylogeny of differentgeo populations of Ditylenchus destructor in ChinaWAN G Jin cheng 1,JI Lei 2,HU ANG Gu o ming 1,YAN G Xiu li 1,LIN Mao song 2(1.T ianjin Entr y-Exit Inspection and Quar antine Bureau,T ianjin 300456,China;2.Dept.of Plant P atholog y,N anjing A gricultural U niversity ,N anjing 210095,China)Abstract :The IT S sequences of 8populations of sw eet potato stem nematode,Ditylenchus destr uctor ,w ere analyzed.The pair-w ise divergences for IT S1+ITS2sequences and IT S1+5.8s +IT S2sequences of 3populations (group I),DEll,DEly and DEAY987007,are w ithin 1%.T he pair-w ise divergence w ithin other 5populations (group II),DEjl,DEsg ,DEws,DEw y,DEhblf,varied from 0~1%.However,the divergence betw een group I and group II is 15%for ITS1+5 8s+ITS2sequences or 20%for ITS1+IT S2sequences.T he MP analysis divided the 8above-mentioned populations into tw o clades.The clade B includes DEll,DEly and DEAY987007(group I),and the other 5populations in group II belong to clade A.Key words:Ditylenchus destr uctor ; D.dip saci; D.myceliop hagus;ITS (Internal Transcribed Spacer);phy logenetic relationships收稿日期:2006-11-10基金项目:天津自然科学基金资助项目(05YF JM JC10800)作者简介:王金成(1978-),男,山东潍坊人,硕士,农艺师,主要从事植物线虫方面的研究.E mail:goldcit ywang @yahoo.通讯作者:林茂松(1948-),男,江苏徐州人,博士,教授,主要从事植物线虫方面的研究.E mail:linms@第30卷第5期2007年9月河北农业大学学报JOURNAL OF AGRICULT URAL UNIVERSIT Y OF H EBE IVol.30No.5Sep .2007腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)为农业上重要病原线虫,也是我国重要的植物检疫性有害生物。
该线虫目前在我国河北、山东、山西、安徽、江苏和天津等省市的甘薯上均有发现。
ITS(Internal transcribed spacer)区位于核糖体18s rDNA基因和28s rDNA基因之间,是一段高度重复的核酸序列,易于扩增,并且与核糖体基因之间存在协同进化的现象[1],因此是一条理想的分子生物学研究的目标片段。
目前,利用IT S区核酸序列对植物线虫进行系统发育研究的报道较少[2-3]。
本研究利用线虫ITS区通用引物对7个腐烂茎线虫种群、2个鳞球茎茎线虫种群以及1个食菌茎线虫种群的ITS区进行了扩增和测序,并根据ITS区的测序结果,以鳞球茎茎线虫D.dip saci和食菌茎线虫D.myceliop hagus作外源构建了腐烂茎线虫的系统发育树,其目的就是试图弄清我国腐烂茎线虫不同地理种群之间的亲缘和进化关系。
1 材料与方法1.1 材料1.1.1 线虫种群 腐烂茎线虫(D.destr uctor)分别来自河北、江苏、山西、山东、安徽等5省的病区,从病薯中分离得到[4]。
鳞球茎茎线虫(D.dipsaci)由江苏出入境检验检疫局提供,分别截获于来自希腊和意大利货轮,寄主为大蒜。
食菌茎线虫(D. myceliop hagus)来自浙江温州病区,从蘑菇培养基中分离获得(见表1)。
所有上述种群均根据形态特征和虫体测量数据进行了初步的鉴定[5]。
另外,本研究还使用了GenBank/EM BL/DDBJ基因库中鳞球茎茎线虫的5条ITS序列以及1条腐烂茎线虫的ITS序列。
1.1.2 引物 本试验采用线虫ITS区通用引物参照Ferris等[6]和Vrain等[7]设计的引物:上游引物P1:5-CGT AAC AAG GTA GCT GTA G-3下游引物P2:5-TTT CAC T CG CCG TTA CTA AGG-3引物由Invitrog en公司合成。
表1 供试线虫样品及来源Table1 Samples used in the study序号N o.样品编号Code种名Species name中文名Chinese name来源Orig in1DEly D.destr uctor腐烂茎线虫山东沂水(AM232233) 2DEll D.destr uctor腐烂茎线虫山东临沂(AM232232) 3DEw s D.destr uctor腐烂茎线虫安徽泗县(AM232228) 4DEw y D.destr uctor腐烂茎线虫安徽颖上(AM232229) 5DEjl D.destr uctor腐烂茎线虫山西临汾(AM232231) 6DEsg D.destr uctor腐烂茎线虫江苏赣渝(AM232227) 7DEhblf D.destr uctor腐烂茎线虫河北廊坊(AM232230) 8DEA Y987007 D.destr uctor腐烂茎线虫俄罗斯莫斯科(A Y987007) 9DII T D.dip saci鳞球茎茎线虫意大利(AM232235) 10DIGR D.dip saci鳞球茎茎线虫希腊(AM232234)11DIAF396319 D.dip saci鳞球茎茎线虫爱沙尼亚E(AF396319) 12DIAF396320 D.dip saci鳞球茎茎线虫爱沙尼亚(AF396320) 13DIAF396321 D.dip saci鳞球茎茎线虫俄罗斯莫斯科(A F396321) 14DIAF396322 D.dip saci鳞球茎茎线虫俄罗斯莫斯科(A F396322) 15DIAF396323 D.dip saci鳞球茎茎线虫摩洛哥(AF396323)16DM zw D.my celiop hagus食菌茎线虫浙江温州(AM232236)注:括号内为各条序列在GenBank/EM BL/DDBJ基因库中的索取号.1.2 方法1.2.1 线虫DNA的提取 DNA提取方法参照王金成等[8]的方法进行。
在洁净的载玻片上加8 L 去离子水,用挑针挑入一条去离子水洗过的线虫,用解剖刀将线虫切成2~3段,最后将切碎的线虫连同8 L去离子水转入200 LPCR反应管中。
在上述管中分别加入1 L PCR缓冲液(10!Buffer)和1 L蛋白酶K(1mg/mL),混匀,-20∀冷冻过夜,然后65∀保温1h,最后94∀灭活10 min,离心后上清液可直接用于PCR扩增。
所用10!PCR缓冲液和蛋白酶K购自Inv itrogen公司。
1.2.2 PCR扩增(1)PCR反应体系。
反应总体积50 L:ddH2O80河北农业大学学报第30卷28 6 L,10!PCR Buffer (M g 2+)5 L,dNT P (2 5mmol)2 L,上游引物(10 mol/L)3 L,下游引物(10 mol/L)3 L,Taq DNA 聚合酶(5U/ L)0 4 L,模板DNA 8 L 。
所用试剂均购自大连宝生物(TAKARA)公司。
(2)PCR 反应条件。
反应条件:95∀预变性3m in,然后是40个循环反应(95∀变性30sec,55∀退火30sec,72∀延伸1min ),最后72∀保温10min,使反应物充分延伸。
(3)PCR 产物电泳检测。
PCR 反应结束后,在1 5%的琼脂糖凝胶上电泳,所用电压120V 。
1.2.3 PCR 产物测序和序列比对 当扩增获得的PCR 产物浓度达到100ng / L 时,交由Invitrogen 公司测序。
每一份PCR 产物都采用正反双向测序,然后将2次测序结果进行拼接,剪掉核糖体18s 和28s rDNA 基因序列,最后将ITS 序列用于序列比对分析。