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流式细胞表面标志检测 staining cell surface antigens for flow-cytometry

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免疫学检测技术及应用

免疫学检测技术及应用

划痕法
细胞因子的检测技术
一、 生物学检测技术 二、 免疫学检测技术 三、分子生物学检测技术
依赖细胞株测定法 ELISA法
分子杂交、PCR 等检测mRNA
细胞因子检测的特点
• 样品含量低 •样品具有时效性 •生物效应特异性差
Figure 14-12
细胞因子的功能
Cell activation
／immunogold staining)
（一）免疫荧光技术(又称荧光抗体技术) 原理：用荧光素(如异硫氰酸荧光素、罗
丹明B200等) 标记抗体(荧光抗体)，用荧光 抗体浸染细胞或组织切片，抗原与荧光抗体 结合，于荧光显微镜下观察荧光，确定被检 抗原的存在。
免疫荧光技术包括：
直接法
间接法
间接补体增强法
ELISA法： 直接法 间接法 双抗体夹心法(双位点法) 竞争法
ELISA
(三) 同位素标记技术(isotope-labelling technique) 放射免疫分析(radioimmunoassay,
RIA) 是一种用放射性同位素分析抗原抗体反应 相结合方法。 优点：灵敏度高, 可检测0.001pg／mL
Direct and indirect immunofluorescence staining of membrane antigen (mAg).
（二）免疫酶技术(immunoenzymatic techniques)
是将抗原抗体反应与酶催化底物的作用 相结合的一种方法。
主要有两种类型： 1.免疫酶染色 2.酶免疫测定（enzyme immunoassay, EIA）
•3H-胸腺嘧啶核苷参入法（3H-TdR）: 间接观察DNA 合成含量。灵敏度高，具有放射性。 •四甲基偶氮唑盐法（MTT）: MTT商品名为噻唑蓝。 原理：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可将外源性 MTT还原成蓝紫色结晶-甲瓒（formazan）, DMSO使 其溶解，酶标分析仪检测。简便，灵敏度高，稳定性 差。

医学免疫学实验五 流式细胞术检测免疫细胞表面标记

医学免疫学实验五 流式细胞术检测免疫细胞表面标记
流式细胞术检测免疫细胞表面标记
实验目的
1 了解BD FACS Verse的流式细胞术 2 学习并掌握FCM 的原理 3了解FCM 的运用 4 简单运用FCM检测免疫细胞特性
✓ Introduction FCM Principles FCM Applications
Introduction
BD是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于
BD Introduction FCM Principles ✓ FCM Applications
Flow Cytometry Applications Flow Cytometry Applications
• 细胞结构
• • 细胞大小 • • 细胞颗粒度 量与细 胞周 期
利用优化的缓冲液和抗体借 助 流式细胞仪检测转录因子 表达
用流式细胞仪分选细胞或 检测细胞表面蛋白表达
用 BD Phosflow 抗 体 检测关键蛋白的磷酸化水平
用 ELlSA或 ELISPOT方 法 检 测
分泌的细胞因子
..，.---\1 用 流 式 细 胞 仪 检 测 特 异 细 胞 胞内细胞因子表达
1897年在纽约创立的，总部设在新泽西州。
Maxwell W. Becton
Fairlegh S. Dickinson
经过一百多年的发展，BD已成为世界上最大的医疗技术及医
疗设备公司之一，它以领先的技术、卓越的产品质量和诚实可
信的服务赢得了全球用户及合作伙伴的广泛赞誉。
BD Introduction ✓ FCM Principles
Flow Cytometry Principles
某些物质在特定波长范围内的光线照射下，可发出波长比 照射光波长长的光线-即荧光。而这些受激发后能产生荧 光的物质称为荧光素

CD4+T细胞迁移在哮喘小鼠“肺合大肠”的初探

CD4+T细胞迁移在哮喘小鼠“肺合大肠”的初探

中国免疫学杂志2021年第37卷CD4+T 细胞迁移在哮喘小鼠“肺合大肠”的初探①孔靖玮李亚兰吴珺葛东宇②刘红双②赵点②彭桂英（北京中医药大学生命科学学院，北京100029）中图分类号R228文献标志码A文章编号1000-484X （2021）04-0400-06［摘要］目的：利用同类系小鼠构建联体共生模型，研究CD4+T 细胞在哮喘小鼠肺与结肠组织之间迁移的可能性，以期丰富“肺合大肠”的科学内涵。

方法：利用木瓜蛋白酶滴鼻诱发小鼠哮喘，通过HE 染色检测肺和结肠组织病理学变化，流式细胞术分析肺泡灌洗液嗜酸性粒细胞和嗜中性粒细胞的数量，肺和肠组织CD4+T 细胞的比例。

接着以CD45.1和CD45.2小鼠通过外科手术构建联体共生模型，随机分成对照组和模型组，模型组中的CD45.1小鼠给予木瓜蛋白酶滴鼻，对照组中的CD45.1小鼠给予等量无菌PBS 溶液滴鼻。

造模结束后流式细胞术分析结肠黏膜固有层CD45.1+CD3+CD4+T 细胞的比例。

结果：木瓜蛋白酶可诱导小鼠哮喘，其支气管周围存在明显炎症细胞浸润，肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞（P <0.001）和中性粒细胞数量（P <0.01）明显增加，肺组织CD4+T 细胞比值也明显升高（P <0.001），结肠黏膜固有层有炎症细胞浸润且CD4+T 细胞比值增加（P <0.05）；联体共生小鼠血液中白细胞交换比例约50∶50，模型组中CD45.2小鼠结肠黏膜固有层CD45.1+CD3+CD4+T 细胞的比例显著升高（P <0.05）。

结论：木瓜蛋白酶诱发的哮喘小鼠部分肠黏膜固有层CD4+T 细胞亚群可能由肺组织迁移而来，这可能是“肺合大肠”的机制之一。

此外联体共生模型有助于深入挖掘“脏腑相合”理论的生物学机制。

［关键词］联体共生模型；哮喘；CD4+T 细胞；肺合大肠Investigation of "lung being relative to large intestine"theory by migration of CD4+T cells in asthmatic miceKONG Jing -Wei ，LI Ya -Lan ，WU Jun ，GE Dong -Yu ，LIU Hong -Shuang ，ZHAO Dian ，PENG Gui -Ying.School of Life Sciences ，Beijing University of Chinese Medicine ，Beijing 100029，China［Abstract ］Objective ：To enrich the scientific connotation of "lung being relative to large intestine"theory by detecting the mi⁃gration of CD4+T cells between lung and colon tissue in asthmatic mice via establishing the parabiotic model using congenic mice.Methods ：Mice were administrated with papain to induce asthma model.HE staining was used to detect the pathological changes of lung and colon tissues.Meanwhile ，the counts of eosinophils and neutrophils in BALF and proportion of CD4+T cells in lung and colonwere analyzed by flow cytometry.Congenic CD45.1and CD45.2mice were paired to establish parabiotic model by surgery operation.And parabiotic mice were randomly divided into two groups ，including control group and model group.The CD45.1mouse in modelgroup was intranasally administrated with papain to induce asthma ，while the CD45.1mouse in the control group was given the sameamount of sterile PBS.Flow cytometry was used to analyze the proportion of CD45.1+CD3+CD4+T cells in colonic lamina propia （LP ）.Results ：Papain could induce asthma model and significantly cause the inflammatory infiltration around bronchus.Moreover ，the counts of eosinophils （P <0.001）and neutrophils （P <0.01）in BALF were remarkably increased and the proportion of CD4+T cells wasobviously upregulated in lung of asthmatic mice （P <0.001）.It is noteworthy that inflammatory infiltration and the increased proportion of CD4+T cells was detected in colonic LP.The exchange ratio of leukocytes in the blood of parabiotic mice is nearly 50∶50.And the percentage of CD45.1+CD3+CD4+T cells was enhanced in colonic LP of CD45.2parabiotic mice （P <0.05）.Conclusion ：Part of colonic LP CD4+T cells in papain -induced asthmatic mice might originate from lung tissues ，which probably contributes to one of the mecha⁃nisms of "lung being relative to large intestine"theory.In addition ，the parabiotic model could contribute to further explore the biologi⁃cal mechanism of "Zang -fu connection"theory.［Key words ］Parabiotic model ；Asthma ；CD4+T cells ；Lung being relative to large intestine doi ：10.3969/j.issn.1000-484X.2021.04.004①本文受北京中医药大学基本科研业务费（2019⁃JYB⁃TD014）资助。

体外培养单个造血干细胞实验方法的建立

体外培养单个造血干细胞实验方法的建立

体外培养单个造血干细胞实验方法的建立李乔;高瀛岱;纪庆;王金宏;许静;田晨;程辉;刘延风;张娜;程涛【摘要】Aim To explore the effect of nomegestrol acetate ( NOMAc ) on the apoptosis of endometriosis ( Ems ) in rat models and its mechanism. Methods The rat models of NOMAc were established by surgical operation method; histopathologic changes of ectopic endometrium were tested by HE staining; the level of antiendometrium antibody ( EMAb ) was tested by Elisa; the expression levels of apoptosis factors were tested by Western blot. Results NOMAc ( 0. 5,1. 5, 15 mg ·kg-1 ) shriveled ectopic endometrium; the number of endometrial gland was fewer; glandular cavity was smaller in NOMAc groups than those of modelgroups. NOMAc reduced dose-dependently the endometrial thickness and the level of EMAb. NOMAc( 0. 5, 1.5,15 mg · kg-1 ) increased Caspase-9, Caspase-3 and Bax protein expression and reduced Bcl-2 protein expression. Conclusion The inhibitory effect of NOMAc on ectopic endometrium of rat models may be related to reducing the level of EMAb, increasing Bax, reducing Bcl-2 protein expression, and activating Caspase-9 and Caspase-3 protein expression in endogenous apoptosis pathway.%目的通过建立一种体外稳定培养单个造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)的实验方法,在未来筛选可以促进HSC体外扩增的化合物.方法通过配制HSCs体外培养液并结合流式分选技术,我们建立了一种在体外不需要基质细胞支持的,稳定的,高通量培养单个HSC形成一个血细胞集落的实验方法.结果只需培养10~14 d即可观察到化合物对HSC的作用,并结合流式细胞分析技术替代人工计数血细胞分化情况,进一步节省人力,具有客观、重复性强的特点,满足了高通量筛选药物的要求,为后续的研究和化合物筛选工作打下基础.为了验证此方法的可靠性,使用BIO(一种通过抑制糖原合成酶激酶-3,进而可以促进HSC自我更新的化合物)时,实验结果与文献报道的研究结果一致.结论该实验方法在有关造血干细胞体外扩增的药物筛选方面具有很好的应用价值.【期刊名称】《中国药理学通报》【年(卷),期】2012(028)003【总页数】4页(P435-438)【关键词】单个HSC培养;流式细胞分选与分析;血细胞涂片;p18;小分子;干细胞扩增【作者】李乔;高瀛岱;纪庆;王金宏;许静;田晨;程辉;刘延风;张娜;程涛【作者单位】中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)实验血液学国家重点实验室,天津,300020;中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)实验血液学国家重点实验室,天津,300020;中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)实验血液学国家重点实验室,天津,300020;中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)实验血液学国家重点实验室,天津,300020;中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)实验血液学国家重点实验室,天津,300020;中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)实验血液学国家重点实验室,天津,300020;中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)实验血液学国家重点实验室,天津,300020;中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)实验血液学国家重点实验室,天津,300020;中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)实验血液学国家重点实验室,天津,300020;中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)实验血液学国家重点实验室,天津,300020【正文语种】中文【中图分类】R329.24;R329.28;R341;R965.1造血干细胞一直是成体干细胞研究中的热点。

《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程

《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程

流式检测细胞凋亡Annexin V 检测细胞凋亡 (2)实验原理 (2)实验用品 (2)操作步骤 (3)Annexin V Blocking (5)凋亡细胞的DNA 断裂片段分析 (7)实验原理 (7)实验用品 (8)操作步骤 (9)BrdU Flow Kits 检测细胞增殖 (12)实验原理 (12)BrdU Flow Kits 试剂盒 (12)结果分析 (17)流式仪器设置指南 (18)线粒体膜电位变化检测细胞凋亡 (22)实验原理 (22)实验用品 (22)样本制备 (23)结果分析 (24)注意事项 (24)Active Caspase-3 检测细胞凋亡 (26)实验原理 (26)实验步骤 (27)结果分析 (28)Annexin V 检测细胞凋亡实验原理Annexin V 是检测细胞凋亡的灵敏指标之一。

它是一种磷脂结合蛋白，可以与早期凋亡细胞的胞膜结合，而细胞质膜的改变是细胞发生凋亡时最早的改变之一。

在细胞发生凋亡时，膜磷脂酰丝氨酸(PS) 由质膜内侧翻向外侧。

Annexin V 与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，因而与细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸结合。

由于在发生凋亡时，磷脂酰丝氨酸外翻的发生早于细胞核的改变，因此，与DNA 碎片检测比较，使用Annexin V 可以更早地检测到凋亡细胞。

因为细胞坏死时也会发生磷脂酰丝氨酸外翻，所以Annexin V 常与鉴定细胞死活的核酸染料(如PI 或7-AAD)合并使用，来区分凋亡细胞(Annexin V+/核酸染料-)与死亡细胞(Annexin V+/核酸染料+)。

实验用品1. 一次性12×75mm Falcon试管。

2. PBS缓冲液：含0.1%NaN ，过滤后2-8°C保存。

33. 微量加样器和加样头。

4. Annexin V Binding Buffer缓冲液（Cat. No. 66121E）：浓度为10×，使用时，用稀释为1×浓度的应用液。

医学免疫学实验五 流式细胞术检测免疫细胞表面标记

医学免疫学实验五 流式细胞术检测免疫细胞表面标记
➢每管分1mL细胞； ➢4℃，400g离心5min； ➢弃尽上清，每管加50μL Fc block彻底悬浮，4℃孵育
15min； ➢每管加10μL对应的抗体稀释液，4℃避光孵育30min（铝
箔包好）； ➢每管加500μL PBS，4℃，400g离心5min； ➢弃尽上清，每管加500μL PBS悬浮细胞，尼龙膜过滤后流
1897年在纽约创立的，总部设在新泽西州。
Maxwell W. Becton
Fairlegh S. Dickinson
经过一百多年的发展，BD已成为世界上最大的医疗技术及医
疗设备公司之一，它以领先的技术、卓越的产品质量和诚实可
信的服务赢得了全球用户及合作伙伴的广泛赞誉。
BD Introduction ✓ FCM Principles
流式细胞术检测免疫细胞表面标记
实验目的
1 了解BD FACS Verse的流式细胞术 2 学习并掌握FCM 的原理 3了解FCM 的运用 4 简单运用FCM检测免疫细胞特性
✓ Introduction FCM Principles FCM Applications
Introduction
BD是由Maxwell W. Becton和Fairleigh S. Dickinson 于
利用优化的缓冲液和抗体借 助 流式细胞仪检测转录因子 表达
用流式细胞仪分选细胞或 检测细胞表面蛋白表达
用 BD Phosflow 抗 体 检测关键蛋白的磷酸化水平
用 ELlSA或 ELISPOT方 法 检 测
分泌的细胞因子
..，.---\1 用 流 式 细 胞 仪 检 测 特 异 细 胞 胞内细胞因子表达
BD Introduction FCM Principles ✓ FCM Applications

流式细胞术(FCM)的工作原理及其在免疫学上的应用

流式细胞术（FCM）的工作原理及其在免疫学上的应用摘要：流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种可对单细胞进行快速定性、定量分析的新技术。

它借鉴了荧光标记技术、激光技术、单抗技术和计算机技术，具有极高的检测速度与统计精确性，而且从单一细胞可以同时测得多个参数。

随着其分析技术和方法的日臻完善，流式细胞术在临床免疫及科学研究上发挥了非常重要的作用。

本文对流式细胞术的工作原理进行了概括介绍，并对其在免疫学等方面的应用进行了综述，展示了FCM 在免疫学上应用的广阔前景。

关键词：流式细胞术；流式细胞仪；工作原理；免疫学；应用；应用前景流式细胞术(FCM)是70年代发展起来的一种快速对单细胞或微粒定量分析和分选的新技术。

其检测速度之快，统计学精度之高，是其他的方法无可比拟的，可同时从一个细胞中测得多种参数(如DNA、R N A、蛋白质、细胞体积等)进行多参数分析。

流式细胞仪是近代细胞生物学、分子生物学、分子免疫学和单克隆技术、激光技术、电子计算机术等学科高度发展的结晶，在血液学、肿瘤学等学科尤其是在免疫学方面得到广泛应用[1]。

近年来，随着流式细胞免疫学技术的迅速发展，流式细胞术与单克隆抗体技术结合，使细胞表面和细胞内抗原，癌基因蛋白及膜受体的定量检测取得了很大进展。

流式免疫技术克服了普通免疫学方法难以准确定量的不足，形成了流式免疫学独特的科学分支，成为研究细胞免疫学的先进技术之一。

随着科学技术的发展，多种新的荧光探针的不断出现，使FCM技术的应用范围不断扩大，特别是各种各样的荧光探针标记的单克隆抗体和其他蛋白质的出现，为FCM 研究各种组织细胞膜和细胞内抗原、肿瘤性蛋白等开辟了新途径[2]。

1 .流式细胞术与流式细胞仪1.1流式细胞技术：流式细胞技术是以高能量激光照射高速流动状态下被荧光色素染色的单细胞或微球，测量其产生的散射光和发射荧光的强度；经染色的细胞或微球在悬液中以单行流过高强度光源的焦点，当每个细胞或微球经过焦点时，发出一束散射光/或荧光；它们经过过滤及光镜系统收集到达一个光电检测器光电倍增管或一个固态装置），光检测器把散射光定量转化成电信号，经数字转换器进行数字化后而成整数，然后进行电子存储，以后数据可以调出显示和进行分析；并可能将感兴趣的细胞进行分选[3]。

PrimeFlowTM RNA Assay用户使用手册

仪器设备： 见附录 A2.
实验持续时间： 第一天（约 6-8 小时）：抗体染色，固定及透化，结合目标探针： 第二天（约 6 小时）：信号放大，上机检测。
操作步骤： 注：推荐两天实验过程（针对 1.5mL 离心管）。在杂交和信号扩增步骤使用试剂盒中的离心管很重要， 以便控制残留体积。用死活细胞鉴定染料抗体染色以及固定和透化（步骤 1-16）则不做要求，如果整
3、将用荧光共轭抗体染色的细胞在 2-8℃放置 30 分钟进行表面染色。 注：具体操作可见 Best Protocols: Staining Cell Surface Antigens for Flow Cytometry: Protocol A: Cell Suspensions；使用只和选定的荧光素共轭的抗体；死活细胞鉴定染色可以在表面染色之前 或之后进行，具体见 Best Protocols: Viability Staining Protocol, Protocol C；对某些表面标 记物染色需在固定和透化之后进行，详见我们网站的 Antibody Clone Performance Following Fixation/Permeabilization 表格，注意“After IC Fixation and Perm Wash”栏来决定抗体是否能 识别已经固定的位点。如果你倾向于固定后染色，可直接跳至第 5 步。 4、加 1mL Flow Cytometry Staining Buffer 进入每个样本，颠倒混匀，500 ×g 离心 5 分钟，弃表 层，对离心管底的细胞进行重悬。 注：如果用全血细胞，跳过此步直接到第 5 步。 5、准备 Fixation Buffer 1，混匀等量的 PrimeFlow RNA Fixation Buffer 1A 和 PrimeFlow RNA Fixation Buffer 1B，上下颠倒混匀，动作要轻缓。 注：每份样本用 1mL 这种缓冲液，将缓冲液集中混匀以用于所有样本，不要用涡旋震荡或大力震荡缓 冲液。缓冲液需要新鲜配置，丢弃不用。 6、加入 1ml 准备好的 Fixation Buffer 1 于每个样本中，颠倒混匀。2-8℃孵育 30 分钟。 7、在 800×g 离心 5 分钟，弃上清，将管底的细胞重悬。 8、准备加入 RNA 抑制剂的 1×PrimeFlow RNA Permeabilization Buffer（透化缓冲液）：将 PrimeFlow RNA Permeabilization Buffer (10×)用 RNase-free 水配至 1×。然后加入稀释 1000 倍的 RNaseInhibitor 1 (1000×)和稀释 100 倍的 RNase Inhibitor 2 (100X)，轻柔上下颠倒混匀，保存 于 2-8 摄氏度。 注：每个样本需要 3mL 该缓冲液，请集中配置缓冲液。避免涡旋震荡及用力晃动。需新鲜配置，没用 完的需扔掉。 9、将 1mL 1× PrimeFlow RNA Permeabilization Buffer（已加入 RNase 抑制因子）于每份样本中， 颠倒混匀，800×g 离心 5 分钟，弃上清，将底部细胞重悬。 10、重复第 9 步。 11、将合适浓度的需进行胞内染色的细胞和荧光共轭抗体加入 1× PrimeFlow RNA Permeabilization Buffer（已加入 RNase 抑制因子）在 2-8℃染色 30 分钟。 注：如果不需要进行胞内染色，直接跳过本步骤到步骤 13；需在固定和透化之后对一些表面标记物进 行染色，具体见网站上 Antibody Clone Performance Following Fixation/Permeabilization 表中 “After IC Fixation and Perm Wash”栏；使用只和所选荧光素共轭的抗体。 12、加 1mL 1× PrimeFlow RNA Permeabilization Buffer（已加入 RNase 抑制因子）于各样本中， 上下颠倒混匀，800×g 离心 5 分钟，弃上清，将底部细胞用涡旋轻柔重悬。 13、准备 1×PrimeFlow RNA Fixation Buffer 2：每个样本准备 125 µL PrimeFlow RNA Fixation Buffer 2 (8X) 和 875 µL PrimeFlow RNA Wash Buffer，上下颠倒混匀。 注：每个样本需要 1mL 这样的缓冲液。缓冲液需将所有样本集中配置。避免涡旋和大力震荡。缓冲液 需新鲜配置，弃去不用的。 14、将 1mL 1× PrimeFlow RNA Fixation Buffer 2 于每份样本中颠倒混匀，然后在室温避光中孵育

流式protocol

收获P3代生长状态良好细胞，0.25%胰酶消化，4 ℃离心，1 000 r/min，5 min。

↓用PBS(含1%BSA)清洗细胞3次，计数细胞。

↓各管依次加入单克隆抗体CD29、CD34、CD45、CD90。

↓同时每管样品设立同型阴性对照。

↓避光冰上孵育45 min。

↓用PBS(含1%BSA)洗涤细胞3次，以除去未结合抗体，用500 μL PBS(含1%BSA)重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。

（四个CD抗原分子，四个阴性对照，一个空白对照。

九个EP管）细胞一定要足够量，一般要求1×106个细胞。

对于直接标记单色样本，应该设置空白对照、阴性对照（同型抗体对照）和待测样本。

对于直接标记多色样本，在单色基础上另加补偿对照。

阴性对照的设置：在实验过程中，假设做直接标记法，可将实验组细胞，取一管，加上与实验抗体所标记的荧光颜色相同的同型对照来作为阴性对照。

空白对照：即不进行任何标记的细胞。

但是我们买的是pe和fitc荧光标记的抗体，那一管样品内可以同时加两中不同标记的抗体，那它们的同型对照怎么设置？我们的样品可以放在EP管里面吗？检测时，样品至少需要多少量？取第3代第3～5d BMSCs，胰蛋白酶-EDTA消化成为单细胞悬液；↓PBS（1到2ml）洗三次，离心，1000rpm，5min弃液；↓4%多聚甲醛1ml室温下固定40min，1000r/min,离心5min后弃去上清液↓PBS（1到2ml）洗两次，离心，1000rpm，5min弃液；↓分别加入500ul已经稀释的大鼠CD29、CD34、CD45及CD90单克隆抗体；↓避光孵育30min↓用PBS洗涤细胞两次，以除去未结合抗体；↓用PBS重悬细胞，流式细胞仪进行检测分析。

PBS洗涤细胞的过程中细胞丢失？解决办法有：（1）尽量采用尖底的离心管和水平离心机（2）离心后尽量用吸管吸取上清，不要倾倒；吸上清时最好残留1mm左右的水膜，不要吸完。

流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南说明书

ICS点击此处添加ICS号CCS 点击此处添加CCS号WS 中华人民共和国卫生行业标准XX/T XXXXX—XXXX代替 WS/T 360流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南Guidelines for peripheral lymphocyte subsets by flow cytometry(点击此处添加与国际标准一致性程度的标识)（征求意见稿）在提交反馈意见时，请将您知道的相关专利连同支持性文件一并附上。

XXXX-XX-XX发布XXXX-XX-XX实施前言本标准按照GB/T 1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本标准代替WS/T360-2011《流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南》，与WS/T360-2011相比，主要技术内容变化如下：a) 增加了流式细胞术检测淋巴细胞亚群的6色分析方案；b) 增加了流式细胞仪性能评估内容；c) 完善了仪器质量控制，仪器性能评估和项目性能评估的指标和质量目标；d) 梳理了分析前、分析中、分析后的内容及要求；e) 增加了自动样本制备内容；f) 补充了结果审核内容。

本标准起草单位：中国医学科学院肿瘤医院、北京医院/国家卫生健康委临床检验中心、北京大学第一医院、中国医学科学院北京协和医院、上海市第一人民医院、上海交通大学医学院附属新华医院、上海长征医院、苏州大学附属第一医院/江苏省血液研究所。

本标准主要起草人：崔巍、彭明婷、屈晨雪、黄春梅、李莉、沈立松、周琳、朱明清、崔婵娟、李臣宾。

流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群指南1 范围本标准规定了流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群（T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK淋巴细胞、CD4+T 淋巴细胞和 CD8+T淋巴细胞）的技术要求。

本标准适用于开展流式细胞术检测外周血淋巴细胞亚群的机构。

2 规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。

3 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。

3.1细胞分化抗原 cluster of differentiation，CD不同谱系白细胞在分化、发育、活化过程中，出现或消失的细胞表面标志。

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Useful websites
Mario Roederer's Home Page (/compensation/index.html) Mario Roederer is a key opinion leader in the field of flow cytometry. Purdue University Cytometry Laboratories (/index.htm) Flow Cytometry based public forum maintained by the Purdue University.
Introduction
Flow cytometry is a useful tool for simultaneously measuring multiple physical properties of individual particles (such as cells). Cells pass single-file through a laser beam. As each cell passes through the laser beam, the cytometer records how the cell or particle scatters incident laser light and emits fluorescence. Using this flow cytometric analysis protocol, one can perform a simultaneous analysis of surface molecules at the single-cell level.
General Notes
1. For optimal performance of fluorochrome conjugated antibodies, store vials at 2-8°C in the dark. Do not freeze. 2. Prior to use, quick spin the antibody vial to recover the maximum volume. We do not recommend vortexing the antibody vial. 3. Except where noted in the protocol, all staining should be done at 2-8°C with minimal exposure to light. 4. If you do need to store your samples that were stained with antibodies conjugated to organic fluorochromes, we recommend you complete your staining protocol and fix your samples with IC Fixation Buffer (cat. 00-8222) (100 µL of sample with 100 µL of IC Fixation Buffer) or 2 mL of 1-step Fix/Lyse Solution (cat. 00-5333). Cells can be stored in these buffers for up to 3 days in the dark at 2-8°C. We have observed minimal impact on brightness or FRET efficiency/compensation when using the IC Fixation (cat. 00-8222) or 1-step Fix/Lyse Solution (cat. 00-5333). Differences in fixation buffer quality can affect fluorochrome brightness or FRET efficiency. Fixation of tandem dyes, such as APC-eFluor® 780 and PE-Cy7, does not significantly increase the amount of compensation required from the APC or PE detector, respectively. Some generalizations regarding fluorophore performance after fixation can be made, but clone specific performance should be determined empirically.
Flow Cytometry – BestProtocols® Page 1 of 5
Staining Cell Surface Antigens for Flow Cytometry
Research Use Only
Protocol A: Cell Suspensions Protocol B: Human Lysed Whole Blood
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Flow Cytometry – BestProtocols® Page 2 of 5
Staining Cell Surface Antigens for Flow Cytometry
Research Use Onaterials
12x75 mm round bottom test tubes or 96-well round bottom microtiter plates Primary antibodies (directly conjugated or purified) Secondary reagents, if necessary (for indirect staining) Anti-Mouse CD16/CD32 Purified (Cat. No. 14-0161) Human Fc Receptor Binding Inhibitor Purified (Cat. No. 14-9161) Flow Cytometry Staining Buffer (Cat. No. 00-4222) [Optional] Viability solutions: 7-AAD Viability Staining Solution (Cat. No. 00-6993), Propidium Iodide Staining Solution (Cat. No. 00-6990), or Fixable Viability Dyes eFluor® 450, 506, 660 and 780 (Cat. No. 65-0863, 65-0866, 65-0864, 65-0865)
Experimental Procedure
1. Prepare cells as described in Cell Preparation for Flow Cytometry Protocols found in our Best Protocols section. Consider the use of Fixable Viability Dyes before beginning the antibody staining protocol (Refer to Viability Staining Protocol in our Best Protocols section). 2. [Optional] Block non-specific Fc-mediated interactions. a) For mouse cells: Pre-incubate the cells with 0.5-1 μg of Anti-Mouse CD16/CD32 Purified per 100 µL for 10-20 minutes at 2-8C or room temperature prior to staining. b) For human cells: Pre-incubate the cells with 20 μL of Human Fc Receptor Binding Inhibitor Purified per 100 µL for 10-20 minutes at 2-8C or room temperature prior to staining. 5 8 3. Aliquot 50 µL of cell suspension (from 2x10 -10 ) to each tube or well. 4. Combine the recommended quantity of each primary antibody in an appropriate volume of Flow Cytometry Staining Buffer so that the final staining volume is 100 µL (i.e. 50 µL of cell sample + 50 µL of antibody mix) and add to cells. Pulse vortex gently to mix. For directly conjugated antibodies: 5. Incubate for at least 30 minutes at 2-8°C or on ice. Protect from light. Note: Antibody binding kinetics are temperature dependent. Staining on ice may require longer incubation times. Furthermore, some antibodies require non-standard incubation conditions that will be noted on the technical data sheet provided with the antibody. For purified antibodies: 6. Incubate for at least 60 minutes at 2-8°C or on ice. Note: Antibody binding kinetics are temperature dependent. Staining on ice may require longer incubation times. Furthermore, some antibodies require non-standard incubation conditions that will be noted on the technical data sheet provided with the antibody. 7. Wash the cells by adding Flow Cytometry Staining Buffer. Use 2 mL for tubes or 200 µL/well for microtiter plates. Pellet the cells by centrifugation at 400-600xg for 5 minutes