《细胞实验》13 流式细胞仪检测细胞凋亡操作流程

线粒体膜电位变化检测细胞凋亡实验原理JC-1（5,5′,6,6′-Tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethyl-imidacarbocyanine iodide）是一种广泛用于检测线粒体膜电位(mitochondrial membrane potential)△Ψm的理想荧光探针。

可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。

在线粒体膜电位较高时，JC-1 聚集在线粒体的基质(matrix)中，形成聚合物(J-aggregates)，可以产生红色荧光（FL-2 通道）；在线粒体膜电位较低时，JC-1 不能聚集在线粒体的基质中，此时JC-1 为单体(monomer)，可以产生绿色荧光（FL-1 通道）。

这样就可以非常方便地通过荧光颜色的转变来检测线粒体膜电位的变化。

常用红绿荧光的相对比例来衡量线粒体去极化的比例。

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。

通过JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变可以很容易地检测到细胞膜电位的下降，同时也可以用JC-1 从红色荧光到绿色荧光的转变作为细胞凋亡早期的一个检测指标。

JC-1 单体的最大激发波长为514nm，最大发射波长为527nm；JC-1 聚合物(J-aggregates)的最大激发波长为585nm，最大发射波长为590nm。

实验用品1.12⨯75mm 的Falcon 管和15ml 聚苯乙烯离心管2.微量加样器和加样头3.线粒体检测试剂盒（货号551302，100tests），包括JC-1和10 ⨯ Assay Buffer, 注：每个KIT 包括 4 小瓶JC-1 试剂，每小瓶试剂足够检测25 个样本4.离心机5.CO2 培养箱6.流式细胞仪样本制备图1：试剂准备和JC-1 染色步骤总揽1.在JC-1粉末中加入125ulDMSO使其充分溶解，配成JC-1 Stock Solution，需根据实验的量分装-20度保存。

2.根据样本量配制JC-1 Working Solution，每个样品500ul 1×Assay Buffer + 5ulJC-1 Stock Solution。

细胞凋亡实验步骤及注意事项Last revised by LE LE in 2021细胞凋亡实验步骤及注意事项一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法二、实验原理细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。

凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。

它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。

细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。

在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。

在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。

在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。

核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp或它的整倍数的各种片断。

如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNAladder（梯状带纹）的特征。

相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。

细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。

一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。

三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。

研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。

流式细胞仪操作流程(单标)一、开机(务必按照此顺序开机)1、打开下面的小门，推上电源2、打开插线板电源开关3、开电脑4、打开流式细胞仪开关二、软件准备1、打开软件2、点击菜单栏的Cytometer，待流式细胞仪与电脑自动连接后会自动出现startup 和shutdown选项，点击startup，系统提示按确定。

（等待5～6min startup 完成后再继续）2、在出现的Browser栏中依次选择new folder——new experiment——new specimen——new tubes，按照实验组数给new specimen编号，按照每一组实验试管数给new tubes 编号。

3、在右边显示屏中拽出Global sheet，点击Dot Plot绘制散点图，点击Histogram绘制直方图。

以FITC单标抗体为例，首先绘制FSC-A为横坐标、SSC-A为纵坐标的散点图（图1），然后绘制以FITC-A为横坐标、SSC-A为纵坐标的散点图（图2），最后绘制以FITC-A为横坐标、count为纵坐标的直方图（图3）。

4、点击菜单栏中的populations，选择create statistics view。

三、上机操作1、将试管放置在流式细胞仪上，在左侧显示屏的Acquisition Dashboard中点击acquire data，此时流式细胞仪开始工作。

2、根据图1中细胞的位置，在Cytometer FACScanto 栏中的parameters标签中调节FSC和SSC的电压大小，使主群细胞在图1上处于居中的位置。

3、点击右侧显示屏的Polygon Gate按钮，在图1中选择要求测量的主群细胞，可见图1中出现P1，并且其中的细胞变成红色。

4、选择图2、图3，分别在左侧显示屏的Inspector-Dot Plot栏中点击P1的复选框，可见图2、3中的图象均变成红色，即要求细胞仪检测选定的细胞P1。

流式细胞仪原理及操作步骤流式细胞仪（FCM）是八十年代集单克隆抗体、荧光化学、激光、计算机等高技术发展起来的一种先进仪器，已广泛应用于免疫学、生物化学、生物学、肿瘤学以及血液学等方面的研究和临床常规工作。

其中检测人白细胞表面标志可对白血病、淋巴瘤作用迅速正确的诊断，对淋巴细胞群和亚群进行精确分类，还能分离纯化某一群或亚群细胞。

活细胞免疫荧光技术是用于FCM检测的标本准备，染色后也能在荧光显微镜下进行观察，在某些实验条件下，活细胞免疫荧光染色后的特异性和敏感性要优于滴片固定的常规间接免疫荧光的结果。

（一）原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。

（二）操作步骤制备活性高的细胞悬液（培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法）↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb（5～50μl）的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1 ∶20（用DPBS稀释）灭活正常兔血清（或兔抗鼠）荧光标记物，充分振摇↓ 4 ℃30min 用洗涤液洗涤2 次，每次加液2ml 左右1000rpm×5min↓加适量固定液（如为FCM制备标本，一般加入1ml 固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl 固定液）↓ FCM检测或制片后荧光显微镜下观察（标本在试管中可保存5～7 天）（三）试剂和器材1. 各种特异性单克隆抗体。

2. 荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。

3. 10％FCS RPMI1640, DPBS 、洗涤液、固定液（见附录）。

4. 玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。

（四）注意事项1. 整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10 倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。

流式细胞仪的使用程序分子病毒实验室一．开机程序1．检查稳压器电源，打开电源，稳定 5 分钟。

2.打开储液箱，倒掉废液，并在废液桶中加入400ml漂白水原液。

打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至 4/5 满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFIow），合上压力阀。

确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。

3.将 FACSCalibur 开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是 STANDBY，预热5-10分钟。

排出过滤器内的气泡。

4.如果需要打印，打开打印机电源。

5.打开电脑 , 等待屏幕显示出标准的苹果标志。

6.执行仪器 PRIME 功能一次，以排除 Flow cell 中的气泡。

7.分析样品时，先用 FACAFIow或PBS进行HIGH RUN约2分钟。

做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个 50ml 离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。

待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。

预设获取模式文件(Acquisition Template Files)从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个1.获取模式文件。

2.选取屏幕左列绘图工具中的Dot plot，绘出一个或多个Dot Plots（点图）。

从Dot Plot对话框中选取Acquisition作为图形资料来源，并确定适当的 x 轴和y 轴参数。

3.选取屏幕左列绘图工具中的 Histogram，同上法可绘出 Histogram （直方图）。

4.将此视窗命名后储存于FACStation G3\BD Applications \CELLQuestFolder \EXP文件夹中，下次进行相同实验时可直接调用。

. 本计算机中已设定两个模式文件：ACQ和EXP，储存于FACStationG3\BD Applications \CELLQuest \EXP 文件夹中，ACQ 用于细胞 DNA 检测， EXP用于细胞表面标志分析。

凋亡细胞的D N A断裂片段分析
实验原理
在细胞发生凋亡后，最早出现胞膜外翻等现象，之后发生的程序性改变之一，就是细胞核酸内切酶激活，出现DNA 断裂片段。

核酸酶将染色质的高级结构断裂为50-300kb 的片段，最终断裂为200bp 大小的DNA 碎片。

DNA 碎片检测的方法是外源性TdT 酶催化反应，常指“end-labeling”或“TUNEL” (terminal deoxynucleotidyltransferase dUTP nick end labeling)。

现在可以使用APO-DIRECT Kit，用流式细胞术来检测凋亡细胞由于DNA 断裂，造成DNA 链3’-OH 增多的情况。

在APO- DIRECT 分析中，TdT 酶催化DNA 单链和双链3’-OH 末端非模板依赖性的dUTP FITC 掺入反应。

由于采用了直接荧光标记的FITC-dUTP，所以一步反应后，就可以在流式细胞仪上检测DNA 碎片。

APO-DIRECT Kit（Cat. No. 6536KK）试剂盒：
实验用品
1.一次性12⨯75mm Falcon 试管
2.蒸馏水
3.PBS 缓冲液：含0.1%NaN3，过滤后2-8︒C 保存
4.固定液：含1%多聚甲醛的PBS 缓冲液
5. 70%乙醇
6.冰浴箱
7.微量加样器和加样头
8.APO-DIRECT Kit 试剂盒
9.流式上机检测。

B r d U F l o w K i t s检测细胞增殖实验原理BrdU中文全名5-溴脱氧尿嘧啶核苷，为胸腺嘧啶的衍生物，可代替胸腺嘧啶在DNA合成期（S期），活体注射或细胞培养加入，而后利用抗Brdu 单克隆抗体，荧光染色，显示增殖细胞。

同时结合其它细胞标记物，可判断增殖细胞的种类，增殖速度，对研究细胞动力学有重要意义。

BrdU Flow Kits是用BrdU 染色和流式分析结合高效的试剂盒，包括在BrdU 存在下培养细胞，以适宜浓度的DNA 酶使胞内DNA 变性，加强掺入BrdU 与抗体的亲和力，同时保留胞内蛋白结构和荧光素荧光强度，从而避免了DNA 变性条件与胞内及表面标志同时检测条件的冲突，运用荧光标记的抗细胞表面抗原单抗及抗细胞因子单抗,结合固定、破膜、通透等处理技术使同时检测细胞活化、增殖、DNA 合成及胞内细胞因子的分泌成为可能。

7-AAD染色总DNA，通过BrdU和7-AAD双色染色就能刻画中细胞在整个细胞周期中增殖时期的特点。

BrdU Flow Kits 试剂盒FITC BrdU Flow KitCat. No. 559619 (50 tests) Cat. No. 557891 (4×50 tests)APC BrdU Flow KitCat. No. 552598 (50 tests) Cat. No. 557892 (4×50 tests)1.抗BrdU荧光抗体每管50μl 染色50 样本(106 cells/样本). FITC BrdU Flow Kit(Cat. No. 559619) 包含50μl FITC anti-BrdU抗体。

APC BrdU Flow Kit (Cat. No.552598), 包含50 μl APC anti-BrdU抗体。

抗体使用前用BD Perm/Wash Buffer按照1:50稀释。

每个样本加入50 μl 稀释抗体。

流式细胞仪操作步骤（FACSCalibur）⼀、开机程序：1.检查鞘液桶和废液桶。

确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位置，可以连续⼯作3个⼩时左右）、盖紧⿊盖、管道畅通、废液桶有⾜够空间容纳本批标本排弃的废液。

如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中⽓压。

2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印机。

3.⽓压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以排除管路中⽓泡。

⼆、运⾏FACSComp软件、检查仪器状况1.制备三⾊标准微球样本。

⼀般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加⼊1滴质控⼩微球，也可以根据实际情况调节浓度。

2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。

选择所需校正内容，如果使⽤的微球是新⼀批产品要输⼊微球的批号。

3.在软件界⾯左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过程中是否需要清洗样品。

4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。

功能键设置在“RUN”。

5.仪器⾃动检查，并做电压、补偿等设置。

6.FACSComp软件运⾏完毕，显⽰结果通过测试。

7.做Set up。

8.打印校正结果，退出FACSComp程序。

备注：在质控过程中，如果提⽰收集细胞速度慢可以提⾼细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，⼀定要⽤“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。

在使⽤仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。

三、样品分析软件：CellQuest Pro软件，选择“联机”。

1.（2）对实验样本进⾏命名；（3）对实验通道进⾏预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。

备注：如果界⾯被关闭，重新调出步骤：2.调出质控模板。

3.画图选择画图⼯具（⼀般选择散点图），Inspect界⾯会⾃动弹出，对⼏个常⽤选项进⾏设定：将散点图选中（⽤⿏标点击散点图边框才能够选中图形），将更改横纵坐备注：第⼀个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC。

细胞凋亡检测细胞凋亡实验步骤检测⽅法细胞凋亡检测，细胞凋亡实验步骤，检测⽅法⼀、定性和定量研究只定性的研究⽅法：常规琼脂糖凝胶电泳、脉冲场倒转琼脂糖凝胶电泳、形态学观察（普通光学显微镜、透射电镜、荧光显微镜）进⾏定量或半定量的研究⽅法：各种流式细胞仪⽅法、原位末端标记法、ELISA 定量琼脂糖凝胶电泳。

⼆、区分凋亡和坏死可将⼆者区分开的⽅法：琼脂糖凝胶电泳，形态学观察（透射电镜是是区分凋亡和坏死最可靠的⽅法），Hoechst33342/PI双染⾊法流式细胞仪检测，3) Telemerase Detection (端粒酶检测)3、⽣化检测：1）典型的⽣化特征：DNA ⽚段化2）检测⽅法主要有：琼脂糖凝胶电泳、原位末端标记（TUNEL）等3）TUNEL（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺⼝末端标记）4）通过DNA末端转移酶将带标记的dNTP （多为dUTP）间接或直接接到DNA ⽚段的3’-OH端，再通过酶联显⾊或荧光检测定量分析结果。

可做细胞悬液、福尔马林固定或⽯蜡处理的组织、细胞培养物等多种样本的检测。

4、LM-PCR Ladder (连接介导的PCR检测)当凋亡细胞⽐例较⼩以及检测样品量很少（如活体组织切⽚）时，直接琼脂糖电泳可能观察不到核DNA的变化。

通过LM-PCR,连上特异性接头，专⼀性地扩增梯度⽚段，从⽽灵敏地检测凋亡时产⽣梯度⽚段。

此外，LM-PCR 检测是半定量的，因此相同凋亡程度的不同样品可进⾏⽐较。

如果细胞量很少，还可在分离提纯DNA后，⽤32P-ATP和脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）使DNA标记，然后进⾏电泳和放射⾃显影，观察凋亡细胞中DNA ladder的形成。

上述两种⽅法都针对细胞凋亡晚期核DNA断裂这⼀特征，但细胞受到其它损伤（如机械损伤，紫外线等）也会产⽣这⼀现象，因此它对细胞凋亡的检测会受到其它原因的⼲扰。

需结合其它的⽅法来检测细胞凋亡。

)境，这可能导致了凋亡早期细胞线粒体膜电位的降低，从⽽使细胞⾊素C（三羧酸循环中的重要组分）从线粒体内转移到细胞液中，启动凋亡效应器caspase的级联反应。

A c t i v e C a s p a s e-3检测细胞凋亡实验原理Caspase-3 在早期凋亡细胞中就已经活化，是凋亡程序中的重要的Caspase 酶。

凋亡细胞中，32kD 的原酶(Pro-caspase-3)裂解为一个17-21kD 亚单位和一个12kD 亚单位，两个亚单位形成二聚体，即为活化的Caspase-3，活化的Caspase-3 又水解、活化其它Caspase 酶和多种胞浆内成分（如D4-GDI，Bcl-2）和核内成分（如PARP）。

PharMingen 多克隆或单克隆Caspase-3 抗体可以识别Caspase-3 活化形式，它特异性识别由无活性的Pro-Caspase-3 活化水解后的暴露的断裂端，C92 单克隆抗体与Pro-Caspase-3 无交叉反应。

Active Caspase-3 Apoptosis Kit 特为流式细胞术分析凋亡细胞的Caspase-3 而设计。

包括荧光标记多克隆兔抗Active-Caspase-3 抗体（Anti-Active Caspase-3 FITC 或Anti-Active Caspase-3 PE）、固定/破膜剂、破膜/冲洗缓冲液。

实验步骤1Camptothecin 诱导细胞凋亡在DNA 合成中，需要拓扑异构酶I。

Camptothecin 是拓扑异构酶I 的抑制剂，它在体外依剂量不同而影响凋亡的发生。

在此，Camptothecin 做为常规的凋亡诱导方案，辅助细胞凋亡分析。

凋亡诱导试验用品1.用DMSO 制备1.0mM 的Camptothecin 储备液2.Jurkat T 细胞（ATCC TIB-152）凋亡诱导试验步骤1.1⨯106cells/ml 增殖的Jurkat T 细胞加入Camptothecin，Camptothecin 终浓度为4-6μM。

2.细胞37︒C 孵育4 小时。

2Active Caspase-3 染色步骤试验用品：1.12⨯75mm 的Falcon 管2.PBS 缓冲液3.凋亡检测试剂盒染色步骤：。

流式细胞仪细胞凋亡检测技术一、固定细胞的染色方法1）PI单染色法方法一1．收集细胞（1～5）×106个，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。

2．3ml PBS洗一次。

3．离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。

4．离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。

5．400目的筛网过滤1次，500～1000r/min离心5min，弃去PBS。

6．用1ml PI染液，4℃避光30min。

7．流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。

方法二1．收集细胞（1×106个），500～1000r/min离心5min，弃去培养液。

2．1ml PBS/FCS洗一次。

3．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，加入500μl PBS/FCS和500μl的多聚甲醛固定液，轻轻混匀，在4℃下固定4min。

4．500～1000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2％Tween 的PBS 1ml，37℃孵育15min。

5．1ml PBS/FCS洗3次，每次5min。

6．400目的筛网过滤1次。

7．500～1000r/min离心5min去PBS/FCS，用1.0ml PI染液，4℃避光至少30min。

染色在24h之内皆可行，流式细胞仪分析。

2）调亡细胞的TUNEL的流式细胞仪分析1．离心收集细胞，PBS洗1～2次。

2．1％多聚甲醛低温下固定15min。

3．3ml PBS洗1次，70％乙醇固定，冰箱内放置1～3天。

4．PBS轻洗1次5．细胞与TdT标记液37℃孵育，时间1～2h。

6．PBS轻洗1次。

7．细胞在黑暗中37℃与100μl的染色缓冲液孵育30min。

8．含0.1％Triton-X 100的PBS轻洗1次。

4．500～1000r/min离心5min弃去固定液，室温加入含0.2％Tween 的PBS 1ml，37℃孵育15min。

流式细胞仪操作规程一、开机程序1、检查稳压器电源，打开电源，稳定 5 分钟。

2、打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入 400ml 漂白水原液。

打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至 4/5 满（一般可用超纯水，特殊情况需要用PBS），合上压力阀。

确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。

3、将 FACSCalibur 开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是 STANDBY，预热 5－10 分钟。

排出过滤器内的气泡。

4、如果需要打印，打开打印机电源。

5、打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。

6、执行仪器 PRIME 功能一次，以排除 Flow cell 中的气泡。

7、分析样品时，先用 FACAFlow 或 PBS 进行 HIGH RUN 约 2 分钟，以去除可能的管路残片。

二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files)1、从苹果标志中选择 CELLQuest，建一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。

2、选取屏幕左列绘图工具中的 Dot plot，绘出一个或多个 Dot Plots（点图）。

从 Dot Plot 对话框中选取 Acquisition 作为图形资料来源，并确定适当的 x 轴和 y 轴参数。

3、选取屏幕左列绘图工具中的 Histogram，同上法可绘出 Histogram（直方图）。

4、将此视窗命名后储存于 FACStation G3\BD Applications \CELLQuest Folder\EXP 文件夹中（也可以自己取名，但每个实验人员只能建立一个文件夹），下次进行相同实验时可直接调用。

三．用 CELLQuest 进行仪器的设定和调整1、从苹果画面中选取 CELLQuest，进入 CELLQuest 后在 File 指令栏中打开合适的获取模式文件。

2、从屏幕上方 Acquire 指令栏中，选取 Connect to Cytometer（快捷键：＋B）进行电脑和仪器的连机。

流式检测细胞周期与凋亡样品处理流程1.胰蛋白酶消化法收集细胞，做成单细胞悬液2.1000离心5，收集沉淀。

3.沉淀用洗2次，1000离心5，收集沉淀。

4.细胞沉淀用4℃预冷的70%的冰乙醇1重悬，4℃过夜。

即可送检。

备注：1.每个细胞样品细胞量需达到106（细胞沉淀要打散，避免细胞聚集），细胞量少可能测不出结果，或结果不太准确。

2.样品可在-20℃保存一个月流式检测细胞倍体样品处理流程1.胰蛋白酶消化法收集细胞，做成单细胞悬液2.1000离心5，收集沉淀。

3. 沉淀用洗2次，加入相应种属的淋巴细胞或鸡红细胞做为内参，内参与预检测细胞的比例为1：34. 1000离心5，收集沉淀。

5. 细胞沉淀用4℃预冷的70%的冰乙醇1重悬，4℃过夜。

即可送检。

备注：1.每个细胞样品细胞量需达到106（细胞沉淀要打散，避免细胞聚集），细胞量少可能测不出结果，或结果不太准确。

2.样品可在-20℃保存一个月检测胞内蛋白上机前细胞处理流程1.收集实验处理好的细胞，用洗2次，2%多聚甲醛固定15。

2.离心弃掉多聚甲醛，再用70%的冰乙醇固定过夜（4℃）。

3.离心弃掉乙醇，洗一遍，加破膜剂0.5100 50106个细胞15。

4.直接在0.5100中加一抗室温孵育30，离心，用洗一次，加荧光标记二抗（需进口二抗,国内的效价比较低效果不好），总体系为100，总体系中应含0.25%（体积分数）的100，室温孵育30。

5.也可以直接加直标的一抗。

6.离心，用洗一次，用2%的多聚甲醛固定，4℃存放待测。

备注：1. 市面上的多聚甲醛多为4%的，可用稀释。

如果用两步标记，应做不加一抗，只加二抗的对照管2. 未染色的新鲜标本贮存方法如下：10%二甲基亚砜，90%小牛血清，5×106～1×107细胞在-70℃过夜，然后置液氮中可长期保存。

3.免疫染色未经固定的标本在4℃可保存48h。

若需存放时间较长、或标本具有传染性，应该用固定剂固定。

利用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡1. 细胞按每孔4 X105个的密度接种于60 mm细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理细胞。

（设置实验组和对照组，实验组依辛伐他汀浓度分为3组，2mol/L、5卩mol/L、10卩mol/L辛伐他汀组正常对照组（NC 组）：胰岛素终浓度0.058mg/LA组：辛伐他汀终浓度2 i mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ;B组：辛伐他汀终浓度5 i mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ;C组：辛伐他汀终浓度10 i mol/L+胰岛素终浓度0.058mg/L ;于37 C, 5%CO2培养箱中孵育48h）2. 胰酶消化收集细胞，并用1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次，全部加入15ML 管中。

3. 800 rpm 离心5 分钟,去除上清,加5 mL PBS 缓冲液重悬细胞,再次离心弃上清,重复两次,最后重悬细胞于0.5mL PBS 中。

4. 用低速振荡器边震动边加入 5 mL预冷的70%乙醇，固定，4C过夜。

5. 次日将固定好的细胞以1000 rpm的转速离心5分钟，弃上清，加入4 mL PBS清洗一次，用0.4 mL PBS重悬细胞。

6. 加入5 此RNaseA （10 mg/ml）37 C消化1小时，加入终浓度50 mg/mL 碘化丙啶（propidium iodide PI ）4C避光染色过夜（或者37C避光染色1小时），在EPICS XL流式细胞仪上分析。

利用流式细胞抗体检测检测细胞膜表面蛋白的变化1.细胞按每孔4 X105个的密度接种于60 mm细胞培养皿内，培养过夜后，用相应药物处理细胞。

2．胰酶消化收集细胞,并用1 mL PBS 缓冲液清洗剩余细胞一次,全部加入15ML 管中。

3.800 rpm离心5分钟，去除上清，加5 mL PBS缓冲液重悬细胞，再次离心弃上清，重复两次,最后重悬细胞于0.1mL PBS 中,并转移到1.5 mL 离心管中。

细胞凋亡实验步骤及注意事项细胞凋亡实验步骤及注意事项一、实验目的1、掌屋凋亡细胞的形态特征2、学会用荧光探针对细胞进行双标记来检测正常活细胞、凋亡细胞和坏死细胞的方法二、实验原理细胞死亡根据其性质、起源及生物学意义区分为凋亡和坏死两种不同类型。

凋亡普遍存在于生命界，在生物个体和生存中起着非常重要的作用。

它是细胞在一定生理条件下一系列顺序发生事件的组合，是细胞遵循一定规律自己结束生命的自主控制过程。

细胞凋亡具有可鉴别的形态学和生物化学特征。

在形态上可见凋亡细胞与周围细胞脱离接触，细胞变园，细胞膜向内皱缩、胞浆浓缩、内质网扩张、细胞核固缩破裂呈团块状或新月状分布、内质网和细胞膜进一步融合将细胞分成多个完整包裹的凋亡小体，凋亡小体最后被吞噬细胞吞噬消化。

在凋亡过程中细胞内容物并不释放到细胞外，不会影响其它细胞，因而不引起炎症反应。

在生物化学上，多数细胞凋亡的过程中，内源性核酸内切酶活化，活性增加。

核DNA随机地在核小体的连接部位被酶切断，降解为180-200bp 或它的整倍数的各种片断。

如果对核DNA进行琼脂糖电泳，可显示以180-200bp为基数的DNA ladder（梯状带纹）的特征。

相比之下，坏死是细胞处于剧烈损伤条件下发生的细胞死亡。

细胞在坏死早期即丧失质膜完整性，各种细胞器膨胀，进而质膜崩解释放出其中的内容物，引起炎症反应，坏死过程中细胞核DNA虽也降解，但由于存在各种长度不等的DNA片断，不能形成梯状带纹，而呈弥散状。

一些温和的损伤刺激及一些抗肿瘤药物可诱导细胞凋亡，通常这些因素在诱导凋亡的同时，也可产生细胞坏死，这取决于损伤的剧烈程度和细胞本身对刺激的敏感程度。

三尖杉酯碱（HT）是我国自行研制的一种对急性粒细胞白血病，急性单核白血病等有良好疗效的抗肿瘤药物。

研究表明HT在0.02~5μg/ml范围内作用2小时，即可诱导HL-60细胞凋亡，并表现出典型的凋亡特征。

本实验用1μg/ml HT在体外诱导培养的HL-60细胞发生凋亡，同时也有少数细胞发生坏死。

流式细胞仪检测细胞凋亡实验PI单染色法实验原理其原理主要是根据细胞凋亡时在细胞、亚细胞和分子水平上所发生的特征性改变。

这些改变包括细胞核的改变、细胞器的改变、细胞膜成分的改变和细胞形态的改变等，其中细胞核的改变最具特征性，主要包括以下几个方面：1. 细胞核的改变由于凋亡细胞核的改变，造成各种染色体荧光染料对凋亡细胞DNA可染性发生改变。

研究表明，用各种染色体荧光染料对经固定的凋亡细胞进行染色，其DNA可染性降低。

许多学者把这种DNA可染性的降低认为是凋亡细胞的标志之一。

2. 光散射特性凋亡细胞形态上的改变影响它们的光散射特性。

在流式细胞仪上，前散射光与细胞的大小有关，而侧散射光反映的是光在细胞内的折射作用，与细胞内的颗粒多少有关。

在细胞凋亡时，细胞固缩，体积变小，故前散射光降低，这一特性往往被认为是凋亡细胞的特点之一。

此外细胞凋亡时由于染色体降解，核破裂形成，细胞内颗粒往往增多，故凋亡细胞侧散射光常增加。

细胞坏死时，由于细胞肿胀，其前散射光增大；侧散射光在细胞坏死时也增大，因此可根据前散射光和侧散射光区别凋亡细胞和坏死细胞。

但需要注意的是，根据前散射光和侧散射光判断凋亡细胞的可靠性受被检测细胞形态上的均一性和核胞浆比率影响很大。

因此在某些淋巴细胞凋亡中，用光散射特性检测凋亡的可靠性较好，而在肿瘤细胞凋亡中，其可靠性就较差。

根据光散射特性检测凋亡细胞最主要的优点是可以将光散射特性与细胞的表面免疫荧光分析结合起来，用以区别经这些特殊处理发生选择性凋亡的淋巴细胞亚型。

也可用于活细胞的分类。

实验材料细胞试剂/试剂盒PBS PI 蒸馏水乙醇仪器/耗材棕色瓶 400目筛网流式细胞仪实验步骤一、收集细胞收集细胞｛数目约（1~ 5）×106个/mL｝，500~ 1 000 r/min 离心5 min，弃去培养液。

二、细胞洗涤3 ml PBS洗涤1次。

三、乙醇固定离心去PBS，加入冰预冷的70%的乙醇固定，4℃，1-2小时。