流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710321625.1(22)申请日 2017.05.09(71)申请人 成都扬克斯生物科技有限公司地址 610094 四川省成都市高新区益州大道中段722号4栋14楼1404号(72)发明人 彭西　于正强　胡东　李林蔚　(74)专利代理机构 北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙) 11350代理人 汤东凤(51)Int.Cl.G01N 15/14(2006.01)(54)发明名称小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法(57)摘要本发明公开了一种小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，包括以下步骤：获取试验小鼠的胸腺或脾脏组织，制备单细胞悬液；分别吸取所述胸腺或脾脏单细胞悬液，分别加入抗小鼠的CD3、CD4、CD8单克隆抗体各一头份，旋涡混匀，于4℃避光染色；染色后，用PBS液洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；分析检测结果，获得小鼠胸腺或脾脏各亚群T淋巴细胞的百分比。

本发明成功建立了稳定规范的流式细胞术检测小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的方法，通过对样品前处理、检测和分析过程中的目标细胞选取、补偿调节及参数选择的问题进行改进，避免了试验过程中人为因素造成的误差，提高了结果判断的真实性和客观性。

权利要求书1页 说明书6页 附图3页CN 107132177 A 2017.09.05C N 107132177A1.一种小鼠胸腺或脾脏T淋巴细胞亚群的流式细胞术检测方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1，获取试验小鼠的胸腺或脾脏组织，制备单细胞悬液；步骤2，吸取所述胸腺或脾脏单细胞悬液，分别加入两支流式上机管中一支管中加入抗小鼠的CD3、CD4、CD8单克隆抗体，旋涡混匀，于4℃避光染色，用作检测管；另一支用作阴性设置管；步骤3，染色后，用PBS液洗涤并重悬细胞，使用流式细胞仪进行检测；步骤4，分析检测结果，获得小鼠胸腺或脾脏各亚群T淋巴细胞的百分比。

流式细胞术检测细胞内细胞因子的研究进展【摘要】：细胞因子具有调节细胞生长、分化成熟、功能维持、调节免疫应答、参与炎症反应、创伤愈合和肿瘤消长等多种生物学功能。

因此，细胞因子的研究成果为临床上预防、诊断、治疗疾病提供了科学基础，特别是利用细胞因子治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫性疾病等，具有非常广阔的应用前景[1]。

随着细胞表面标记及胞内细胞因子标记流式细胞技术的出现，使对胞内细胞因子的研究推向了一个新的阶段。

流式细胞术也成为了检测单细胞水平细胞因子表达能力的重要检测方法。

本文针对流式细胞术在胞内细胞因子检测中的研究进展作一综述。

【关键词】：流式细胞术；细胞内；细胞因子；检测技术引言：细胞因子(cytokine，CK)是由多种组织细胞(主要为免疫细胞)所合成和分泌的小分子多肽或糖蛋白，能介导细胞之间的相互作用，并在抵抗外来病原及维持机体内环境平衡中起到重要作用。

细胞因子的检测方法一般分为生物学测定法、分子生物学测定法及免疫学测定法。

而目前用于检测单个细胞特定细胞因子表达的手段则包括：多参数流式细胞术，酶联免疫斑点法ELISPOT[2]、原位杂交、免疫细胞化学、限制性稀释分析（limiting dilution analysis，LDA）和单细胞PCR等生物分析技术。

相较于其它的检测方法，流式细胞术在细胞内细胞因子的检测上具有高效、简便、适应性广等优势。

一、流式细胞术的概述流式细胞术(flow cytometry，FCM)是一种能够对单个细胞或生物微颗粒的生物学性质进行定量分析和分选的检测手段，具有快速、高精度、高准确性、多参数和高通量等优点，是目前先进的细胞定量分析技术之一。

FCM能够快速分析单个细胞或粒子的多种特性，既可以定性，也可以定量，尤其适用于大量样品检测，已在临床检验工作中得到广泛应用。

流式细胞仪（fluorescenceactivated cell sorter，FACS）的检测分析已涉及到细胞生物学、免疫学、肿瘤学、遗传学、血液学、微生物学等学科。

流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程一、编号：JS0604二、标题：流式细胞术检测淋巴细胞亚群操作规程三、关键词：流式细胞术淋巴细胞操作规程四、目的：规范流式细胞术检测淋巴细胞亚群的实验操作五、背景知识：T细胞亚群变化的临床意义主要表现在肿瘤、自身免疫性疾病中。

在感染性疾病中，因为CD4+ T细胞是辅助、诱导T细胞的标志，CD4+ T 细胞下降常见于某些病毒感染性疾病，如AIDS、巨细胞病毒感染、瘤型麻风。

而CD4+ T细胞长期低于正常水平，常提示患者易于被病毒等微生物侵袭。

CD8+是抑制、杀伤T细胞的标志，在传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、慢性乙型肝炎等感染性疾病中，CD8+ T细胞常升高。

CD4+／CD8+细胞比值下降，除肿瘤等疾病外，常见于AIDS、瘤型麻风、传染性单核细胞增多症、巨细胞病毒感染、血吸虫病等。

六、原理：利用不同荧光物质标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，与待测成分作用，然后上流式细胞仪检测待测细胞。

待测细胞随流动室内的流动鞘液排列成单列，一个个迅速通过激光聚焦区，激光在对每个细胞进行照射时可同时得到前向角散射和侧向角散射2种散射光以及激发荧光标记物质发出的信号，利用这些信号，可计算出CD3+、CD4+、CD8+的相对含量，从而得出各细胞群的相对比值。

七、仪器设备和材料：肝素抗凝静脉血1ml，不同荧光素标记的抗CD3、CD4、CD8单克隆抗体，同型阴性对照荧光物，溶血剂，固定剂，流式细胞仪。

八、操作步骤1、100μ1抗凝血加20μl荧光单克隆抗体，同时做阴性对照。

2、避光室温作用20min，溶去红细胞后，固定剂固定。

3、上流式细胞仪测定，以阴性对照测出本底参数，调节荧光补偿，设定阳性参数值，软件将计算出阳性表达细胞比例。

九、注意事项1、为保证所得结果的可靠性，每次试验前应以标准荧光微球检测仪器的变异系数。

2、每次应做阴性对照、阳性对照、正常对照、质控对照，以确保将各种试剂及操作过程对结果的影响降至最低。

流式细胞术检测人和小鼠Th细胞亚群早在1986年Mosmann等[1]依据小鼠分泌的细胞因子谱不同首次将Th细胞分为Th1和Th2两个功能不同的独立亚群。

Th1细胞主要分泌IL-2、、IL-12、IFN-γ和TNF- α等细胞因子，介导与细胞毒和局部炎症有关的免疫应答，参与细胞免疫及迟发型超敏反应。

Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL13等细胞因子，其主要功能为刺激B细胞增殖并产生抗体，与体液免疫相关。

由于Th1/Th2 亚群及其相互之间的平衡在免疫应答的调节中起着关键的作用，Th1/Th2 平衡的失调与多种疾病的发生发展和预后有着密切的关系。

目前已发现许多感染性疾病、自身免疫性疾病、过敏性疾病以及移植排斥反应等都与Th1/Th2 平衡有关。

因此建立稳定有效的细胞内因子检测方法对于准确说明Th1/Th2细胞的作用非常重要。

目前检测的主要方法有酶联免疫法、ELISPOT法、荧光定量法及原位杂交等方法。

流式细胞术检测细胞内因子是一种相对快速、重复性好并能准确定量的方法。

我们参照国内外的一些文献，对于人和小鼠Th1和Th2细胞的流式检测方法进行了探索，并比较了两者之间的不同。

由于未活化的淋巴细胞所分泌的细胞因子极少，用流式细胞仪很难检测出来，因此在检测前需刺激活化。

目前国内外推荐的刺激物主要为PMA （佛波酯）和离子霉素（Ionomycin）。

淋巴细胞在刺激物的作用下活化，分泌细胞因子到细胞外。

由于流式细胞仪只能对细胞表面或内部的抗原进行检测，因此必须阻止细胞因子的分泌。

抑制细胞因子分泌的试剂为Brefedlin A 或莫能霉素（Monensin）。

Th1/Th2 细胞首先是CD4+ T 淋巴细胞。

因此如何确定CD4+ T淋巴细胞非常重要，我们主要围绕该问题进行探讨。

材料与方法试剂PMA（Sigma）贮存液：PMA 溶于DMSO 浓度为0.1mg/ml -20℃保存。

工作液：贮存液1:100 稀释于RPMI 1640培养基中，此时为1µg/ml。

流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群的准确性评价夏欣欣;王慧睿【摘要】目的:探讨流式细胞术检测外周血T淋巴细胞亚群的准确性.方法:选取2016年3月至2017年3月收治的恶性肿瘤患者36例为观察组,另选取同期就诊的非肿瘤患者36例为对照组,比较两组对象的外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞及CD8+T细胞数量;利用流式细胞术对两组患者外周血T淋巴细胞亚群进行检测,判断该检测结果与临床诊断结果的符合率.结果:观察组患者的CD3+T细胞数量为(823.42±212.03)个/mm3,低于对照组的(1270.21±685.14)个/mm3(t=2.786,P=0.008);观察组患者的CD4+T细胞数量为(424.06±235.02)个/mm3,低于对照组的(750.98±367.56)个/mm3(t=2.786,P=0.008);观察组患者的CD8+T细胞数量为(860.94±633.86)个/mm3,高于对照组的(456.37±334.20)个/mm3(t=2.525,P=0.016);观察组患者的CD4+/CD8+T细胞数比值为(0.51±0.29),低于对照组的(2.11±1.32)(t=5.295,P=0.000);流式细胞术对患者外周血T淋巴细胞亚群检测结果的符合率为100.0％.结论:采用流式细胞术检测恶性肿瘤患者外周血T淋巴细胞亚群准确性较高,能够为恶性肿瘤的临床诊断和治疗提供依据.【期刊名称】《包头医学院学报》【年(卷),期】2018(034)003【总页数】2页(P5-6)【关键词】流式细胞术;恶性肿瘤;外周血T淋巴细胞亚群;检测准确性【作者】夏欣欣;王慧睿【作者单位】郑州大学附属洛阳中心医院肿瘤科,河南洛阳471000;郑州大学附属洛阳中心医院血液科【正文语种】中文恶性肿瘤的发生、发展与患者机体免疫功能的关系密切，在机体抗肿瘤免疫监视功能中，免疫系统具有非常重要的作用，而在维持人体机体免疫平衡的过程中，T细胞及其亚群所起到的作用至关重要，如T细胞亚群发生功能或数量改变时，机体的免疫功能紊乱，从而导致疾病[1-2]。

流式细胞术（flow cytometry）是一种广泛应用于生物医学领域的技术，它通过检测细胞表面和内部分子的存在和数量，从而可以对细胞进行高度特异性的分析和分类。

在临床诊断、生物医学研究以及药物开发等方面都有着重要的应用。

其中，流式细胞术检测淋巴细胞亚群，可以帮助我们更好地了解免疫系统的功能状态，对于免疫相关疾病的诊断和治疗具有重要意义。

本文将从原理和注意事项两个方面，深入探讨流式细胞术检测淋巴细胞亚群的相关知识。

**一、流式细胞术检测淋巴细胞亚群的原理**1. 标本处理流式细胞术检测淋巴细胞亚群的首要步骤是标本处理。

通常情况下，我们会收集外周血进行检测。

在实际操作中，需要抗凝剂进行处理，避免血液凝固，从而保证细胞的完整性。

2. 抗体染色标本处理完成后，接下来是抗体染色。

我们会选择特定的单克隆或多克隆抗体，将其与待检测的淋巴细胞结合。

这些抗体会携带着荧光标记，通过激光的激发，可以将淋巴细胞亚群进行精准识别。

3. 流式细胞分析染色完成后，样本会被注入到流式细胞仪中，通过激光的激发和散射光的检测，可以将不同淋巴细胞亚群进行高效、高速的分析。

在这一步骤中，流式细胞仪会根据荧光信号的强度和特异性来对淋巴细胞进行分类和计数。

4. 数据分析通过计算机对流式细胞仪获取的数据进行分析和解读，我们可以得到淋巴细胞亚群的比例、数量和表达特征等信息，从而更好地了解免疫系统的状态和功能。

**二、流式细胞术检测淋巴细胞亚群的注意事项**1. 样本保存在进行流式细胞术之前，我们需要认真保存样本，避免细胞的损伤和变性。

通常情况下，标本需要在4摄氏度下保存，并尽快进行检测，避免细胞的失活和降解。

2. 抗体选择在进行抗体染色时，需要根据实际情况选择合适的抗体，保证其对于待检测的淋巴细胞具有高度的特异性和亲和性。

还需要注意避免抗体的交叉反应，以免对结果的准确性造成影响。

3. 仪器校准流式细胞仪作为检测设备，需要定期进行校准和质控。

小鼠t 细胞亚分群流式1️⃣ 引言：T细胞亚群的重要性在免疫学研究中，T细胞作为适应性免疫系统的重要组成部分，扮演着至关重要的角色。

它们不仅参与细胞免疫应答，还在体液免疫中发挥着调节作用。

小鼠作为生物医学研究的常用模型动物，其T细胞亚群的研究对于理解免疫机制、疾病发生发展及免疫治疗策略具有重要意义。

流式细胞术（Flow Cytometry）作为一种高效、多参数的细胞分析技术，已成为研究小鼠T细胞亚群不可或缺的工具。

2️⃣ 小鼠T细胞亚群概述小鼠T细胞主要分为两大类：CD4+ T细胞和CD8+ T细胞。

这两类T细胞在免疫应答中承担着不同的功能。

CD4+ T细胞主要负责辅助B细胞产生抗体，参与体液免疫，并可通过分泌细胞因子调节其他免疫细胞的功能。

而CD8+ T细胞则主要执行细胞毒性功能，直接杀伤被病毒感染的细胞或肿瘤细胞。

此外，根据功能的不同，CD4+ T细胞还可进一步细分为Th1、Th2、Th17和Treg等亚群，它们在免疫应答中发挥着不同的调节作用。

3️⃣ 流式细胞术在小鼠T细胞亚群分析中的应用流式细胞术通过标记细胞表面的特异性抗原或细胞内的分子，利用激光激发荧光染料发出的光信号，对细胞进行多参数、高通量的分析。

在小鼠T细胞亚群分析中，流式细胞术具有以下优势：多参数分析：可以同时检测多个细胞表面标志和细胞内分子，如CD4、CD8、CD25、Foxp3、IFNγ、IL4等，从而准确区分不同的T细胞亚群。

高通量：能够在短时间内处理大量样本，提高实验效率。

敏感性高：能够检测到极低浓度的细胞亚群，有助于发现稀有细胞类型。

功能分析：通过刺激细胞后检测细胞因子分泌等，可以进一步分析T细胞的功能状态。

在具体操作中，首先需要对小鼠的脾脏、淋巴结或外周血等组织进行细胞分离和纯化，然后使用特异性抗体对细胞进行标记。

接下来，将标记后的细胞通过流式细胞仪进行检测，根据荧光信号的强度和波长，对细胞进行分群和定量分析。

最后，利用流式细胞术软件对数据进行处理和分析，得到各T细胞亚群的比例和功能状态。

如何运用流式细胞仪进行T淋巴细胞亚群分析流式细胞技术(FCM)是70年代发展起来得一种快速对单细胞定量分析的新技术,它借鉴了荧光显微镜技术,同时利用与荧光染料,激光技术,单抗技术以及计算机技术的发展,将荧光显微镜的激发光源改为激光,使之具有更好的单色性与激发效率,因而大大提高了检测灵敏度,同时将固定的标本台改为流动的单细胞悬液,用计算机进行数据处理,因而大大提高了检测速度与统计精确性,而且从同一个细胞中可以同时测得多种参数,为生物医学与临床检验学发展提供了一个全新的视角和强有力的手段.目前,该技术已经广泛用于基础研究与临床应用,在免疫学,遗传学,血液学,肿瘤学等领域内发挥前重要的作用.本文着重介绍流式细胞仪基本原理及其在临床上的应用.基本原理：流式细胞仪（flow cytometer）是一种能够探测和计数以单细胞液体流形式穿过激光束的细胞检测装置，由于在检测中使用的细胞标志示踪物质为荧光标记物，因此，用来分离、鉴定细胞的流式细胞仪有被称为荧光激活细胞分类仪（fluorescence activated cell sorter,FACS）,是分离和鉴定细胞群及亚群的一种强而有力的应用工具。

其原理是在一组混合的细胞群中，加入特异的针对特定靶细胞表面分子的荧光标记单克隆抗体，这种特异单克隆抗体与其对应的抗原靶分子结合，结合后的荧光标记抗体停留在特定细胞的表面，称为荧光抗体标记的靶细胞；将含有被标记细胞的混合细胞群混悬在一定容积的上样缓冲液中，再通过FACS的进样吸管孔，仪器就会将细胞悬液制成以单细胞排列的微细流束。

当每一个细胞通过仪器的激光束照射时，带在细胞上的荧光就会被相应的激光束激活并发出对应的荧光，通过敏感的光电倍增管即可检测到从细胞表面发出的荧光。

根据测得的散射光（scattered light ）可得到细胞大小及颗粒状态的信息；而从荧光的发射强度(fluorescence emissions)则提供了结合在细胞上的抗体信息，进而也被反映了该细胞表面相应分子的表达情况。

雌雄小鼠胸腺和脾脏的免疫比较郑国强;刘安军;滕安国;郑捷【摘要】[目的]探讨雌雄小鼠之间存在的免疫差异.[方法]以8周龄的雌雄小鼠为研究对象,测量雌雄小鼠的胸腺和脾脏质量及其脏器指数的大小;通过HE染色观察雌雄小鼠胸腺和脾脏的组织形态学变化;利用流式细胞术分析胸腺和脾脏中CD3、CD4、CD8和CD19各淋巴细胞的百分含量.[结果]雌性小鼠的胸腺质量和胸腺指数均大于雄性小鼠(P<0.05);雌性小鼠的脾小体的形态结构比雄性小鼠更完整;雌性小鼠胸腺的CD4(+)CD8(+)双阳性细胞百分含量高于雄性小鼠(P<0.01),CD4(-)CD8(-)双阴性细胞百分含量低于雄性小鼠(P<0.05),CD4(+)和CD8(+)单阳性细胞百分含量明显低于雄性小鼠(P<0.01),[结论]雌雄小鼠之间存在着免疫差异,特别是胸腺方面差异更明显.%[ Objective ] The experiment was conducted to explore the immune differences between male and female mice. [ Method ] Taking eight weeks old female and male mice as study object, the weight and index of thymus and spleen were measured. HE staining and flow cytome-try were performed to observe histomorphological changes and the percentage of CD3,CD4,CD8 and CD19 lymphocytes. [Result] The results showed that the weight and index of thymus of female mice were significantly larger than that of male mice ( P < 0.05 ). The morphology structure of spleen in female mice was more complete than that in male mice. The percentages of CD4+ CD8+ in the thymus in female mice were higher than that in male mice ( P < 0.01). The percentages of CD4+ CD8+ cell in male mice were fairly fewer than that in male mice (P < 0.05 ). The percentages of single lymphocyte CD4+ CD8+ cell in male femice wasobviously lower than that in the female mice ( P < 0.01). [Conclusion] There were immune differences between male and female mice,and especially the differences in thymus aspects were more apparent.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)016【总页数】3页(P9743-9745)【关键词】雌雄小鼠;胸腺;脾脏;免疫差异【作者】郑国强;刘安军;滕安国;郑捷【作者单位】天津科技大学食品工程与生物技术学院生物资源与功能食品研究室,天津,300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院生物资源与功能食品研究室,天津,300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院生物资源与功能食品研究室,天津,300457;天津科技大学食品工程与生物技术学院生物资源与功能食品研究室,天津,300457【正文语种】中文【中图分类】S632.3胸腺作为首要的中枢免疫器官，它是T细胞分化、发育、成熟的场所，在免疫系统中发挥着重要作用。

㊃短篇论著㊃温度㊁时间及抗凝剂对流式细胞术检测T淋巴细胞亚群的影响*任方刚1,张娜2,徐智芳1,张耀方1,张亚东3,覃艳红1,陈秀花1,王宏伟1ә(1.山西医科大学第二医院血液病分子诊疗山西省重点实验室,山西太原030001;2.山西医科大学第二医院检验科,山西太原030001;3.运城市第三医院检验科,山西运城044000)摘要:目的探讨流式细胞术检测T淋巴细胞亚群的理想温度,时间及抗凝剂㊂方法随机采集健康志愿者全血6份,分别用不同的抗凝剂抗凝,4ħ及室温(18~25ħ)保存,在不同时间点(0.5h㊁2h㊁5h㊁24h㊁36 h㊁48h及72h)分别使用荧光抗体标记,后上机检测;对同一份标本平行标记后,平分放于4ħ及室温,在不同的时间节点(0.5h㊁1h㊁3h㊁5h㊁7h㊁24h)检测C D3+T淋巴细胞㊁C D3+C D4+辅助性T细胞㊁C D3+C D8+杀伤性T细胞的阳性率及荧光强度㊂结果1h内上机检测,枸橼酸钠㊁肝素㊁乙二胺四乙酸,三者抗凝剂,避光与否,孵育温度(室温&37ħ)等因素对检测结果均没有明显影响;与E D T A抗凝,室温避光标记,40m i n内上机检测结果比较,标本室温保存时,C D3+T淋巴细胞和C D3+C D4+辅助性T细胞在48h时检测结果出现变化,而C D3+C D8+杀伤性T细胞在72h时出现变化;标本存放与4ħ,C D3+T淋巴细胞和C D3+C D8+辅助性T 细胞在2h时检测结果出现变化,而C D3+C D4+杀伤性T细胞在5小时时检测结果出现变化㊂标记后,无论标本存于室温还是4ħ,C D3+T淋巴细胞和C D3+C D4+辅助性T细胞在24小时时结果出现变化,而C D3+ C D8+杀伤性T细胞在1小时时就发生了变化㊂结论1小时内上机检测,抗凝剂,避光与否,孵育温度对检测结果无明显影响;抗凝标本应在室温保存,48h内完成检测;标记后标本应在1h内上机检测㊂关键词:流式细胞术;T淋巴细胞亚群;温度;时间;抗凝剂流式细胞术是一种集免疫学技术,单克隆抗体技术和计算机技术等技术为一体的实验室技术,是目前主要的微小残留病变监测的手段[1-2]T细胞亚群检测则是最常规的检测项目之一,而对于流式细胞术的质量控制却比较困难,除基本的每日f l o w-c h e c k校验光路,一定时间内地质控全血检测评价机器状态,定期的人员培训外,标本的预处理在质控环节中具有举足轻重的作用[3],特别是随着第三方检验实验室的日益增多,标本预处理在质控中的影响比重更加明显,如标本运送与储藏㊁标本质量㊁机器偶发故障等,均有可能导致流式检测结果的偏差或错误,因此,探讨科学规范的抗凝剂,标本保存温度和标记时间等标本处理规范有现实意义㊂1资料与方法1.1一般资料抽取空腹12h健康志愿者(即肝功能㊁肾功能㊁血脂㊁血糖㊁尿酸正常,血㊁尿㊁粪便常规正常,乙肝表面抗原阴性及体格检查正常者)外周静脉血,分为三份,分别使用乙二胺四乙酸二钾(E D T A-K2)㊁肝素和枸橼酸钠抗凝,其中男2例,女4例,年龄为24~28岁,中位年龄26岁㊂E D T A-K2抗凝静脉血均分两份,分别置于室温(18~26ħ)及4ħ保存,迅速进行预处理,平行标记标本后均分为处理3份,分别避光及不避光室温孵育和37ħ孵育,控制0.5h 内上机检测;3种不同抗凝标本进行平行避光标记处理,上机检测;分别对均分存放于室温(18~26ħ)及4ħ的E D T A-K2抗凝标本在2㊁5㊁24㊁36㊁48㊁72h等时间节点进行标记检测;E D T A-K2抗凝标本1h内标记处理完毕标本,均分为2份,分别至于室温(18~ 26ħ)及4ħ保存,在1㊁3㊁5㊁7㊁24h等时间节点进行上机检测,以上检测结果均与同一标本E D T A-K2抗凝,避光室温标记,0.5h上机检测标本的检测结果进行对比分析㊂1.2仪器试剂取12*75mm普通流式管,分别加入组合抗体C D45-F I T C/C D4-P E/C D8-E C D/C D3-P C5(B e c k m a n C o u l t e r美国,规格:50T,m o u s e I g G2b/I g G1/I g G1/I g G1)和C D45-F I T C/C D56-P E/ C D19-E C D/C D3-P C75(B e c k m a n C o u l t e r美国,规格: 50T,m o u s e I g G2b/I g G1/I g G1/I g G1),每种抗体各5μL,取抗凝全血各30μL分别加入各管,室温避光孵育15m i n,用o p t i l y s e C N O-w a s h l y s i n g s o l u t i o n (编号:A11895,B e c k m a n c o u l t e r美国)溶血试剂,裂解红细胞,10m i n后,用C y t o m i c s F C500流式细胞仪检测,使用C X P软件分析,S S C/C D45设门,获取10 000个淋巴细胞,分析淋巴细胞中各亚群的比例㊂1.3方法为保证实验结果的科学性,检测由同一名具有流式细胞仪操作培训资格认证的操作人员完㊃181㊃国际检验医学杂志2019年第40卷ZⅡ*基金项目:国家自然科学基金项目(81679126)㊂ә通信作者,E-m a i l:w a n g h w68@h o t m a i l.c o m㊂成,具体方法参照文献[3-4]㊂1.4统计学处理采用G r a p h p a d P r i s m5软件进行统计学分析㊂将3种抗凝剂㊁避光与否㊁不同储存条件下的标本及标记后标本的各个时间点的检测结果,分别同同一标本E D T A-K2抗凝,避光室温标记,0.5h 上机检测结果,若方差齐,进行配对t检验,否则进行非参数统计方法分析,P<0.05时认为有显著性差异㊂2结果2.1不同抗凝剂对分析结果的影响在1h内,对3种不同的抗凝剂抗凝的健康志愿者外周血标本,在平行实验条件下,对检测结果进行两两对比统计学分析,未发现明显差异(P>0.05)㊂2.2避光与否对分析结果的影响对同一份E D T A 抗凝全血标本置于两流式管,进行平行标记,一份避光孵育,一份不避光孵育,后于1h内上机检测,结果对比分析发现,无论是阳性细胞百分率还是平均荧光强度(M F I),两者之间均没有统计学差异(P>0.05)㊂2.3标本存放时间对检测结果的影响在不同的时间节点对标本进行检测发现,无论是室温还是4ħ保存标本,C D4和C D8分子的检测结果均在48h时出现显著性差异(室温:P=0.0085和P=0.0150,4ħ:P=0.0046和P=0.0174),而C D8分子则在2 h时就出现了显著性变化(室温:P=0.0109,4ħ: P=0.0013)㊂2.4标记后存放时间对检测结果的影响 E D T A抗凝标本,平行标记,避光孵育后,均分置于室温和4ħ,在不同的时间节点进行检测发现,在不同的存储条件下,C D4和C D3的检测结果,在24h内未出现显著性变化(P>0.05),而C D8的检测结果在1h时就出现了显著性变化(P<0.05)㊂3讨论流式细胞术以免疫学为基础,结合计算机㊁激光和光电转换等技术,用于对不同大小和荧光特征的细胞㊁细菌㊁囊泡等微粒进行快速定性及定量分析的一种技术,是临床诊断,预后评估的有用工具[1,5]㊂依据表面抗原的差异,可将T淋巴细胞分为细胞毒性C D8+T细胞㊁辅助性C D4+T细胞和调节/抑制性T细胞㊂作为T细胞表面受体的重要辅受体的C D4和C D8分子,能够特异性识别机体细胞的MH C,参与抗原递呈,与机体免疫防御功能密切相关[6-7],C D4+T细胞和C D8+T淋巴细胞的变化情况常被用来评价候选疫苗的免疫保护性以及监测疾病病情的发生㊁发展和转归[8-12],因此,国内使用流式细胞术对外周学淋巴细胞亚型进行分析,是临床最常见的项目之一㊂对于流式细胞术的质量控制的相关研究已有报道[4,13],然而国内关于标本的抗凝剂选择,标本的存储环境等报道较少㊂陈潇等建议各实验室应当以E D-T A-K2抗凝为宜,以18ħ的室温保存效果最好,3d 内检验结果与采集后1h内检验的结果差异无统计学意义[3-4]㊂本研究却发现,与0.5h内上机检测的E D-T A抗凝避光室温孵育的标本比较,3种临床常用的抗凝剂抗凝㊁避光与否㊁孵育温度等因素均对检测结果未发现明显影响,这可能和单克隆抗体及荧光偶联技术的不断优化和进步㊁复合型去红细胞试剂中所含细胞固定剂的使用有关㊂室温保存标本C D4+T和C D8+T细胞在48h时发生了显著性变化,而C D3+T细胞在72h时发生了变化,然而在4ħ保存标本时,C D8+T和C D3+T细胞在2h时发生了显著性变化,而C D4+T的检测结果在5h时也发生了变化,同时,我们还检测了C D4+T 的M F I,也得出了同样的结果,因此我们认为,标本应该储存于室温而不是4ħ,这与文献报道一致,而标本应于48h内检测完毕,而不是72h,这与文献报道不同[3]㊂机器的突发故障,人员的突发离岗等将会导致标记后的标本不能及时上机检测,因此标记后标本的储存条件及时效性,是实验室要关注的问题㊂本研究通过把E D T A抗凝标本,平行标记处理后,分别放于室温及4ħ,在不同的时间节点进行检测,结果与室温放置0.5h内上机检测结果进行对比,发现无论是室温与4ħ,C D4+T和C D3+T细胞的检测结果在24h 时发生了显著性变化,而C D8+T在1h时就发生了变化,未发现4ħ保存优于室温保存,这与文献不同[14]㊂标记标本能保持稳定,可能与溶血素中含有多聚甲醛(p a r a f o r m a l d e h y d e,P F A)成份的作用,这与文献报道一致[14-15],而C D8+T细胞的检测值在标记后很快就发生了变化,其机制还需要进一步探讨㊂本研究所用单克隆抗体均为荧光素-抗体直接藕联模式,而对于非荧光素直接偶联的单克隆抗体或复合抗体处理等标本,其结论如何,需要进一步研究㊂总之,对于使用流式细胞术检测外周血T细胞亚群,在0.5h内上机检测,3种常用抗凝剂抗凝㊁避光与否㊁孵育温度(室温&37ħ)㊁均对检测结果无明显影响,标本应储存于室温,并于48h内处理,标记后标本应储存于4ħ,C D4+T和C D3+T细胞的检测在24h时完成,C D8+T细胞检测在1h内完成㊂4结论利用流式细胞术检测T淋巴细胞亚群时,在1小时内上机检测,结果不受抗凝剂,避光与否,孵育温度等因素等影响;抗凝标本应在室温保存,48h内完成检测;标记后标本应在1h内上机检测,本研究结论仅局限于外周血T淋巴细胞亚群的检测,和相关文献有㊃281㊃国际检验医学杂志2019年第40卷ZⅡ相同也有差异的地方,也提示各实验室应建立自己实验室的流式细胞术S O P ,以保证流式细胞术结果的客观准确㊂参考文献[1]K e r s t G ,K r e y e n b e r g H ,R o t h C ,e t a l .C o n c u r r e n t d e t e c -t i o n o f m i n i m a l r e s i d u a l d i s e a s e (M R D )i n c h i l d h o o d a -c u t e l y m p h o b l a s t i c l e u k a e m i a b y f l o w c y t o m e t r y a n d r e s l -t i m e P C R [J ].B r J H a e m a t o l ,2005,128(6):774-782.[2]赵书涛,武晓东,王策,等.流式细胞仪的原理㊁应用及最新进展[J ].现代生物医学进展,2011,11(22):4378-4381.[3]陈潇,吴丽娟.抗凝剂㊁标本保存温度和保存时间对流式T 淋巴细胞亚群检测的影响[J ].国际检验医学杂志,2012,33(2):146-150.[4]吴丽娟,许东升.流式细胞术表型分析的质量控制[J ].中华检验医学杂志,2011,34(5):389-394.[5]B r e n k e r K ,O s t h o f K ,Y a n g J,e t a l .L E D t h e r m o f l o w -c o m b i n i n g o p t o g e n e t i c s w i t h f l o w c y t o m e t r y [J ].J V i s E x p,2016(118):e 54707.[6]L i X L ,T e n g M K ,R e i n h e r z E L ,e t a l .S t r i c t m a jo r h i s t o -c o m p a t i b i l i t y c o m p l e x m o l e c u l e c l a s s -s p e c i f i c b i n d i n g b yc o -r e c e p t o r s e n f o r c e s MH C -r e s t r i c t ed αβT C R r e c o g n i t i o n d u r i n g T l i n e a ge s u b s e t c o mm i t m e n t [J ].F r o n t I mm u n o l ,2013,34(4):383.[7]R o c h a -P e r u g i n i V ,S án c h e z -M a d r i d F ,M a r t ín e z D e l H o yo G.F u n c t i o n a n d d y n a m i c s o f t e t r a s p a n i n s d u r i n g a n t i ge n r e c o g n i t i o n a n d i mm u n o l o g i c a l s y n a ps e f o r m a t i o n [J ].F r o n t I mm u n o l ,2016,38(6):653.[8]W u D ,W e i S ,L i u B ,e t a l .E f f e c t o f i mm u n e s u p pr e s s i o n o n m e t a s t a s i s i n a p a t i e n t w i t h h e pa t o c e l l u l a r c a r c i n o m a m e t a s t a s i z e d t o t h e c o l o n a n d s t o m a c h :A c a s e r e po r t [J ].E x p Th e r M e d ,2016,5(11):1741-1747.[9]F a j a r d o E ,M e t c a l f C ,M b o f a n a E ,e t a l .O p po r t u n i t i e s t o i m p r o v e s t o r a g e a n d t r a n s p o r t a t i o n o f b l o o d s p e c i m e n s f o r C D 4t e s t i n g i n a r u r a l d i s t r i c t i n Z i m b a b w e u s i n g BD v a c u t a i n e r C D 4s t a b i l i z a t i o n t u b e s :a s t a b i l i t y a n d d i a g-n o s t i c a c c u r a c y s t u d y [J ].B M C I n f e c t D i s ,2014,14(5):553.[10]P l a t t e e l A C ,M a r i t d e G r o o t A ,K e l l e r C ,e t a l .S t r a t e gi e s t o e n h a n c e i mm u n o g e n i c i t y of c D N A v a c c i n e e n c o d e d a n -t ig e n s b y m o d u l a t i o n o f a n t i g e n p r o c e s s i n g [J ].V a c c i n e ,2016,34(42):5132-5140.[11]I m S J ,H a s h i m o t o M ,G e r n e r M Y ,e t a l .D e f i n i n g CD 8+T c e l l s t h a t p r o v i d e t h e p r o l i f e r a t i v e b u r s t a f t e r P D -1t h e r a p y[J ].N a t u r e ,2016,537(7620):417-421.[12]Y e k C ,G i a n e l l a S ,P l a n a M ,e t a l .S t a n d a r d v a c c i n e s i n -c r e a s e H I V -1t r a n s c r i p t i o n d u r i n g a n t i r e t r o v i r a l t h e r a p y[J ].A I D S ,2016,30(15):2289-2298.[13]宋建新,朱红艳,蒋雅先,甸自金.骨髓标本放置时间对流式细胞术白血病免疫分型检测结果的影响[J ].国际检验医学杂志,2012,32(3):391-392.[14]J a l l a S ,S a z a w a l S ,D e b S ,e t a l .E n u m e r a t i o n o f l y m ph o -c y t e s u b s e t s u s i n g f l o w c y t o m e t r y :E f f e c t o f s t o r a ge b e -f o r e a n d a f t e r s t a i n i ng i n a d e v e l o p i n g c o u n t r y s e t t i n g [J ].I n d i a n J C l i n B i o ch e m ,2004,19(1):95-99.[15]郭海婷,胡超,,严普,等.多聚甲醛处理的昆明小鼠T 细胞及其亚群存放不同时间分析[J ].细胞与分子免疫学杂志,2017,33(4):460-464.㊃短篇论著㊃肿瘤恶液质患者血清P T H r P ㊁C R P ㊁A l b ㊁H b㊁C a 的表达水平及临床价值探讨*刘 洋,刘慧莹,李袁飞ә(山西医科大学第一医院肿瘤科,太原030000) 摘 要:目的 探讨血清甲状旁腺激素相关蛋白(P T H r P )㊁C 反应蛋白(C R P )㊁血红蛋白(H b )㊁白蛋白(A l b )㊁钙(C a)在癌症患者中的水平变化及临床意义,为肿瘤恶液质的临床诊疗提供一定的参考依据㊂方法 将入选的癌症患者根据国际恶液质诊断标准分组,分为A 组(恶液质组)和B 组(非恶液质组),设定健康对照者为C 组,采用酶联免疫法(E L I S A 法)检测癌症患者及健康对照者血清P T H r P ㊁C R P 的浓度水平,采用标准方法测定血清H b ㊁A l b ㊁C a 水平,收集并随访患者体重变化,进行差异及相关性分析㊂结果 A 组㊁B 组和C 组血清P T H r P ㊁C R P ㊁H b ㊁A l b ㊁C a 的浓度水平各组间比较差异具有统计学意义(P <0.05);癌症患者血清P T H r P 与C R P ㊁C a 之间存在明显的正相关(r =0.822,P <0.01;r =0.756,P <0.01),P T H r P 与H b ㊁A L b 之间存在明显的负相关(r =-0.800,P <0.01;r =-0.842,P <0.01),尤其体现在恶液质组中;不同肿瘤类型患者血清P T H r P 水平差异无统计学意义(P >0.05),体重丢失百分比(W L %)差异有统计学意义(P <0.01);不同癌症分期患者血清P T H r P 水平差异有统计学意义(P <0.05),W L %差异无统计学意义(P >0.05);多重线性回归㊃381㊃国际检验医学杂志2019年第40卷Z Ⅱ*基金项目:山西省卫生厅科研课题计划项目(201301062)㊂ә通信作者,E -m a i l :740897607@q q.c o m ㊂。

小鼠巨噬细胞流式标记你知道小鼠巨噬细胞吗？说起这个，可能大多数人都会一头雾水。

别急，今天我们就来聊聊这个看起来很高大上的话题。

简单说，小鼠巨噬细胞就是在小鼠体内担任“垃圾清理工”的细胞，它们负责清除细菌、病毒、坏死细胞等等，简直就是免疫系统中的超级英雄，谁敢惹它们，谁就要倒霉。

不过，我们要做的不是单纯了解它们，而是通过流式细胞术给它们“打上标签”，来更好地研究它们。

听起来有点复杂，但别担心，咱们一步一步来，包你听了就懂。

流式细胞术是什么呢？嗯，简单来说，它就像是一条高速公路，让咱们的小鼠巨噬细胞“跑”得又快又准。

这个技术能让我们以非常高的速度、非常精准地观察到每个细胞的“身份”。

不过，问题来了，怎么让我们的小鼠巨噬细胞在人群中脱颖而出呢？就得靠流式细胞术中的一种神奇的标记——抗体。

通过这些抗体，我们就能给细胞贴上“名字标签”，告诉它们，“嘿，你是巨噬细胞，你来这里就对了！”然后，再用流式细胞术快速检测出标记的细胞，从而准确判断它们的数量、大小和状态。

简直就是给细胞做身份证一样，谁不爱呢？你可能会问，标记细胞有啥好处？哎，真的是大有可为。

你想象一下，咱们要研究巨噬细胞在免疫反应中的作用，怎么知道它们到底在哪儿、做了啥呢？直接去看？那就像在茫茫人海中找一个熟人一样难。

可是有了流式细胞术加上这些抗体标记，咱们就能精准定位，轻松看到它们每一个细胞的动态。

要是想研究它们是不是有异常，或者跟其他细胞是不是有某种特殊的互动，流式细胞术的标记功能可真是帮了大忙。

简单说，就像你戴上了夜视镜，能清楚看到别人看不见的东西，精准又高效。

那你是不是觉得流式细胞术好像就像是“看电影”一样简单？它背后可有不少技术含量，光是给小鼠巨噬细胞贴上标签，咱们就得考虑到很多因素。

比如说，抗体的选择得合适，这就像你选鞋子，得选合脚的；再比如说，标记的浓度、时间等细节，每一步都需要精确控制，不然就容易“打错标签”，搞得乱七八糟的，完全不能信。

科研t细胞亚群流式分类
T 细胞是一类重要的免疫细胞，根据其表面分子和功能的不同，可以分为多个亚群。

流式细胞术是一种常用的细胞分类技术，可以通过检测细胞表面分子的表达来鉴定不同的 T 细胞亚群。

在科研中，T 细胞亚群的流式分类通常包括以下几个步骤：
1. 样本制备：从研究对象（如血液、组织等）中分离出 T 细胞，并进行适当的处理（如固定、破膜等），以便后续检测细胞表面分子的表达。

2. 抗体标记：使用荧光标记的特异性抗体，与 T 细胞表面的分子结合，以便通过流式细胞仪检测其表达。

3. 流式细胞仪检测：将标记后的 T 细胞通过流式细胞仪进行检测，根据荧光信号的强度和特征，鉴定不同的 T 细胞亚群。

4. 数据分析：对流式细胞仪检测得到的数据进行分析，通常使用专门的流式细胞术分析软件，可以根据荧光信号的强度和特征，将 T 细胞分为不同的亚群，并计算其比例和绝对数量。

通过 T 细胞亚群的流式分类，可以深入了解 T 细胞的免疫应答机制、免疫调节功能以及疾病发生发展的机制，为临床诊断和治疗提供重要的参考依据。

需要注意的是，T 细胞亚群的流式分类需要使用专业的流式细胞仪和分析软件，并需要熟练的操作技能和数据分析能力。

同时，抗体的选择和标记条件的优化也对结果的准确性和可靠性有重要影响。

人和小鼠th亚群鉴定方案
（最新版）
目录
1.引言
2.人和小鼠 th 亚群鉴定方法
3.th 亚群的分类
4.th 亚群的功能
5.应用实例
6.结论
正文
1.引言
在人类和老鼠的研究中，th 亚群的鉴定方案起着至关重要的作用。

th 亚群，全称 T helper 17 cells，是一种在免疫反应中起到关键作用的细胞亚群。

对于研究人类和老鼠的免疫系统，了解 th 亚群的鉴定方案是必不可少的。

2.人和小鼠 th 亚群鉴定方法
th 亚群的鉴定方法主要依赖于流式细胞术。

通过检测细胞表面的标志物，如 CD4、IFN-γ等，可以准确地鉴定出 th 亚群。

3.th 亚群的分类
th 亚群主要分为两类，一类是 T helper 17 cells (Th17)，另一类是 T helper 1 (Th1)。

其中，Th17 主要参与对细菌和真菌的免疫反应，而 Th1 则主要参与对病毒的免疫反应。

4.th 亚群的功能
th 亚群在免疫反应中起着关键作用。

Th17 可以产生 IL-17，这是一
种具有抗菌作用的细胞因子。

而 Th1 则可以产生 IFN-γ，这是一种具有抗病毒作用的细胞因子。

5.应用实例
th 亚群的鉴定方案在许多研究中都有应用，比如在研究免疫系统疾病、感染疾病、肿瘤等。

通过鉴定 th 亚群，可以更好地理解疾病的发生机制，从而为治疗提供新的思路。

6.结论
th 亚群的鉴定方案对于研究人类和老鼠的免疫系统有着重要的作用。