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注意事项1.以下的Protocol主要适用于（1）所使用的DNA1、反转录酶、RNA 酶抑制剂以及dNTPs均是Fermentas公司的；而在qPCR中，所使用的Supermix是Bio-RAD公司的。
2.RT-qPCR中的注意事项：（1）MgCl2的浓度2~4mM；（2）模板的浓度50ng~5pg之间；（3）引物的浓度，500nM比较合适，若反应效果不好可以在0.1~1uM之间选择；（4）退火温度的选择，首次设置比实际小5℃的，之后在1~2℃选择；（5）引物设计的时候Tm值最好在60℃附近，正反向引物的Tm的差值在1~2℃之间；（6）抽提得到的RNA，需要验证RNA的纯度，最好验证一下RNA的完整性；（7）在qPCR中，模板的体积要小于总反应体系的10%（主要是模板的加入量会影响反应体系中的MgCl2浓度）；（8）扩增曲线一定要做。
通常如果有条件也要做退火温度梯度，以获得最佳的退火温度。
另外就是，一块板子上，尽可能取尽量多的样本，而不是基因；（9）扩增效率在90~110%的范围内是可以接受的；（10）内参基因的选择，尽可能选择与靶基因处于同一信号通路中的内参基因。
3.有关引物设计（1）扩增子长度小于150bp；（2）引物Tm的理想值57~60℃；（3）3’端最后5个碱基里面G或C的含量少于三个；（4）GC含量介于20~80%，理想值40~60%；（5）避免引物二聚体及自身二级结构；（6）避免引物内的自身重复序列；4.在一个实验中不论是绝对定量还是相对定量都需要做标准曲线，做标准曲线的方法，以反转录得到的cDNA为模板，用qPCR的引物做PCR得到的产物为模板，产物先稀释10000倍，以稀释后为基底，以10为倍数，稀释7~8个梯度（稀释点越多，稀释倍数越大，数据越精确），做qPCR，然后得到标准曲线。
利用标准曲线可以验证下列因素：（1）扩增效率；扩增效率E=10-1/斜率-1（2）标准品的梯度范围；（3）PCR抑制剂的存在于影响；（4）PCR仪验证灵敏度。
Real-time qPCR 检测操作手册1/ 6一、实验概述Real-time Quantitative PCR Detecting System ，即实时荧光定量核酸扩增检测系统，也叫实时定量基因扩增荧光检测系统，简称qPCR 。
是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR 从定性到定量的飞跃。
二、实验流程三、实验材料： 1.主要试剂试剂名称 试剂来源 Cat.No. Trizol 上海普飞 3101-100 M-MLV promega M1705 dNTPs promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Bulge-LoopTM miRNA广州锐博 详见实验报告 qPCR Primer Set Rnase Inhibitor promega N2115 Primer(R&F) 上海生工 详见实验报告 SYBR Master MixtureTAKARADRR041B2/ 6样本收集Trizol 法抽取RNARNA 反转录获取cDNAReal-time qPCR2.主要器材器材名称来源Cat.NoNanodrop 分光光度计Thermo 2000/2000C稳压电泳仪上海天能EPS-600超细匀浆机FLUKO公司F6/10Real time PCR 仪器Agilent公司MX3000p反转录耗材Axygen四、实验步骤：1.总RNA 抽提（1）收取样品，Trizol 裂解。
细胞样品：收集细胞（6 孔板 80%细胞密度），2000 rpm 离心5min，去上清，细胞沉淀中加入1mL Trizol，充分混匀后室温静置 5 min，然后转移至新的 1.5 mL EP 管中；组织样品：将待研磨的组织样品从液氮或者-80℃冰箱中取出，无菌刀片于干冰上将组织样品切割成约 3 mm×3 mm×3 mm 大小，置于装有 1 mL Trizol 裂解液的 1.5mL EP 管中。
实时荧光定量PCR技术详解和总结
一、什么是实时荧光定量PCR
实时荧光定量PCR（Real-Time Quantitative Polymerase Chain Reaction，简称RT-qPCR）是一种PCR扩增技术，具有灵敏度高、重复性好等特点，可以在实时监测PCR扩增过程中特定片段DNA的产生。
它可以用来检测细胞中其中一特定基因mRNA的表达水平，从而揭示基因活动和表达情况，同时用于特定基因检测，如非病毒性疾病的病原检测以及芯片高通量分析等。
二、实时荧光定量PCR的基本原理
实时荧光定量PCR其基本原理就是利用PCR技术，在特定温度、适当时间内，将少量的模板 DNA 放大成数十亿倍以上。
实时荧光定量PCR的一大特点就是，它能够在实时监测PCR的扩增过程中，随时得知扩增物（amplicon）的数量。
根据扩增的量，从而确定所检测样本中的特定片段DNA的数量，即“定量”。
实时荧光定量PCR可实现定量检测，是因为它引入了一种特殊的参考基因，即“内参基因”，其用来抵消PCR条件、酶种类、反应液等的影响，从而测定量结果的准确性。
三、实时荧光定量PCR的实验步骤
（一）模板提取和核酸纯化：根据实验材料，提取DNA或RNA模板，进行核酸纯化，获得纯度较高的核酸。
（二）制备PCR反应液：制备由dNTPs、PCR酶、聚合酶等试剂组成的PCR反应液，根据所要检测的基因。
TECHNICAL MANUAL Real-time qPCR Technical Manual手把手教你从菜鸟到高手的学习手册Molecular Biology目录前言3 RT-PCR发展史3 RT-PCR概述3 RT-PCR实验设计8 RT-PCR操作流程9 RT-PCR数据分析16 RT-PCR问题分析19前言由于Real-time qPCR的众多优点，现在已经是生命科学领域的一项常规技术。
越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验，也基本上被Real-time qPCR所代替。
由于Real-time qPCR输出的数据不同于常规的PCR电泳检测，很多没有做过Real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。
本文就从Real-time qPCR的发展史说起，包括Real-time qPCR的原理，实验设计，实际操作（以ABI StepOne仪器，和北京吉康医学科技有限公司的试剂为例），数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解Real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！Real-time qPCR发展史Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。
由于常规的PCR的缺点，Real-time qPCR由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。
设在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP检测，等位基因的检测，药物开发，临床诊断，转基因研究等。
在Real-time qPCR技术的发展过程中，定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。
1995年，美国PE公司（已经并入Invitrogen公司）成功研制了Taqman®技术，1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统，通过检测每个循环的荧光强度，通过Ct值进行数据分析。
实时荧光定量PCR操作指南实时荧光定量聚合酶链反应（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）是一种常用的分子生物学技术，广泛应用于基因表达、病毒检测、疾病诊断等领域。
本文将为您提供一份详细的实时荧光定量PCR操作指南，以帮助您正确高效地进行实验。
一、前期准备1.仪器准备确保实时荧光定量PCR仪的工作状态正常，能够提供稳定的温控和荧光检测功能。
2.试剂准备准备好使用的引物和探针、反转录酶、核酸模板、PCR酶、荧光探针等试剂，并按照相关说明进行稀释和储存。
3.实验室操作保持实验室环境清洁整洁，确保试剂和样品不受外界污染。
佩戴实验手套和口罩，避免DNA污染。
二、PCR体系设置根据您的实验目的和试剂系统的要求，设置PCR反应的体积和组分。
1.配置PCR体系a.将反向转录试剂盒中的试剂按照说明书中的比例进行配置，包括引物、探针、反转录酶、核酸模板等。
b.添加核酸模板到体系中，确保模板的质量和浓度适合实验要求。
c.添加合适的PCR酶，如Taq DNA聚合酶、Platinum Taq DNA聚合酶等。
d.添加稀释的胶原酶。
2.装管设置a.在无菌条件下，将PCR反应体系分装至PCR管中。
b.避免气泡的产生，确保体系均匀混合。
三、PCR参数设置根据实验需求和试剂系统的建议，设置PCR反应的温度和时间参数。
1.反转录步骤a.按照试剂盒说明书的建议，设置反转录温度和时间。
常见的反转录参数为42℃，60分钟。
2.PCR扩增步骤a.设置初始变性温度和时间。
常见的初始变性参数为95℃，5分钟。
b.设置PCR循环数和每个循环的温度和时间。
常见的PCR循环参数为95℃，15秒；60℃，1分钟，共40个循环。
c.设置荧光检测温度和时间。
根据荧光探针的特性，设置合适的温度和时间窗口。
四、数据分析和结果解读1.数据采集实时荧光定量PCR仪会自动记录荧光信号和温度变化数据，确保您保存这些数据供后续分析和结果解读使用。
1.SYBR Green使用浓度：太高抑制Taq酶活性，太低，荧光信号太弱。
2.引物特异性高，否则扩增有杂带。
3.反应温度和时间，根据酶和引物决定。
4.其他与常规PCR相同。
noise band建议刚好越过实验中设置的阴性孔。
不同的基因不需要相同的阈值，但是每块板上同一对引物扩增的基因使用相同的阈值。
横坐标：扩增循环数纵坐标：荧光强度每个循环进行一次荧光信号收集荧光信号阈值：前15个循环信号作为荧光本地信号baseline，即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。
荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
Ct:PCR扩增过程中，扩增产物的荧光值达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
Ct值极具重现性。
定量时多取15-35较好。
1.dye kit：roche lightcycle 480 sybr green 1 masterKit中小瓶：Master 2x, 储存于-20℃，避光，避免反复冻融，使用前上下颠倒混匀，避免气泡，不能震荡Water，PCR grade储存于-20℃配制好的PCR反应液，可于室温稳定保持24h，需避光。
2.template：在20μl体系中，说明书中推荐20ng纯化的cDNA，50-100ng genomic DNA，108拷贝plasmid DNA。
根据以往经验，150-200ng cDNA（也许未纯化）为佳。
模板太多，会影响荧光发光。
如果模板不纯，则模板量不能超过2μl，预变性时间改为10min，可降低模板中杂质的影响。
3.primer：最终工作浓度为0.2-1μM, 推荐0.5μM。
引物浓度的原则是，达到目标荧光浓度时，最低引物浓度，导致最低crossing points，Cp值。
4.products: 产物长度最好不超过500bp5. system✧配制体系时，不能触摸PCR板的上表面以及封口膜，戴手套✧Master mix避光✧冰上加样✧准备好混合样品后，吹打混匀，不能震荡20μlMaster mix 10F（10μM）1（0.5μM）R（10μM）1（0.5μM）Template 1（150ng）DDW PCR grade 76.program：Incubation 95℃ 5min or 10min Amplification 95℃ 10s55-60℃（选58℃），5-20s（选20s）72℃5-30s（选30s）40 or 45 cyclesMelting Curve 95℃ 5s，65℃1min，97℃Cooling 40℃ 10s。
实时荧光定量PCR操作步骤以下实验步骤仅供参考：1 样品RNA的抽提①取冻存已裂解的细胞，室温放臵5分钟使其完全溶解。
②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。
手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。
4℃下12000rpm离心15分钟。
离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
RNA全部被分配于水相中。
水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。
加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。
此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%O配制），清洗RNA沉淀。
混匀后，4℃下7000rpm离心乙醇（75%乙醇用DEPCH25分钟。
⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
2 RNA质量检测1）紫外吸收法测定先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。
然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。
①浓度测定A260下读值为1表示40 µg RNA/ml。
样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 µg/ml。
具体计算如下：RNA溶于40 µl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495µl的TE中，测得A260 = 0.21RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 µl，剩余RNA总量为：35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg②纯度检测RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
实时荧光定量PCR（RT-qPCR）完全手册
所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
RT-qPCR是由三个步骤组成 RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint)
关键词：荧光实时实时荧光定量PCRRT-qPCRRT-PCR反转录定量PCRQRT-PCR
方法简介
所谓的实时荧光定量PCR就是通过对PCR 扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测从而实现对起始模板定量及定性的分析。
在实时荧光定量PCR反应中，引入了一种荧光化学物质，随着PCR 反应的进行，PCR 反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。
每经过一个循环，收集一个荧光强度信号，这样我们就可以通过荧光强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光扩增曲线。
RT-qPCR是由三个步骤组成:
1.反转录:依赖反转录酶将RNA反转录成cDNDA;
2. 扩增:用PCR的方法扩增cDNA;
3.检测:实时检测和定量扩增的产物.
RT-qRCR影响分析可靠性关键点(Key porint):
1.分析结果依赖于模板的数量、质量以及合理的检测方法设计
2.反转录反应的非标准化影响试验的稳定性
3.数据分析应该高度客观，如果不合理的分析，从分析结果中会得到混淆的错误结果，因此通过对RT-qPCR的每一组分进行质量评价以达到最小化变异性，最大化可重复性，而且还需要沿用一个通用的数据分析的指南。
对基因表达分析的标准化的需要是与人类临床诊断分析相适应的。
存在的问题
由于各个学术团体和科研机构使用不同的操作流程，必然导致大家使用不同定量的来源物以及数据分析：
1.新鲜、冰冻、甲醛固定的样品
2.整个组织样本，显微切割样本，单个细胞，组培细胞
3.总RNA或者mRNA
4.RNA反转录成cDNA的不同的引发策略
5.不同的酶以及酶的不同组合
6.变异系数、灵敏度
7. 多类型的检测化学方法，反应的条件，热循环仪的分析以及汇报方式。
8.每一步骤缺乏标准化分析流程造成了在样品的处理，内参的使用，归一化的方法，质量控制等等因素严重影响RT-qPCR的可信度，重复性。
RNA 质量评价
现在RNA 定量的程序很多。
最近EMBO qPCR course (http://www-db.embl.de/jss/Embl GroupsOrg/conf_28) 比较了用Ribogreen, Agilent BioAnalyser, spectrophotometer,Nan odrop and the BioRad Experion 来定量同样的样品。
结果显示没有哪两种方法得到同样
的分析数据。
所以用不同的方法进行定量是不明智的。
因此，我们需要用统一套定量分析方法来完成所有RNA样品的评价。
RNA 质量
RNA 质量主要包括RNA的纯度（没有蛋白质和DNA的污染）以及完整性。
传统的RNA 质量的评价通过分析A260/A280的比值或者对琼脂糖凝胶电泳rRNA的条带的分析。
Agil ent Bioanalyser/BioRad Experion 微流体毛细电泳系统也是一种较新的分析方法。
Agilent 的2100也是一种十分好的分析RNA质量的方法，它通过分析18S以及28S rRNA的分析图谱，通过图谱来反应RNA的量和完整性，其完整性通过完整性系数（RIN）来反应。
样品的RINs在10-4之间。
10代表完整的RNA，4代表没有完整的rRNA带。
由于以上的方法并非100％准确定反应mRNA的完整性，因为他们只是反应rRNA的量来间接测定mRNA 的完整性。
这里推荐一种方法：采用GAPDH的3’：5’分析法。
我们使用oligo dT进行逆转录，然后对逆转录的cDNA用multiplex荧光定量评价。
设计三个taqman探针来定量三种相同大小的扩增产物。
探针设计的位点分别位于3’;5’以及中部。
扩增产物的之间的比值反应RNA的完整性。
如果3’;5’的比值在1,反应较高度完整性，如果高于5说明降解。
QRT-PCR 抑制物的组成
QRT-PCR抑制物严重减少了PCR的灵敏度以及热动力学反应,高度的抑制还导致假阴性的结果。
抑制物的来源：生物样品的核酸抽提以及共沉淀中的混合物，盐离子，尿素，血红素，hep arin以及IgG.
是否有抑制物的评价体系：
1.通过对目的样品进行梯度稀释进行PCR扩增效率的检测
2.通过内部扩增对照来反应样品处理过程中样本的情况
3.用细菌基因组检测临床样品的抑制
4.通过标准人工合成的扩增进行RT-PCR来反应目标检测物的抑制情况
反转录反应系统
1.RT和PCR单一酶系统
2.RT和PCR分离的酶系统
3.RNA逆转录引物的选择
引物主要有三种：
1.随机引物：随机引物，特别是6nt引物对所有的靶位点不产生十分稳定一致的结果，建议
使用15nt的随机引物.
2.oligo-dT：只能用于mRNA完整的样品，特别有polyA .而且对于一些特殊的变异体以及较长的3’UTR的区域比较困难
3. 特异引物：最特异最灵敏的方法。
特别RNA量足够情况下建议使用此法。
PCR 优化
PCR优化主要有：
1.引物的浓度
2.建议使用SYBR Green I和EvaGreen 进行扩增和溶解曲线的测试
笔者建议的操作流程:
I．靶的选择和试验设计
1.针对目的基因序列选择合适的扩增片断
查看以下三个网站是否有合适的已经证实的QRT-PCR的扩增引物,探针以及反应条件. RTPrimerDB (http://medgen.ugent.be/rtprimerdb),
PrimerBank (/primerbank/index.html)
Real Time PCR Primer Sets ()
如果没有合适的或者已经证实的可以提供参考,以下的设计方案仅供参考:
A.最广泛使用的商业化的软件Beacon Designer()
B.DIY 的软件Primer Express
C.如果Beacon Designer 无法得到您说需要的结果,或者获得到设计方案的备选数目不够的话,可以选择Sigma-Genosys )的服务方案,详细周到
D.一个免费的基于网页构架的引物和探针设计程序: /product s/probe_design.asp
您可以挑选其中的4-6对引物进行试验,选择引物的扩增效率和灵敏度高的.这个软件可以直接与NCBI的网站进行比对,并且用NCBI的ePCR进行虚拟的电子PCR
引物设计简介
DNA引物长度:15-25 个碱基
GC含量:50%左右
如果引物的与AT区域富集结合,可以考虑用LNA替换几个碱基,较少引物的长度以及避免引物次级结构和3’端二聚体的影响.由于引物和模板和探针与靶点之间的分之间的相互竞争, 分之内杂交,倒转重复等等会引起引物的引发探针对结合效率达降低,因此我们选择引物二聚体的△G为负值,即:<10 kcal/mol.没有连续的G/C.
引物探针的保存一般遵循以下原则:
正向和反向引物保存在-20度, 浓度为10mM 或者10×工作浓度.探针应该避光保存，贮存在-70度,最好以冻干粉状态，工作浓度的液体保存一般两周左右。
2.输入靶序列，用BLASTn在/blast进行比对
3.检查比对序列的多态性以及可能的错误避免这些区域来进行引物和探针设计
4.在靶序列中避免直接待重复区，在重复区进行杂交容易使得引物非获得产物性结合，降低DNA的扩增效率以及减少分析的灵敏度。
5.考虑到潜在的剪接变异体以及合适的所需要的获得到靶，通过生物信息学分析内含子以及外显子的边界，主要通过cDNA和基因组序列比对来确定。
一般都设计跨最长内含子区，这样减少了扩增子受到基因组DNA的污染的影响。
这是十分有必要的，特别当用基因组D NA做归一化处理以及靶向某一特异的剪接变异体。
最经济的做法是让下游引物跨越剪接接头，这样允许使用一条探针检测可能剪接变异体.然后如果在有效性和灵敏度无法保证情况下，可以使用跨越单一外显子的设计方案。
我们还是建议试验者用DnaseI处理样品，除去gDNA的污染。
6.在RT步骤时，用(/applications/mfold/rna/form1.cgi) 工具检测在特定温度下靶序列的折叠情况，避免一些高度次级结构的区域，那些区域探针和引物结合效率较低
7.尽可能用60-150bp的扩增产物，GC含量在60％或者稍小来确定高效的变性，更高度反应效率。
GC含量高度序列容易产生非特异性的反应，短序列扩增是
的扩增时间缩短gDNA 污染可能性减少。
短的序列容易人工合成，用来做扩增多标准曲线。
用oligodT进行逆转录最好设计扩增子位于靠近模板的3’区域。
