蜡样芽孢杆菌ERIC-PCR分子分型方法的建立

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米醋中蜡状芽孢杆菌DNA提取及其ERIC_PCR体系建立

米醋中蜡状芽孢杆菌DNA 提取及其ERIC-PCR 体系建立廖永红任文雅孙宝国*徐瑾沈晗（北京工商大学化学与环境工程学院北京100048）摘要以蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus ）为试验材料，比较细菌基因组DNA 的提取方法。

将ERIC-PCR 应用于醋液分离菌的研究，对此反应体系的主要因素进行优化，最终建立了适合于此菌种的ERIC-PCR 体系。

采用改良的传统细菌基因组DNA 提取方法，所提取的DNA 质量较高，能够满足ERIC-PCR 反应的需要。

反应体系：25μL 反应体积10×扩增缓冲液（含Mg 2+）2.5μL ，20pmol/μL ERIC-PCR 引物E11μL ，20pmol/μL ERIC-PCR 引物E21μL ，DNA 模板2μL ，2.5mmol/LdNTPs 混合液 2.0μL ，taq 聚合酶 1.1μL ，双蒸水补齐；PCR 反应程序为：94℃变性3min ，1个循环；94℃变性30s ，55℃退火40s ，72℃延伸1min ，30个循环；72℃延伸4min 。

关键词细菌；DNA 提取；ERIC-PCR ；优化文章编号1009-7848（2011）04-0007-07食醋在生产过程中需要添加大曲、麦曲、酶母菌及醋酸菌等。

各种带菌的原料和工具因操作问题会带来细菌的污染。

虽然产品加热灭菌时，一些不耐热的微生物菌体残留在食醋中造成混浊沉淀，一些耐热的芽孢杆菌潜伏在醋中[1]，在适当的温度和营养条件下会缓慢生长，影响着米醋的风味及产品的质量。

蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus ）是一种在自然界中广泛分布的好气、中温、产芽孢的杆菌，是食品和化妆品中常见的污染菌。

它同昆虫病原菌苏云金杆菌，人畜病原菌炭疽芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、韦氏芽孢杆菌组成芽孢杆菌属蜡状芽孢杆菌组，它们的形态特征、生理生化特征非常相似，并有着极高的DNA 同源性。

因为蜡状芽孢杆菌广泛存在于土壤、空气、水和尘埃中，所以无法避免地会污染到食品中。

应用PCR方法检测蜡样芽胞杆菌的研究_王振国

基金项目 :科技部资助项目(2003DIA6N002-002-03) 作者简介 :王振国(1965-), 男 , 博士 , 研究员 , 主要从事微生物检验研究。收稿日期 :2006-02-08 修回日期 :2006-05-26
672
吉林农业大学学报
2006 年
PCR 反应体系 :10 ×PCR 缓冲液 2.5 μL , dNTP 混合液 (dATP , dCTP , dGTP , dTTP 浓度均为 10 mmol/ L)2 μL , Ex Taq DNA 聚合酶 (5 U/ μL) 0.2 μL , 模板 DNA 2 μL , 引物 (20 μmol/L )各 0.5 μL , ddH2O 补足体积至 25 μL 。PCR 扩增反应条件 :94 ℃ 5 min →94 ℃ 30 s →56 ℃ 30 s →72 ℃ 1 min →72 ℃5 min , 35 个循环。 PCR 扩增反应产物用 15 g/ L 的琼脂糖凝胶电泳检测。
应用 PCR 方法检测蜡样芽胞杆菌的研究
王振国1 , 刘和平1 , 刘金华1 , 蔡阳1 , 肖成蕊1 , 罗雁菲1 , 徐宝梁2
(1.吉林出入境检验检疫局技术中心 , 长春 130062 ;2.中国检验检疫科学研究院 , 北京 100025)
摘要 :采用 PCR 技术 , 通过扩增蜡样芽胞杆菌的 gyr B 基因来实现对蜡样芽胞杆菌的快速检测。结果表明 , 以 gyr B 为目的基因设计引物建立的 PCR 检测方法能特异性地扩增出蜡样芽胞杆菌 , 且与其他芽胞杆菌菌株均无交叉反应 , 其检测敏感性可达 9 cfu/ mL , 能够应用于蜡样芽胞杆菌的鉴定。关键词 :蜡样芽胞杆菌 ;gyr B 基因 ;PCR 检测中图分类号 :S852.616 文献标识码 :A 文章编号 :1000-5684(2006)06-0671-03

三种基因分型技术对一起食物中毒事件的分析比较

三种基因分型技术对一起食物中毒事件的分析比较
王秋艳;闫鹤;石磊
【期刊名称】《食品与机械》
【年(卷),期】2009(025)005
【摘要】分别应用ERIC-PCR、PFGE和Sau-PCR方法对一起食物中毒事件中分离自患者和食物的5株福氏志贺氏菌进行溯源分析.结果3方法显示5株菌的指纹图谱均一致,证明患者是由于食用了被志贺菌污染的食物而致病.其中ERIC-PCR操作最简便,但重复性较差;PFGE是"金标准",但设备昂贵,技术要求高,且不能高通量分析;新发展的Sau-PCR不仅易操作,而且结果稳定,便于在流行病学研究中的推广应用.
【总页数】4页(P108-110,156)
【作者】王秋艳;闫鹤;石磊
【作者单位】华南理工大学生物科学与工程学院;华南理工大学轻工与食品学院,广东,广州,510640;华南理工大学轻工与食品学院,广东,广州,510640
【正文语种】中文
【中图分类】TS2
【相关文献】
1.一起因食用糕点引起肠炎沙门氏菌食物中毒事件的调查分析 [J], 田渝;黄治兰;袁玲燕
2.一起由肠炎沙门氏菌引起食物中毒事件的实验室检测分析 [J], 杨敬金
3.成都市郫都区一起家庭进餐引起沙门氏菌食物中毒事件的调查分析 [J], 梅丽敏;余林;袁敏
4.HLA—DR基因分型中三种DNA提取法的比较 [J], 曹孟德;秦东春
5.一起由蜡样芽孢杆菌引起的食物中毒事件调查分析 [J], 王继艳
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应用PCR方法检测蜡样芽胞杆菌的研究

应用PCR方法检测蜡样芽胞杆菌的研究王振国;刘和平;刘金华;蔡阳;肖成蕊;罗雁菲;徐宝梁【期刊名称】《吉林农业大学学报》【年(卷),期】2006(028)006【摘要】采用PCR技术,通过扩增蜡样芽胞杆菌的gyr B基因来实现对蜡样芽胞杆菌的快速检测.结果表明,以gyr B为目的基因设计引物建立的PCR检测方法能特异性地扩增出蜡样芽胞杆菌,且与其他芽胞杆菌菌株均无交叉反应,其检测敏感性可达9 cfu/mL,能够应用于蜡样芽胞杆菌的鉴定.【总页数】3页(P671-673)【作者】王振国;刘和平;刘金华;蔡阳;肖成蕊;罗雁菲;徐宝梁【作者单位】吉林出入境检验检疫局技术中心,长春,130062;吉林出入境检验检疫局技术中心,长春,130062;吉林出入境检验检疫局技术中心,长春,130062;吉林出入境检验检疫局技术中心,长春,130062;吉林出入境检验检疫局技术中心,长春,130062;吉林出入境检验检疫局技术中心,长春,130062;中国检验检疫科学研究院,北京,100025【正文语种】中文【中图分类】S852.616【相关文献】1.集合PCR方法在艾滋病自愿咨询检测(VCT)人群中的应用研究 [J], 杨朝军;杨莉;马艳玲;陈玲;包佑红;闫文云2.医院临床标本中阴沟肠杆菌遗传多样性分析及应用TaqMan荧光定量PCR方法快速检测阴沟肠杆菌的研究 [J], 王怡倩;刘凯;李培京;熊衍文;叶长芸3.检测牛、羊布鲁菌多重PCR方法的建立与应用研究 [J], 云涛;关平原;申之义;张七斤;李平安;希尼尼根4.应用RT-PCR方法检测牛轮状病毒的研究 [J], 李成元;姚美玲;王广伟;刘兵;高见5.FQ-PCR方法检测结核杆菌的应用研究 [J], 刘美兰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

肉制品中蜡样芽胞杆菌实时荧光PCR检测方法的研究

肉制品中蜡样芽胞杆菌实时荧光PCR检测方法的研究杨滴;赵宇明;秦鹏钧;封雪;马颖颖;卞立坤【摘要】根据蜡样芽胞杆菌肠毒素基因片段序列,用Primer express 3.0设计一对特异性引物和一个TaqMan探针,建立蜡样芽胞杆菌实时荧光PCR检测方法.通过对梯度含量的蜡样芽胞杆菌标准菌液样品DNA和多种细菌的DNA进行实时荧光PCR检测,来检测其灵敏度和验证引物和探针的特异性.实验结果表明,只有蜡样芽胞杆菌产生扩增曲线,其他细菌无扩增,说明引物及TaqMan探针特异性较好,检测灵敏度为1×103CFU/mL.该方法具有很好的研究价值和应用前景.【期刊名称】《肉类工业》【年(卷),期】2017(000)006【总页数】4页(P49-52)【关键词】蜡样芽胞杆菌;实时PCR;检测【作者】杨滴;赵宇明;秦鹏钧;封雪;马颖颖;卞立坤【作者单位】大连市食品检验所辽宁大连 116600;大连市食品检验所辽宁大连116600;大连市食品检验所辽宁大连 116600;大连市食品检验所辽宁大连116600;大连市食品检验所辽宁大连 116600;大连市食品检验所辽宁大连116600【正文语种】中文蜡样芽胞杆菌是常见的食物中毒病原菌之一,其污染食品后能大量繁殖并产生毒素,导致人类急性食物中毒。

该菌可引起呕吐型和腹泻型两种不同类型的食物中毒,已从多种食品中分离出该菌，包括肉、乳制品、蔬菜、鱼、土豆、糊、酱油、布丁、炒米饭以及各种甜点等。

在美国，炒米饭是引发蜡样芽胞杆菌呕吐型食物中毒的主要原因；在欧洲大都由甜点、油奶和肉类食品引起；在我国主要与受污染的米饭或淀粉类制品有关[1]。

目前对蜡样芽胞杆菌的检测,仍以传统生化培养方法为主。

传统的生化检测方法是一项费时费力的工作，需要较长时间的选择性增菌培养过程。

近十几年来,随着分子生物学的发展以及PCR技术的出现,使得蜡样芽胞杆菌的检测在数小时内就能完成[2～4]。

ERIC_PCR鉴别苏云金芽胞杆菌与蜡状芽胞杆菌的研究

ERIC PCR 鉴别苏云金芽胞杆菌与蜡状芽胞杆菌的研究*李强1金莉莉1王芳2宋树森1王秋雨1**(辽宁大学生命科学学院沈阳 110036)1 (沈阳出入境检验检疫局沈阳 110016)2摘要:利用ERIC PCR 技术对苏云金芽孢杆菌(B t)、蜡状芽孢杆菌(Bc)和对照菌基因组DNA 进行扩增,回收、标记Bt PCR 扩增片段,分别与各菌株的基因组DNA 进行斑点杂交和Southern 杂交,筛选Bt 标识序列。

结果显示:Bt 各菌株均可扩增得到250bp 的特异片段;Bt 和Bc 均可得到600bp 的共有扩增片段;以筛选得到的569bp 片段为探针,可特异性地与B t 基因组DNA 杂交;ERIC PCR 技术可以在DNA 指纹图谱水平区分鉴别Bt 与Bc 菌,正确反映出两者的亲缘关系。

结果表明ERIC PCR 技术在Bt 的检测及在Bt 与Bc 的鉴定中具有较强的实用性。

关键词:苏云金芽孢杆菌,蜡状芽孢杆菌,ERIC PCR,指纹图谱,Sou thern 杂交中图分类号:Q93 3 文献标识码:A 文章编号:0253 2654(2007)06 1184 04Identification of Bacillus thuringiensis and Bacillus cereus by ERIC PCR *LI Qiang 1 JIN Li Li 1 WANG Fang 2 S ONG Shu Sen 1 WANG Qiu Yu 1**(Li f e Sc ienc e De pa rtme nt o f Liaon in g U ni versit y ,Sh en ya ng 110036)1(Liaon in g En try Exit Inspection an d Qu aran tine Bu re au ,Shen yan g 110016)2Abs tract :To screen the id entifier of B .thu rin gien sis ,gen omic D NA of B .th uring iensis ,B .ce re us and con trol strains were amplificated b y ERIC PCR.Fragments amp lified from B .th u rin gien sis were retrieved ,cl on ed ,marked b y 32P,d ot bl ot and southe rn h ybri dized with genomic DNA of these strains.It sho ws th at every strai ns of B .thu ring ie nsis can be a mp li fied to produce a 250b p fragmen t,and b oth B .th uring iensis an d B .ce reu s can be amplified to produce a 600bp fragment.Hyb ridi zation resul t bet w een 569bp probe and genomic DNA of B .thu rin gien sis sh ows a hi gh specificity.Discri mi nation an d genetic relati on shi p be tween B .thu rin gien sis and B .ce re us can be re vealed b y ERIC fin gerprin t.This researc h i ndicates th at ERIC PCR techn iqu e is a p ractical method in the d etec ti on and c haracteri zati on of B .thu rin gien sis an d B .ce reu s .K ey words :B .thu ring iensis ,B .cereus ,ERIC PCR,D NA fin gerprin ts,S ou thern b lotti ng*辽宁出入境检验检疫局资助项目(No.LK 30 2002)**通讯作者 Tel:024 ********,E mail:qiuyuwang@ 收稿日期:2007 01 27,修回日期:2007 07 20苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis ,简称Bt)是一种自然界中广泛分布的革兰氏阳性菌,属于芽孢杆菌属。

ERIC-PCR技术在动物流行病学调查中的应用

ERIC-PCR技术在动物流行病学调查中的应用朱佳文;吴永胜;许祯莹;苏志鹏;邱时秀;李娟【摘要】肠杆菌基因间重复共有序列PCR(ERIC-PCR)技术作为一种快速有效的分子生物学手段,在监测动物肠道菌群多样性,分析细菌种类,确定疫病暴发或流行,追溯传染源和控制肠道致病菌中发挥了重要的作用.本文对ERIC-PCR技术的背景、优缺点及在动物流行病学调查中的应用进行了概述.【期刊名称】《四川畜牧兽医》【年(卷),期】2018(045)001【总页数】3页(P33-35)【关键词】动物流行病学;ERIC-PCR;肠道菌群【作者】朱佳文;吴永胜;许祯莹;苏志鹏;邱时秀;李娟【作者单位】成都市农林科学院畜牧研究所,四川温江 611130;成都市农林科学院畜牧研究所,四川温江 611130;成都市农林科学院畜牧研究所,四川温江 611130;四川特驱投资集团有限公司,四川双流 610207;成都市农林科学院畜牧研究所,四川温江 611130;成都市农林科学院畜牧研究所,四川温江 611130【正文语种】中文【中图分类】S818.9近几年，越来越多的科研工作者开始专注于肠道微生物的研究，ERIC-PCR技术以其操作简单、试验重复性高和分辨力强等优点而被广泛利用。

1 ERIC-PCR技术的背景ERIC是肠杆菌间保守的重复基因序列，能够同时比较大规模微生物样品的序列结构特征。

ERIC序列长为126bp，存在于基因组的转录区域，其序列具有高度保守性，但在不同物种染色体上的定位不同。

Hulton等[1]指出ERIC序列存在于许多肠道菌中，而且可以作为大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和其他一些肠道微生物新的重复单元家族。

同年，Versalovic等[2]发现可以通过ERIC序列设计引物对细菌进行PCR扩增，得到不同细菌基因组的指纹图谱。

由于ERICPCR技术能够得到敏感性好和重复性高的ERICPCR指纹图谱，因而该技术逐渐被利用在各种不同的环境微生物生态学研究中，并且取得了较好的结果。

蜡样芽孢杆菌分型方法研究进展

蜡样芽孢杆菌分型方法研究进展曹飞扬1,2，王娉1，江连洲2，陈颖1,*（1.中国检验检疫科学研究院农产品安全研究中心，北京 100176；2.东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030）摘要：蜡样芽孢杆菌是一种食源性条件致病菌，在环境和食品中分布比较广泛，所引起的食物中毒常分为腹泻型和呕吐型。

研究蜡样芽孢杆菌的分型方法对该菌的预防、预警、溯源及分子流行病学的调查都具有重要意义。

目前，蜡样芽孢杆菌的分型方法主要包括噬菌体分型、生化分型等传统分型方法以及多位点序列分型、重复序列聚合酶链式反应分型、随机扩增多态性DNA 分型、脉冲场凝胶电泳分型等分子分型方法。

以蜡样芽孢杆菌为对象，综述其分型方法的研究进展，以期为该菌的分型提供一定参考。

关键词：蜡样芽孢杆菌；传统分型；分子分型Advances in Methods for Bacillus cereus TypingCAO Feiyang 1,2, WANG Ping 1, JIANG Lianzhou 2, CHEN Ying 1,*(1. Agro-Product Safety Research Center, Chinese Academy of Inspection and Quarantine, Beijing 100176, China;2. College of Food Science, Northeast Agricultural University, Harbin 150030, China)Abstract: Bacillus cereus is a food-borne opportunistic pathogen widely present in the environment and foods. It is frequently associated with two types of food-borne illness: emesis and diarrhea. The study on Bacillus cereus typing has important implications for the prevention, early warning, tracing and molecular epidemiological survey of Bacillus cereus . Currently, the popular methods for typing Bacillus cereus include traditional typing methods such as phage typing and biochemical typing, and molecular typing methods such as multilocus sequence typing, repetitive sequence-PCR, random ampliﬁed polymorphic DNA, and pulsed-ﬁeld gel electrophoresis. In this paper, all these methods are reviewed with the aim of providing references for the typing of Bacillus cereus .Key words: Bacillus cereus ; traditional typing methods; molecular typing methods DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717046中图分类号：TS207.4 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2017）17-0286-05引文格式：曹飞扬, 王娉, 江连洲, 等. 蜡样芽孢杆菌分型方法研究进展[J]. 食品科学, 2017, 38(17): 286-290. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717046. CAO Feiyang, WANG Ping, JIANG Lianzhou, et al. Advances in methods for Bacillus cereus typing[J]. Food Science, 2017, 38(17): 286-290. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201717046. 收稿日期：2016-07-28基金项目：“十三五”国家重点研发计划重点专项（2016YFD0401102）；中国检验检疫科学研究院院所基金项目（2016JK006）作者简介：曹飞扬（1989—），男，硕士，研究方向为食品质量安全检测与控制。

蜡样芽孢杆菌及其制备方法和应用[发明专利]

专利名称：蜡样芽孢杆菌及其制备方法和应用专利类型：发明专利
发明人：王刚,王淼,刘凤英,王俊芳,张颖
申请号：CN200910064867.2
申请日：20090512
公开号：CN101812412A
公开日：
20100825
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种具有防治小麦纹枯病功能的蜡样芽孢杆菌及其制备方法和应用。

本发明的菌株Bacillus cereus0-9CCTCC No.M209041。

对小麦纹枯病进行生物防治：将菌株Bacillus cereus0-9CCTCC No.M209041在KMB液体培养基中28℃，200rpm扩大培养后，制备菌悬液，对小麦种子进行1h浸泡，将处理过的麦种播种于染病土壤，并以该细菌发酵液做一次灌根处理。

本发明的菌株为小麦内生Bacillus cereus细菌，可以在小麦豫麦17中大量定殖，对小麦纹枯病具有较好的防效(82.86％)，且效果稳定，具有较好的推广应用前景。

申请人：河南大学
地址：475001 河南省开封市明伦街85号
国籍：CN
代理机构：郑州睿信知识产权代理有限公司
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利用PCR技术检测致病性腊样芽孢杆菌的研究

利用PCR技术检测致病性腊样芽孢杆菌的研究王振国;刘金华;肖成蕊;蔡阳;罗雁菲;刘和平;牟峻【期刊名称】《生物技术》【年(卷),期】2005(15)5【摘要】目的:利用PCR技术对致病性蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)进行检测。

方法:对致病性蜡样芽孢杆菌溶血素hblA基因序列进行分析设计一对特异引物,通过优化PCR反应条件,来实现对致病蜡样芽孢杆菌的快速检测,结果:该方法具有较强的灵敏性及特异性,能够对肠毒素型腊样芽孢杆菌进行有效的检测,其最低检出限可达9CFU/ml,用PCR技术对食物样品中致病性蜡样芽孢杆菌的检测取得与普通生化检测方法一致的结果。

结论:利用PCR技术对食品中蜡样芽孢杆菌的检测较常规的生化检测方法具有省时省力的特点且灵敏性较高,具有较强的实际应用价值。

【总页数】3页(P45-47)【关键词】蜡样芽孢杆菌;溶血素hblA基因;检验【作者】王振国;刘金华;肖成蕊;蔡阳;罗雁菲;刘和平;牟峻【作者单位】吉林出入境检验检疫局技术中心【正文语种】中文【中图分类】TS210【相关文献】1.基于PCR方法检测蜡样芽孢杆菌的研究进展 [J], 张志鸿;许恒毅;魏华2.应用实时荧光PCR检测致病性蜡样芽孢杆菌 [J], 王振国;刘金华;徐宝梁;赵贵明;陈颖;牟峻;罗雁菲;蔡阳3.多重PCR技术检测微生物肥料中巨大芽孢杆菌和蜡样群芽孢杆菌的研究与应用[J], 曹凤明;李俊;沈德龙;关大伟;李力4.餐饮食品中蜡样芽孢杆菌的实时荧光PCR检测方法研究 [J], 柯振华5.基于实时荧光PCR技术快速检测饲料中的蜡样芽孢杆菌 [J], 包海燕;乌日娜;岳喜庆;武俊瑞;乔宇;彭晴;石波;纪善琴;王治颖;陈旭因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

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选用 L16(4 )正交表，对影响 ERIC-PCR 扩增结果的主要影响因子进行正交设计，正交试验水平表见表 1。根据正交设计进行 PCR 扩增和琼脂糖凝胶电泳。为了提高试验的稳定性，每个处理的试验重复三次，依据条带的强弱和条带的数量对扩增产物电泳结果依次打分，条带数量丰富清晰稳定的最佳产物记 16 分，最差的计 1 分，对试验结果进行评分。最后对正交试验进行方差分析，确定 ERIC-PCR 最佳反应体系。
1.2 主要仪器设备
Taq DNA 酶 (2.5 U/μL) 、 Mg2+（ 25 mmol/L）、 10× PCR buffer 、三磷酸脱氧核糖核苷 dNTPs (2.5 mmol/L) 均购于天根生化科技有限公司， DL 5000 DNA Marker 购于大连 Takara 公司；Ezup 柱式细菌基因组 DNA 抽提试剂盒购自上海生工生物工程；ERIC-PCR 通用引物 [13]ERIC-F(A TGTAAGCTCCTGGGGA TTCA C) 和 ERIC-R(AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG) 由华大基因公司合成；紫外可见分光光度计 BioSpec-nano，日本岛津；梯度 PCR 仪 Tprofessional Standard Gradient，德国 Biometra；电泳仪 EPS 300，上海天能；凝胶成像系统 GE Image Quant 350，美国 GE Healthcare。
1.3.5 B. cereus 分离菌株 ERIC-PCR 指纹图谱构建与分析
以 ERIC-PCR 最优反应体系对广东省食源性致病菌污染调查中从肉与肉制品、速冻食品、熟食、水产品、蔬菜、速冻食品、食用菌和奶制品七类食品中分离得到的 50 株 B. cereus 分离株和两株标准菌株进行 PCR 扩增，扩增产物经 2%琼脂糖凝胶电泳后检测，得到 ERIC-PCR 指纹图谱，应用 Gel-Pro Analyzer 4.0 软件对以上 ERIC-PCR 指纹图谱进行凝胶定量分析，得到各条带的分子量大小，把同样分子量大小的排为同行，得到一个矩阵，按照“有条带的位置记为 1，无条带的位置记为 0”的方法把矩阵转换成 0， 1 矩阵，再将其导入聚类软件 NTSYS-pc 进行 UPGMA 聚类，构建聚类树。使用 Simpson 差异指数（DI）来评价不同的分型方法的分辨力。Simpson 差异指数的计算公式为：
蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)是一种分布广泛的兼性好氧、中温、产芽孢的条件致病菌。几乎所有种类的食品都曾被报道与 B. cereus 引发的食物中毒有关 [1~2] 。本实验室近两年开展了全国零售食品中 B. cereus 污染调查，为进一步了解其在食品中的遗传多样性，研究其分布规律，找出食源性优势菌株，需要建立一
收稿日期：2013-04-07 基金项目：广东省教育部产学研结合项目（2012B090400017)；科技部国际科技合作专项（2013DFH30070) 作者简介：王君（1986-），女，硕士，研究方向为蜡样芽孢杆菌污染调查和分布规律通讯作者：吴清平（1962-），男，博士，研究员，研究方向食品微生物安全监测与控制技术研究
（2.广东省微生物研究所，广东省华南应用微生物重点实验室-省部共建国家重点实验室，广东省菌种保藏与应用重点实验室，广东省微生物应用新技术公共实验室，广东广州 510070）
摘要：为建立简单快速的蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)基因间重复共有序列 PCR(ERIC-PCR)的分子分型方法，该研究以 B. cereus CM CC 63303 的基因组 DNA 为模板，并采用正交设计 L16(45)对影响 ERIC-PCR 反应体系的五个因素（模板 DNA、M g2+、dNTP、Taq DNA 聚合酶、引物）在四个浓度水平上进行优化，并通过单因素试验确定最佳退火温度，最后以优化后的反应体系对 50 株 B. cereus 分离株进行 ERIC-PCR 分子分型和聚类分析验证其稳定性和分型效果。结果显示应用建立的 ERIC-PCR 反应体系对 50 株分离株扩增均得到了 9~17 条、大小在 200~4000 bp 之间的条带，并可将其分为 47 个型，且分辨力达到 0.996，具有较高稳定性和分辨能力。表明 ERIC-PCR 技术对 B. cereus 分型，具有简便和分辨力高等优点，可用于食源性 B. cereus 分离株的多样性研究。关键词：蜡样芽孢杆菌；ERIC-PCR；分子分型；遗传多样性分析文章篇号：1673-9078(2013)7-1696-1701
种简单、稳定、多态性丰富、成本低、适用于 B. cereus 的分型方法。过去对 B. cereus 分型多采用噬菌体[3]、血清[4]等分型方法，但这些方法操作复杂、成本高且分型粗糙。目前，B. cereus 仍以传统生化分型为主，但它耗时费力、结果重现性差，且有些菌株不能分型，很难用于大批量菌株的遗传多样性研究。随着分子生物学技术的发展，分子分型方法越来越多，其中 PFGE[5~6]、 RFLP[7~8]、 MLST [9]、 AFLP[10]、生物芯片[11] 等许多分子技术已成功用于蜡样芽孢杆菌群亲缘关系的分型及鉴定。与以上方法相比，ERIC-PCR[12]分型具有成本较低，操作技术简单等优点。近年来我国的廖永红[13]等人首先对 B. cereus 的 ERIC-PCR 体系进行了单因素优化，并且建立起了适合 B. cereus 的
Establishment of ERIC-PCR Molecular Typing Method for Bacillus cereus
WANG Jun 1,2 , WU Qing-ping2 , WU Ke-gang1 , CHEN Mou-tong2 , ZHANG Ju-mei2 , GUO Wei-peng2 (1.Faculty of Chemical Engineering and Light Industry, Guangdong University of Technology, Guangzhou 510006, China) (2.Guangdong Institute of Microbiology, South China State Key Laboratory of Applied Microbiology (Ministry-Guangdong Province Jointly Breeding Base), Guangdong Provincial Key Laboratory of Microbial Culture Collection and Application; Guangdong Open Laboratory of Applied Microbiology, Guangzhou 510070, China)
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1 2 3 4
25.00 50.00 75.00 100.00
5
3.00 4.00 5.00 6.00
0.20 0.40 0.60 0.80
0.75 1.00 1.25 1.50
0.10 0.20 0.30 0.40
1 材料与方法 1.1 材料与试剂
B. cereus 标准菌株 CMCC 63301 和 CMCC63303 均由本实验室保藏，其中 CMCC63303 用于 ERIC-PCR 反应体系的优化， 50 株蜡样芽孢杆菌分离菌株由本实验室在广东省食源性致病菌污染调查分离所得，均由甘油保藏于-20 ℃冰箱备用。
现代食品科技
Modern Food S cience and Technology
2013, Vol.29, No.7
蜡样芽孢杆菌 ERIC-PCR 分子分型方法的建立
王君，吴清平，吴克刚，陈谋通，张菊梅，郭伟鹏（1.广东工业大学轻工化工学院，广东广州 510006）
1,2 2 1 2 2 2
Abstract: An efficient enterobacterial repetitive intergenic consensus sequence (ERIC-PCR) molecular typing method was established for Bacillus cereus. Based on the template of B. cereus CM CC 63303 genomic DNA, the ERIC-PCR amplification system in four levels of five factors (DNA template, M g2+ , dNTP, Taq DNA polymerase and primer) was optimized by orthogonal design L16(45) .Then the effects of annealing temperature on the amplification system was discussed through single factor experiment and the optimal reaction condition were determined. Fifty B. cereus strains were typed using the optimal reaction system and cluster analysis. The ERIC-PCR results exhibited better discriminative results in molecular typing with discrimination index of 0.996. B. cereus strains were grouped into 47 types. The ERIC-PCR system was an efficient method for typing and tracking analyses. It was suitable for genetic diversity analysis of foodborne B. cereus strains. Key words: bacillus cereus; ERIC-PCR; molecular typing; genetic diversity analysis