丙肝病毒分子分型方法

2019年「丙型肝炎防治指南」要点解析2019年「丙型肝炎防治指南」要点解析在刚过去的中华医学会感染病学分会年会、中华医学会肝病学分会年会上2019年更新版《丙型肝炎防治指南》发布。

与旧版相比，新版指南增加了国内外的循证医学证据以及新的治疗方案，即直接抗病毒药物（DAAs）治疗，并对丙型肝炎的预防、诊断和抗病毒治疗进行了明确的规范。

本文通过与2019年版的《丙型肝炎防治指南》对比，为您逐一阐述，新版指南的亮点所在。

流行病学更新流行病学数据。

全球HCV的感染率为2.8%，估计约1.85亿人感染HCV，每年因HCV感染导致的死亡病例约35万例。

我国属HCV低流行地区。

2019年调查显示，我国1-59岁人群抗-HCV流行率为0.43%。

加上高危群体，我国HCV感染者约1000万例。

HCV1b和2a基因型在我国较为常见，其次为2型和3型，未发现基因4型和5型，6型相对较少。

预防除旧版预防措施外，新增对高危人群的筛查。

建议根据我国《丙型肝炎筛查及管理》对丙型肝炎高危人群进行筛查及管理。

自然史及发病机制新增促进疾病进展的高危因素。

年龄在40岁以上、男性、嗜酒（女性或男性50g/d以上）、合并感染HIV并导致免疫功能低下；肥胖、胰岛素抵抗、合并HBV感染、非酒精性脂肪肝、肝脏高铁载量、合并血吸虫感染、肝毒性药物和环境污染所致大的有毒物质、遗传因素等。

新版指南还进一步阐明了发病机制。

丙型肝炎肝损害的主要原因是HCV感染后引起的免疫学反应，其中细胞毒性T淋巴细胞起重要作用。

实验室检查新版指南中实验室检查提至临床诊断之前，并删除血清生化学检测和HCVRNA定性检测段落。

补充抗-HCV检测的化学发光免疫分析法CIA。

并指出抗原检测是在缺乏HCVRNA检测条件时才考虑进行的。

统一HCVRNA定量检测单位为IU/ml。

指南对HCV基因分型的方法及意义进行了具体描述，并表示应在抗病毒治疗前进行该检测。

新增了HCV耐药相关基因检测、宿主IL-28B基因分型。

一、生物学特性（一）种类和病毒分型丙型肝炎病毒（Hepatitis Cvirus，HCV）引起的丙型肝炎曾被称为肠道外传播的非甲非乙型肝炎（PT-NANB）。

病毒颗粒呈球形，有包膜，直径约55~65nm。

基因组为单正链线状RNA，长度约为。

基因组由5'端非编码区（5'UTR）、编码区和3'端非编码区（3'UTR）组成。

5'端非编码区是HCV基因组中最保守的序列，是设计诊断用PCR引用的首选部位。

编码区仅含一个长的开放阅读框（ORF），编码一个大分子的多聚蛋白前体。

该前体蛋白在病毒蛋白酶和宿主信号肽酶的作用下切割产生病毒的结构蛋白和非结构蛋白。

病毒的结构蛋白包括核心蛋白C和包膜蛋白E1、E2。

非结构蛋白包括NS2、NS3、NS4a、NS4b、NS5a和NS5b。

对于3'端非编码区的功能尚不清楚，可能与病毒复制有一定关系。

根据HCV NS5区基因序列的同源性，可将HCV分为6个基因型，11个亚型，即1a、1b、1c、2a、2b、2c、3a、3b、4a、5a、6a。

其中，欧美流行株多为1a、1b、2a、2b和3a；中东地区以4a为主；亚洲包括我国以1b、2a和2b亚型较为多见。

（二）来源1989年，美国学者Choo等应用了分子克隆技术在实验室感染PT-NANB的黑猩猩血浆中首次获得了病毒的cDNA克隆，测定了约70%的HCV基因序列，并利用这些基因表达的蛋白质为抗原，检测到PT-NANB病人血清中的特异性抗体。

此后，又获得了来自PT-NANB患者血清的病毒全基因组序列，从而确定了PT-NANB的病原体，并将命名为丙型肝炎病毒。

1991年，国际命名委员会将其归类为黄病毒科丙型肝炎病毒属。

（三）传染源主要传染源为急、慢性患者和无症状HCV携带者。

慢性患者和病毒携带者有更重要的传染源意义。

（四）传播途径传播途径主要为输血及血制品传播。

此外，亦可通过非输血隐性途径的微小创伤、性接触、家庭密切接触及母婴接触进行传播。

丙型肝炎病毒基因分型的研究进展丙型肝炎病毒是输血后感染肝炎常见的一种病毒，目前其分为6型，其亚型已经超过100个，由于其复制依赖的酶缺乏校对功能，所以易发生突变，这也是丙型肝炎病毒基因组分型的基础。

其分型的命名因为采取的标准及使用的分析方法不一样也有不同的命名系统。

丙型肝炎病毒基因的检测方法很多，但是不简便经济，而且其与丙型肝炎有很大的关系。

标签：丙型肝炎病毒；基因分型；进展研究在如今生活中，除了乙肝是常见肝病外，丙肝患者的比例越来愈高，究其原因主要是人们对于丙肝的感染途径不了解，未对丙肝给予足够的重视。

其传播途径主要有：①输血及血制品，尤其是反复输血及使用血制品者，据统计，输血后肝炎70%以上是丙型肝炎。

②不正规注射。

③伤口未护理。

④性接触。

⑤母婴传播。

在这几种传播途径中，①④⑤最易感染丙肝。

在日常生活中，人们需要采取相关防范措施，以免感染丙肝。

1 HCV的结构HCV的RNA大约有9500－10000bp组成，其5′非编码区有319-341bp，3′非编码区有27- 55bp。

在5′非编码区下有一开放阅读框（ORF），其基因排列顺序为5’C-E1-E2-p7-NS2-NS3-NS4-NS5-3，能编码多聚蛋白前体（一长3014个的氨基酸）。

经宿主细胞及自身蛋白酶作用可裂解成三种结构蛋白，其分别为核心蛋白、糖蛋白、非结构蛋白三种。

HCV基因标记有很多种，如GP72，其基因标记为E2/NS1。

其糖蛋白能产生抗HCV的中和作用。

还有NS2、NS3、NS4等基因标记。

NS2和NS4的功能可能与细胞膜紧密结合在一起。

NS3参与解旋HCV-RNA 分子，具有螺旋酶活性，以辅助RNA复制，NS5参与HCV基因组复制，依赖于RNA的聚合酶活性。

2 HCV的分型及地理差异目前HCV分型尚无统一的定论，这是因为在研究的过程中采取的技术及研究的位置不一致，因而出现了很多基因分型，这些基因分型没有同一的标准。

综合各个国家的研究结果，大致上可分为6型，其亚型很多。

・专家论坛・解读《丙型肝炎防治指南》李梦东作者单位:410038　重庆市第三军医大学西南医院作者简介:李梦东　教授,博士生导师 丙型肝炎病毒(HC V )慢性感染可导致肝脏慢性炎症和纤维化,部分患者可发展为肝硬化甚至肝细胞癌(HCC )。

中华医学会肝病学分会和传染病与寄生虫病学分会组织国内有关专家,制定了我国丙型肝炎防治指南(下称指南)[1],对我国丙肝的防治起到了推动和指导作用。

但是,在指南中仍有几个问题存在争议,值得提出来加以讨论。

一、HC V 基因组的结构特点及其亚型　HC V 属于黄病毒科,其基因组为单股正链RNA ,易变异。

S imm onds 把HC V 分为6个基因型(同源性在56%～72%),11个主要亚型(同源性74%～86%),可能还会发现新的亚型。

分型方法有型特异性引物PCR 法、限制性片段长度多态性分析法、经型探针杂交法、直接测序法及基因芯片法等[2]。

当前在较保守的5’非编码区(5’NC 区)已证明至少有12a 、b 、c ,22a 、b 、c ,32a 、b ,4、5及6等6个大的基因型。

美国大多数分离株为基因1a 型(60%)及1b 型(20%)[3]。

王宇等调查证明,我国北方地区(沈阳、哈密及兰州)3型感染率为30%～50%,南方地区(南京、南宁、成都)则以2型感染为主(90%～100%),而杜绍财等的报告则认为北方(北京、西安)2型感染者为80%～85%,3型感染者为15%～19%;南方(重庆、武汉、广州、广西)2型感染者为80%～100%,3型感染者为0～13%[4]。

[指南]中认为我国1b 型(约占60%～80%)和2a 型较常见,其中以1b 型为主,某些地区有1a 、2b 和3b 报道,6型主要见于香港、澳门地区及南方边境省份,在[指南]中提到有3c 型,是很特殊的,但均未说明其地区分布及频率,显然与以往的结果出入较大,而无法参与对比。

也可能因研究方法的不同,所得结果混乱,很难进行正确评估。

丙肝病毒实验室检查方法及结果解释1实验室检查方法1.1化学发光实验化学发光免疫分析是将有高灵敏度的化学发光检测技术与高特异性免疫反应相结合利用各种抗原，半抗原、抗体、激素，酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。

化学免疫发光又以标记方法不同分为两种，化学发光标记免疫分析和化学发光酶免疫分析。

化学发光标记免疫分析是利用化学发光剂直接标记抗原或抗体的免疫分析方法，常用的标记化学物质有吖啶酯类化合物，通过起动发光试而发光，强烈直接发光在1 s内完成。

化学发光酶免疫分析，其操作步骤与ELISA完全相同。

以酶标记活性物质进行免疫反应，只是反应底物为发光剂。

1.2胶体金快速实验免疫渗透实验：斑点免疫胶体金快速实验以硝酸纤维膜为载体，HCV抗原点状固定在膜上，加待检样品，阳性结果在膜上抗原部位显色斑点。

反应时间在10 min以内有效试验质控点必需显色。

免疫层析试验，以硝酸纤维膜为载体，HCV抗原线状固定在膜上，待检样品沿着载体迁移，阳性结果在膜抗原部位显示出有色条带，有效试验质控线必须显色。

1.3抗体补充试验目前常用抗体补充试验为免疫印迹试验，免疫印迹法试剂一般将HCV不同编码区抗原多种成分喷涂在硝酸纤维薄膜条上，并设置了两种不同浓度的IgG对照带的二条hsoD对照带，用于内部对照结果判断。

其诊断HCV感染敏感性高，特异性强，可检测出针对HCV不同编码区抗原的抗体，其不需要特殊仪器设备。

抗HCV检测策略及结果报告，先用筛查试剂进行初策实验，结果呈阴性报告阴性，不在进行复检实验，结果呈阳性反应进入复检试验，复检用筛查试剂2进行，结果呈阴性反应报告阴性，呈阳性反应报告抗HCV阳性。

HCV抗原的检测目的及意义：急性丙型肝炎的辅助诊断，尤其有助于HCV 感染窗口期患者，抗HCV检测结果确定患者或HCV阳性母亲所生婴儿丙型肝炎辅助诊断。

免疫受损或先天性免疫缺陷群体如HCV感染者的筛查，或是抗HCV 阳性感染者的病毒血液分析，HCV感染者治疗前后，病毒血液分析。

丙型肝炎由丙型肝炎病毒（HCV）感染所致，主要由血液/体液传播。

据世界卫生组织估计，全球有亿人感染HCV。

在我国健康人群抗HCV阳性率为%~%，约3800万人。

由于病毒生物学特点和宿主免疫功能等多方面因素，机体免疫往往难以有效清除病毒，致使约50%~80%HCV感染者发展为慢性肝炎，其中20%~30%将发展成肝硬化。

肝硬化患者中每年有1%~4%发展成为肝细胞癌症。

一、基因组特征：丙型肝炎病毒呈球形颗粒，直径约为50nm，有一脂质包膜。

基因组为单链正链RNA，链长月。

整个基因组只有一个ORF，编码一条由3010~3033个氨基酸组成的聚蛋白前体，该蛋白前体在病毒蛋白酶和宿主信号肽酶作用下，裂解为病毒的结构蛋白和非结构蛋白。

（如图所示）在HCV基因组中，5’端有一个长度和序列非常稳定的非编码区（UTR），由341个核苷酸组成，形成4个二级结构域，为病毒复制和翻译所必需。

此区是整个基因组中最保守的区域，所以常常选择该区域的基因序列作为基因扩增的靶序列，这样可以检测出目前已知的所有HCV基因型。

3’端UTR包括3个结构域：靠近5’端为基因型特异的多变区（不同基因型之间的核苷酸序列差异较大；相同基因型之间核苷酸序列比较保守）；居中部分为一个多聚U区域（poly U），含有50~62个核苷酸，对病毒RNA复制至关重要，但不同基因型的HCV的多聚U区域长度不等；3’端尾部为高度保守的发夹样结构，称为X-tail。

通过定点突变破坏这一结构会导致RNA病毒复制的显著降低，说明该区域对RNA病毒有效复制同样重要。

5’端和3’端UTR之间是一个ORF并且分成9个区域：核心区→E1区→NS1/E2区→NS2区→NS3区→NS4a区→NS4b区→NS5a区→NS5b区。

其中NS5b区域在不同型HCV中同源性较低，可作为HCV分型依据。

二、分类急性丙型肝炎——成人急性丙型肝炎病情相对较轻，多数为急性无黄疸型肝炎，ALT升高为主，少数为急性黄疸型肝炎，黄疸为轻度或中度升高。

丙肝诊断标准对丙肝病例的分类标准有两种方式：
方式一为诊断分类，包括：
（1）疑似病例：流行病学史+临床表现/肝功异常；
（2）临床诊断病例：血清抗-HCV阳性+流行病学史/临床表现/肝功异常；
（3）实验室确诊病例：疑似病例/临床诊断病例+血清HCV-RNA 阳性；
方式二为急慢性分类（慢性包含肝硬化），包括：
（1）急性丙肝病例：血清HCV-RNA阳性+急性临床表现/组织病理；
（2）慢性丙肝病例：血清HCV-RNA阳性+慢性临床表现/组织病理/影像学检查；
（3）病程未分类丙肝病例：（除以上两种病例外，其他病例均判定为未分类）。

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