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基因工程载体体外获得的任一DNA片段,必须插入到能够自我复制的载体内,再转入宿主细胞,才能得到复制和进行表达。
基因工程载体(Vectors)确实是携带外源基因进入受体细胞进行繁育和表达的一种工具。
载体的功能运送外源基因高效转入受体细胞为外源基因提供复制能力或整合能力为外源基因的扩增或表达提供必要的条件基因工程中3种要紧类型的载体：1.质粒载体2.噬菌体载体3.柯斯质粒〔cosmid〕载体基因工程对载体的要求〔1〕在宿主细胞内能独立复制。
〔2〕有选择性标记。
〔3〕有一段多克隆位点。
外源DNA插入其中不阻碍载体的复制。
〔4〕分子量小，拷贝数多。
〔5〕容易从宿主细胞中分离纯化。
第一节质粒(plasmid)载体质粒是一种独立于染色体外的双链闭环的DNA分子，具有自主复制和转录能力，能在子代细胞中保持恒定的拷贝数，并表达所携带的遗传信息。
质粒的复制和转录要依靠于宿主细胞编码的某些酶和蛋白质，如离开宿主细胞那么不能存活，而宿主即使没有它们也能够正常存活。
(一)质粒的构形环形双链的质粒DNA在提取过程中通常显现三种不同的构型：①共价闭合环形DNA〔cccDNA〕②开环DNA〔open circular,ocDNA〕③线形DNA〔linear,lDNA〕〔二〕质粒的转移性指质粒从一个细胞转移到另一个细胞的特性。
接合型质粒：除了带有自我复制所必需的遗传信息外，还带有一套操纵细菌配对和质粒接合转移的基因。
如：F质粒〔性质粒或F因子〕甚至能使寄主染色体上的基因随其一道转移到原先不存在该质粒的受体菌中。
不符合基因工程的安全要求。
非接合型质粒：带有自我复制所必需的遗传信息，但失去了操纵细菌配对和质粒接合转移的基因，因而不能从一个细胞转移到另一个细胞。
如R质粒〔抗性质粒〕、Col质粒〔细菌素养粒〕。
符合基因工程的安全要求。
R质粒：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状〔resistance〕。
Col质粒：细菌素通过与敏锐细菌细胞壁的结合作用，抑制一种或数种细胞生命过程。
基因工程中常用载体及其主要特点基因工程这一话题，听起来就像科幻小说里的情节，其实离我们并不遥远。
今天咱们就聊聊基因工程中的一些常用载体，简单明了，让你听得懂，明白得了！准备好了吗？那就跟我一起走进这奇妙的基因世界吧！1. 什么是载体？首先，得先搞清楚，什么是载体。
简单来说，载体就是那些能“背负”外来基因的“快递小哥”。
它们把我们想要的基因装上，然后送到目标细胞里。
这就像是你点了一份外卖，外卖小哥把美味的食物送到你家。
没有它们，我们的基因工程可就没法开展了。
想象一下，如果没有这些小哥，基因可怎么进得了细胞的大门呢？1.1 质粒载体说到载体，质粒可算是老前辈了。
质粒就像是细菌的“USB闪存”，它能自我复制，携带外来基因，简直就是基因工程的明星。
质粒的特点是操作简单、成本低，而且它们在细菌中可以很稳定地传递下去。
想想看，若是你把一张重要的文件放在闪存里，不仅可以在一台电脑上使用，还能借给朋友，这种“共享经济”在基因界也在不断上演。
质粒载体就是这样的存在，方便又实用，真是个好帮手！1.2 噬菌体载体再说说噬菌体载体。
这个名字听起来就有点威风，实际上它就是一种能感染细菌的病毒。
噬菌体载体像个特种部队，能精准地将目标基因送到细菌里。
它的特点是能在细菌中以极高的效率进行复制。
想象一下，像忍者一样悄无声息地完成任务，真是酷毙了！当然，它的使用相对复杂，需要一定的技术支持，不过一旦掌握，可是非常厉害的工具。
2. 常见的真核载体讲完细菌的载体，咱们再来看真核细胞的载体，这可得好好聊聊了。
2.1 真核表达载体真核表达载体，是为了在真核细胞中表达外来基因而设计的。
这就像是在高档餐厅里，得有专业的厨师才能把菜做好。
真核表达载体通常含有强大的启动子、终止子和选择标记。
它们能够确保外来基因在真核细胞中顺利表达。
举个例子，就像你去商场买了新衣服，得先试穿才知道合不合适，对吧？这载体也得确保外来基因在细胞中能够“穿”得合适，才能发挥作用。
第三章基因工程的载体一、概述二、质粒载体三、表达载体一、概述•1 概念•载体：携带外源目的基因或DNA片段进入宿主细胞进行复制和表达的工具称之为载体，化学本质是DNA分子。
•克隆载体：主要用来克隆和扩增DNA片段，能带动外源基因在宿主细胞中复制扩增。
•表达载体：除具有克隆载体的基本元件外，还具有转录、翻译所必需的DNA元件，使外源基因在宿主细胞中有效表达。
一、概述•2 功能•运送外源基因高效转入受体细胞；•为外源基因提供复制能力和整合能力；•为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。
一、概述•3 分类•按来源分：质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、酵母人工染色体载体•按功能和用途分：克隆载体和表达载体•按性质分：融合型载体和非融合型载体•按受体细胞分：原核细胞载体和真核细胞载体一、概述•4 特性•载体能在宿主细胞内进行独立稳定的DNA自我复制；或整合到染色体DNA上，随着染色体DNA的复制而同步复制；在载体中插入外源基因后，仍然保持稳定的复制状态和遗传特性；•载体容易从宿主细胞中分离纯化；•有限制性酶切的克隆位点，以便于目的基因的组装，即多克隆位点；一、概述•4 特性•能赋予细胞特殊的遗传标记，以便于对导入的重组体进行鉴定和检测；•载体在细胞内的拷贝数高，方便外源基因在细胞内大量扩增；•载体在细胞内稳定性高，保证重组体稳定传代而不易丢失；•用于表达目的基因的载体还应具有启动子、增强子二、质粒载体1、质粒的基本特性2、常用的质粒载体3、质粒DNA的提取4、大肠杆菌感受态细胞的制备及转化二、质粒载体质粒载体是以质粒DNA分子为基础构建而成的基因载体，主要用于原核生物和真核生物的基因转移及建立基因组文库和cDNA文库。
1、质粒的基本特性（1）概念①染色体外的遗传因子，能进行自我复制（但依赖于宿主编码的酶和蛋白质）；②大多数为双链，闭环DNA分子，少数为线形；③大小为1 kb-200 kb，也有更大的。
双螺旋共价闭合环（超螺旋）开环双螺旋（一个裂口）线状双螺旋（两个裂口）构型：共价闭合环状、开环和线性（2）质粒的复制﹡ 复制起始区：通常一个质粒含有一个与相应的顺式作用控制要素结合在一起的复制起始区。
﹡ 复制子有不同的组成方式：滚环、θ等；﹡ 在E.coli中，使用的大多数载体都带有一个来源于pMB1质粒或ColE1质粒的复制子。
（3）拷贝数严谨型：拷贝数较少，大约1-几个松弛型：拷贝数较多，几十至几百一些质粒载体所携带的复制子及拷贝数质粒复制子拷贝数pBR322及其衍生质粒pMB1 15-20 pUC载体pMB1 500-700 pACYC及其衍生质粒p15A 10-12（4）质粒的不相溶性﹡ 两种质粒在同一宿主中不能共存的现象称为质粒的不相溶性。
﹡ 在第二个质粒导入后，在不涉及DNA限制系统时，不相溶的质粒一般为利用同一复制系统，质粒分配到子细胞时会发生竞争，随机挑选，最终放大。
（4）质粒的不相溶性﹡ 不相溶群：指那些具有不相溶的质粒组成的一个群体，一般具有相同的复制子。
现已发现30多个不相溶群。
（5）转移性﹡ 在自然条件下，很多质粒可以通过细菌接合的作用转移到新宿主内。
﹡ 要素：移动基因mob，转移基因tra，转移起始位点。
﹡ 例：pBR322有起始位点bom的nic位点，可在第三个质粒（如ColK）编码的转移蛋白质作用下，通过接合性质粒来进行转移，但大多数载体无nic/bom位点（如pUC ）。
（6）选择标记选择标记基因用于鉴别目标DNA的存在，将成功转化了质粒的宿主挑选出来。
(1)氨苄青霉素抗性基因ampicillin,Amp r, amp r青霉素抑制细菌细胞壁肽聚糖的合成，与有关的酶结合，抑制转肽反应并抑制其活性。
Amp r编码一个酶，可分泌进入细菌的周质区，并催化β-内酰胺环水解，从而解除氨苄青霉素的毒性。
（2）四环素抗性基因tetracycline,tet r四环素与核糖体30 S亚基的一种蛋白质结合，从而抑制核糖体的转位。
tet r基因编码一个由399个aa组成的膜结合蛋白，可阻止四环素进入细胞。
（3）氯霉素抗性基因chloramphenicol,Cm r, CatCm与核糖体50 S亚基结合并抑制蛋白质合成。
Cat基因编码一个四聚体细胞质蛋白，每个亚基23 kDa。
氯霉素乙酰转移酶在乙酰辅酶A存在的条件下，催化氯霉素羟乙酰氧基衍生物的形成，该产物不能与核糖体结合。
（4）卡那霉素和新霉素抗性基因kanamycin / neomycin 可与核糖体成分相结合并抑制蛋白质合成的脱氧链霉胺氨基糖苷。
这两种抗生素可被氨基糖苷磷酸转移酶(APH(3‘)-II)所灭活，该酶为25 kDa ，似乎位于外周质腔，这些抗生素的磷酸化干扰了它们向细胞质内的主动转移。
（5）Sup F琥珀突变抑制基因终止密码：UAA（赭石），UAG（琥珀），UGA（乳白）Sup F编码细菌的抑制性tRNA，在某一宿主中含具琥珀突变的tet r和amp r，只有当含Sup F的质粒转入后，宿主才会对amp和tet具抗性。
（6）其它正向选择标记质粒可编码一种使某些宿主菌致死的记忆产物，而含有外源基因片段插入后，该基因便失活。
筛选标记插入失活：在质粒pBR322的抗四环素基因上插入一个外源基因后，导致抗四环素基因失活，变成只对氨苄青霉素有抗性，这样就可通过对抗生素是双抗还是单抗来筛选是否有外源基因片段插入到载体中，这种筛选方法称为插入失活。
筛选标记α-互补（α-complementation ）Lac Z ´基因的互补编码缺失第11-41位氨基酸宿主LacZ LacZ ΔM15β-半乳糖苷酶1024 aa载体140 aa140 aa+MCS LacZ ´IPTG：异丙基-β-D-硫代半乳糖苷Isopropyl-β-D-Thiogalactoside诱导物X-gal：5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β-D-Galactoside 底物（生色剂）β-半乳糖苷酶分解x-gal形成蓝色产物MCS：Multiple cloning sitesLacZ ΔM15LacZ´IPTG/x-galLacZ ΔM15LacZ ´蓝色LacZ ΔM15 LacZ ´ΩDNA IPTG/x-gal白色在载体中加入一个短区段，含LacZ基因的调控区和前140个aa的编码信息，在这个编码区中插入一个多克隆位点，它并不破坏阅读框架，相当于在β-半乳糖苷酶的氨基端插入了几个氨基酸，而不影响未加几个氨基酸时的功能。
lacZΔM15编码缺失第11-41位氨基酸的β-半乳糖苷酶，但无酶学活性。
当LacZ´与lacZΔM15的产物混合在一起时却有酶学活性，所以在载体上加lacZ/（MCS），并在受体菌中引入lacZΔM15即可实现α-互补。
在生色底物（x-gal）存在下形成蓝色菌落，而外源基因插入到质粒的MCS后，几乎不可避免地导致产生α-互补能力的氨基酸片段。
α-互补：LacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酶阴性的突变体之间实现互补。
lacZΔM15 放在F质粒上，随宿主传代lacZ ´放在载体上，作为筛选标记相应的受体菌：TG1，XL1-Blue，JM101等。
（7）质粒载体的多克隆位点基因工程载体含有一个人工合成的多种限制性内切核酸酶的单一识别序列，称为多克隆位点（multiple cloning site, MCS)（8）质粒DNA的电泳特征共价闭环DNA：covalentlyclosed circular DNA,cccDNA开环的双链环状DNA：open circular DNA，ocDNA线形DNA：linear DNAL-DNA 共价闭环DNA开环的双链环状DNA 线形DNA2、常用的质粒载体具备以下特点：①在宿主细胞内必须能进行自主复制（具备复制原点）；②必须具备合适的酶切位点，供外源DNA片段插入，同时不影响其复制；③有一定的选择标记，用于筛选。
（1）pSC101，ColE1载体较大，酶切位点少﹡ 转化效率与大小成反比，大于15 kb转化效率成为限制因素；﹡ 质粒约大，约难于用限制酶切进行鉴定；﹡ 质粒约大，拷贝数越低。
改进策略：﹡ 去掉多余片段﹡ 提供多克隆位点﹡ 筛选标记﹡ 增加辅助功能：表达载体（2）pBR3224361 bpGenBank V01119,J01749 含有30多个单一位点amp r和tet r可通过插入失活进行筛选（3）pUC18，pUC19﹡ 2686 bp﹡ GenBank L08752/X02514﹡ 来自pBR322﹡ amp r﹡ MSC有10个位点﹡ α-互补﹡ 用途：cloningexpression(利用lacZ promoter)sequence(universal and reverse prime)pUC18（4）pUC118，pUC119﹡ 3162 bp﹡ GenBank U07649/U07650﹡ amp r﹡ MSC有10个位点﹡ α-互补﹡ 用途：分离ssDNA，诱变，探针，测序pUC118 pUC119（5）pBluescript M13+、M13-又叫pBluescript SK+、SK-﹡ 2960bp﹡ GenBank X52325/X52326﹡ amp r﹡ 在MCS位点两侧，含有一对T3和T7噬菌体的启动子﹡ α-互补﹡ 用途：测序，探针pBluescript SK+、SK-（6）pSP64、pSP65﹡ 2999/3005 bp﹡ amp r﹡ 含有噬菌体SP6的RNA聚合酶启动子﹡ 用途：克隆外源DNA片段探针pSP64 pSP65（7）pGEM-3Z﹡ 2743 bp﹡ amp r﹡ 含有噬菌体的T7和SP6启动子﹡ 用途：克隆外源DNA片段探针pGEM-3Z（8）pUCm-T﹡商业化的克隆载体﹡用于PCR产物的克隆﹡2773 bp﹡amp r3、质粒DNA的提取质粒DNA的小量制备（碱裂解法）（1）细菌的培养将3 ml含相应抗生素的LB培养基加入到10 ml的细菌管中，然后接入一单菌落，于37℃、150 r/min下培养过夜。
（2）细菌的收获将1.5 ml细菌培养物加入1.5 ml离心管中，于4℃、8000 r/min离心30 s，倒掉上清液，使细菌沉淀尽可能干燥。
