下载文档原格式
Lowry法检测蛋白质的含量1. 蛋白含量检测的方法1.1 凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
蛋白质是含氮的有机化合物。
蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
1.2 双缩脲法双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。
双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。
当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。
鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。
鉴定反应蛋白质单位1-10mg。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。
1.2.1 双缩脲反应双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
1.3 紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。
吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。
利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。
低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。
lowry法测蛋白质含量注意事项
以下是 7 条关于“lowry 法测蛋白质含量注意事项”：
1. 嘿，可别小看试剂的准备啊！就像战士上战场不能没带好武器一样。
比如你准备酚试剂的时候，要是不仔细，量没把控好，那结果能准吗？
2. 操作过程中一定要仔细再仔细呀！你想想，盖房子不仔细能坚固吗？测的时候一定要精确加样，要是手抖一下多加了或者少加了，那岂不是白费功夫啦！
3. 反应时间可得严格把控呀！你说跑步比赛，规定时间到了你还没到终点那能行吗？这个时间可不是随便糊弄的哦！
4. 注意实验环境啊！周围要是乱糟糟的，一会儿这个干扰，一会儿那个捣乱，那还怎么准确测呀！好比在一个嘈杂的菜市场，你能静下心学习吗？
5. 样品处理可别粗心大意哟！这就好比做菜前准备食材，处理不好菜能好吃吗？要是样品没处理到位，那后面的数据能可靠吗？
6. 仪器设备一定要稳定可靠呀！这就像你坐的车，要是随时可能抛锚，你还敢安心坐吗？不稳定的仪器会让你的实验结果乱七八糟的！
7. 每次实验都要有记录呀！这就像记日记一样，不记下来回头怎么知道当时发生了啥呢！别偷懒不做记录，不然有问题都找不到原因！
我的观点结论就是：lowry 法测蛋白质含量真不是随随便便就能做好的呀，一定要认真对待这些注意事项，不然得出错误结果可得不偿失啦！。
蛋白质测定方法蛋白质是生物体内一种重要的有机物质，对于生物体的生长、发育和代谢具有重要作用。
因此，蛋白质的测定方法显得尤为重要。
本文将介绍常见的蛋白质测定方法，希望能够为相关研究和实验提供帮助。
一、Lowry法。
Lowry法是一种常用的蛋白质定量方法，其原理是利用蛋白质与铜离子和碱性试剂在碱性条件下发生的还原反应，生成紫色络合物，通过比色测定蛋白质含量。
该方法具有灵敏度高、线性范围广、稳定性好的特点，适用于多种类型的蛋白质样品。
二、BCA法。
BCA法是一种基于铜离子的蛋白质测定方法，原理是蛋白质与试剂中的碱性铜离子在碱性条件下发生蓝色产物，通过比色测定蛋白质含量。
相比于Lowry法，BCA法具有操作简便、快速、灵敏度高的特点，适用于高通量的蛋白质测定。
三、Bradford法。
Bradford法是一种基于染料结合的蛋白质测定方法，原理是蛋白质与染料结合后产生颜色变化，通过比色测定蛋白质含量。
该方法具有操作简便、快速、灵敏度高的特点，对于一些含有胶体物质或其他干扰物质的样品，Bradford法的选择性更好。
四、UV吸收法。
UV吸收法是一种常用的蛋白质测定方法，原理是利用蛋白质特有的氨基酸在紫外光区域的吸收特性，通过测定蛋白质在280nm处的吸光度来定量测定蛋白质含量。
该方法操作简便、快速，适用于纯化后的蛋白质样品的测定。
五、荧光法。
荧光法是一种基于蛋白质荧光特性的测定方法，原理是蛋白质在特定激发波长下产生荧光信号，通过测定荧光强度来定量测定蛋白质含量。
该方法具有灵敏度高、选择性好的特点，适用于高通量的蛋白质测定。
六、总蛋白法。
总蛋白法是一种常用的蛋白质测定方法，原理是利用蛋白质与试剂中的染料结合后产生颜色变化，通过比色测定蛋白质含量。
该方法操作简便、快速，适用于多种类型的蛋白质样品。
总结。
蛋白质的测定方法多种多样，选择合适的方法需要根据样品的特性、实验的目的和仪器设备的条件来综合考虑。
希望本文介绍的蛋白质测定方法能够为相关研究和实验提供参考，促进科研工作的开展。
蛋白质浓度测定 Folin-Phenol (Lowry)测定法目的要求(1)学习Folin-phenol法测定蛋白质含量的原理及方法。
(2)制备标准曲线，测定未知样品中蛋白质含量。
原理目前蛋白质含量测定有两类方法，一类是利用蛋白质的物理化学性质，如折射率、比重、紫外吸收等测定得知;另一类是利用化学方法测定蛋白质含量，如微量凯氏定氮、双缩脉反应、Folin-phenol试剂法(又名Lowry method)。
Folin-phenol法的优点是操作简单，迅速，不需特殊仪器设备，灵敏度高，较紫外吸收法灵敏10-20倍，较双缩脲法(Biuret method)灵敏100倍，反应约在15min内有最大显色，并至少可稳定几小时。
其不足之处是此反应受多种因素千扰。
在测试时应排除千扰因素或做空白试验消除。
Folin-phenol试剂可由A试剂与B试剂组成。
A试剂由碳酸钠、氢氧化钠、硫酸铜及酒石酸钾钠组成。
蛋白质中的肢键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。
B试剂是由磷铝酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。
此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪胺酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。
此法也适用于测定酪胺酸与色胺酸含量。
本法可测定范围是25-250 μg蛋白质。
试剂和器材一、试剂1．标准蛋白质溶液结晶牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)配制成标准液150 μg/ml 蛋白质溶液。
2．Folin-phenol试剂二、测试样品三、器材试管及试管架，0．5，1及5m1吸量管，恒温水浴，分光亮度计操作方法一、制作Folin-phenol法标准曲线取7支试管，依下表操作。
绘制标准曲线:以A650值为纵坐标，标准蛋白质含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
1234567标准蛋白质溶液/ml0.10.20.40.60.81.0蒸馏水/ml1.00.90.80.60.40.2Folin-phenol试剂/ml 5.05.05.05.05.05.05.0混匀，于20-25 °C放置10 min，以蒸馏水为空白，在650 nm处比色A650本实验选用波长650 nm。
Lowry法测蛋白质含量本法用于微量蛋白质的含量测定，可检测的最低蛋白质量达5μg，通常测定范围是20~250μg。
蛋白质在碱性溶液中可形成铜-蛋白质复合物，此复合物加入酚试剂后，产生蓝色化合物，该蓝色化合物在650nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，根据供试品的吸光度，计算供试品的蛋白质含量。
试剂（1）酚试剂（2）碱性铜溶液：摇匀，即得。
本液应临用配制。
标准蛋白质溶液的制备取人血白蛋白标准品一支，用超纯水定量稀释至1mg/ml，作为贮备液。
精密量取贮备液1.0ml置10ml离心管中，用超纯水稀释至10ml，摇匀，即为100μg/ml 的标准蛋白质溶液。
测定法准确量取超纯水1.0 ml，作空白对照。
精密量取标准蛋白质溶液0.2ml、0.4ml、0.6ml、0.8ml、1.0ml分别置于试管中，加超纯水至1.0 ml；精密量取一定体积供试品（含蛋白质50μg左右）置试管内，样品1α-IFN，分别取50ul和30ul，加超纯水至1.0 ml，稀释20倍和33.3倍；精密量取一定体积供试品2（含蛋白质50μg左右）置试管内，实验室样品2，分别取100ul和200ul，加超纯水至1.0 ml，稀释10倍和5倍；每管都加入碱性铜溶液5ml，摇匀，室温放置10分钟；快速加入酚试剂0.5ml，马上摇匀，室温放置8分钟，显色后，照紫外-见分光光度法，在波长650nm 处测定吸光度。
结果如下：以标准曲线的蛋白质浓度对应其吸光度，求直线回归方程；将测得供试品的吸光度代入直线回归方程，即得供试品的蛋白质含量。
方程：y=0.0023x + 0.0261 R2 =0.9961样品1α-IFN：7号管，稀释20倍，OD值0.163，经计算x = 59.52μg/ml，样品蛋白浓度为1.190 mg/ml。
8号管，稀释33.3倍，OD值0.110，经计算x = 36.48μg/ml，样品蛋白浓度为1.216 mg/ml。
则样品1 α-IFN的蛋白浓度为1.203mg/ml。
Lowry法检测蛋白质的含量1. 蛋白含量检测的方法1.1 凯氏定氮法凯氏定氮法是测定化合物或混合物中总氮量的一种方法。
蛋白质是含氮的有机化合物。
蛋白质与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。
然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，并换算成蛋白质含量。
由于蛋白质含氮量比较恒定，可由其氮量计算蛋白质含量，故此法是经典的蛋白质定量方法。
1.2 双缩脲法双缩脲法是一个用于鉴定蛋白质的分析方法。
双缩脲试剂是一个碱性的含铜试液，呈蓝色，由1%氢氧化钾、几滴1%硫酸铜和酒石酸钾钠配制。
当底物中含有肽键时（多肽），试液中的铜与多肽配位，配合物呈紫色。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可通过比色法分析浓度，在紫外可见光谱中的波长为540nm。
鉴定反应的灵敏度为5-160mg/ml。
鉴定反应蛋白质单位1-10mg。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。
主要的缺点是灵敏度差，不适合微量蛋白的测定。
1.2.1 双缩脲反应双缩脲（NH2CONHCONH2）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。
在强碱性溶液中，双缩脲与二价铜离子形成紫色络合物，称为双缩脲反应。
凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
1.3 紫外吸收法蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质。
吸收高峰在280nm处，其吸光度（即光密度值）与蛋白质含量成正比。
此外，蛋白质溶液在238nm的光吸收值与肽键含量成正比。
利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。
紫外吸收法简便、灵敏、快速，不消耗样品，测定后仍能回收使用。
低浓度的盐，例如生化制备中常用的（NH4）2SO4等和大多数缓冲液不干扰测定。
Lowry–Folin法测定液体样品中蛋白质含量一、实验目的1、了解测定蛋白质的常用方法2、掌握蛋白质含量测定的经典Lowry–Folin法。
二、实验原理在碱性溶液中，蛋白质中的肽键与铜盐可产生双缩脲反应，产生络合物，此络合物会将磷钼酸-磷钨酸试剂还原，产生深蓝色复合物。
在一定的条件下，蓝色深浅与蛋白质的量成正比。
在波长540nm处测定样品的吸光度，与标准曲线对比，可确定其蛋白质含量。
这种方法是检测可溶性蛋白质含量最灵敏的经典方法之一。
三、实验步骤1、标准曲线的绘制(1)取10ml具塞试管6支，编号，分别准确吸取、、、、、血清蛋白溶液置于相应的试管中，在各试管中分别加入、、、、和的蒸馏水，使总体积达到。
不同浓度BSA溶液的配置编号012345BSA水BSA质量04080120160200(2)取试剂，试剂和试剂，在50ml三角瓶中混匀，在每只试管中分别准确加入此试剂，充分摇匀，静置15min.(3)分别在各试管中准确加入Folin-酚试剂稀释液，立刻震荡，充分摇匀。
(4)静置30min，在540nm波长下测定每个试管中溶液的吸光度(A值)。
(5)以A值为纵坐标，BSA质量(即0~200μg)为横坐标，绘制标准曲线，求出回归方程和相关系数R2。
2、样品的测定将啤酒样品适当稀释(20倍)，吸取2份，各，重复步骤1中的(2)~(4)。
四、实验试剂1、试剂A：称取溶于1000ml(最终体积)/LNaOH中。
2、试剂B：称取CuSO4·溶于100ml(最终体积)蒸馏水中。
3、试剂C：称取酒石酸钾钠溶于100ml(最终体积)蒸馏水中。
4、牛血清蛋白(BSA)标准溶液：准确称取牛血清蛋白，配制成浓度为200μg/ml的溶液。
5、2mol/LFolin-酚试剂。
五、实验数据与处理分组012345样品1样品2吸光度样品中蛋白质的含量(μg/ml)=XAⅩNⅩ式中，XA——根据标准曲线计算出来的蛋白质量(对应稀释样品中的蛋白质浓度，μg/ml)N——样品的稀释度数(N=20)计算：标准曲线y=+(R2=)当y1=时，代入得x1=(μg/ml)样品1中蛋白质含量m1=/ml当y1=时，代入得x1=(μg/ml)样品1中蛋白质含量m1=/ml当y2=时，代入得x2=(μg/ml)样品2中蛋白质含量m2=/ml平均含量：(+)/2=mg/ml平均偏差：()/2=相对平均偏差：/Ⅹ100%=%六、实验注意事项1、加入Folin-酚试剂后立即将反应液摇匀，以便Folin-酚试剂在碱性溶液中破坏之前即能被铜-蛋白质复合物还原。
实验19Lowry法测定蛋白质含量_基础生物学实验（安徽大学
研究生复试用,生物生命科学）
实验十九Lowry法测定蛋白质含量
一、实验目的
1.掌握Lowry法测定蛋白质含量的原理和方法。
2.学会测定未知样品中蛋白质含量。
二、实验原理
蛋白质(protein)是重要的生命物质。
细胞干重的一半是蛋白质，肌肉、皮肤、血液、毛发的主要成分都是蛋白质。
蛋白质在细胞和生物体的生命活动过程中起着十分重要的作用。
蛋白质参与基因表达的调节，以及细胞中氧化还原反应、电子传递、神经传递乃至学习和记忆等多种生命活动过程。
在细胞和生物体内各种生物化学反应中起催化作用的酶主要也是蛋白质。
许多重要的激素，如胰岛素和胸腺激素等也都是蛋白质。
蛋白质属于生物大分子，肽键(-CO-NH-)是蛋白质的特征连接键，凡含有肽键或类似肽键结构的化学物质，均可在碱性条件下与Cu2+络合起显色反应,即双缩脲反应；带有酚羟基的酪氨酸广泛地分布于蛋白质中，在碱性环境中，其可与磷钨酸和磷钼酸的混合物(福林酚试剂)反应，生成磷钼蓝和磷钨蓝的深蓝色混合物，颜色深浅与蛋白含量成正相关起显色反应。
这两个显色反应的结合是Lowry蛋白质测定法的基础，两个显色反应的结果，不仅保持了在一定范围内光吸收度和反应物浓度的线性关系，而且大大提高了灵敏度。
Lowry蛋白质测定法运用广泛，操作简便，但易受多种化学杂质的干扰，包括柠檬酸、EDTA、酚类、巯基乙醇、水杨酸盐等，这些局限影响了该法的适用范围。
三、实验用品
（一）材料人血清（从血站购得），使用前稀释500倍。
（二）器材UV2100分光光度计、电热恒温水浴锅、试管及试管架、吸量管及吸量管架、吸耳球。
（三）试剂
1．标准酪蛋白溶液
称取250 mg干酪素，用0.1 mol/L氢氧化钠加热溶解后，用水定容至500 ml，则配成500μg/ml标准酪蛋白溶液。
2. 双缩脲试剂
A液：4 %碳酸钠溶液；B液：0.2 mol/L氢氧化钠溶液；C液：1%硫酸铜溶液
(CuSO
4·5H
2
0)；D液：2%酒石酸钾钠溶液。
临用前，将A和B液等体积混合，C和
D液等体积混合，再将前后两种混合液按50:1的比例混合，即制得试剂甲。
双缩脲试剂须临用前配制，只能使用1天。
3. 福林酚试剂
100 g钨酸钠(Na
2W0
4
·2H
2
0)，25 g钼酸钠(Na
2
MoO
4
·2H
2
0)，加到2 L磨口烧
瓶中，再加700 ml蒸馏水、50 ml 85%磷酸和100 ml浓盐酸，充分混合后，在通
风橱中回流10小时。
然后加入150g Li
2SO
4
，50 m1蒸馏水及数滴液溴，开口煮沸
15 min。
冷却后定容至1000 ml，过滤得到福林酚试剂贮备液，此液可放冰箱中长期保存。
临用前，将贮备液稀释1倍待用。
四、实验操作
(一)标准曲线的制作
取6支洁净试管，分别加入0 ml，0.2 ml，0.4 ml，0.6 ml，0.8 ml和1.0 m1标准酪蛋白液，用水补足至1.0 ml。
按顺序向各管中加入5.0 ml试剂甲，摇匀，室温放置10min。
再加入0.5 m1试剂乙，加完后立即摇匀，然后放入30℃恒温水浴中(或室温)30 min。
用UV2100分光光度计在500 nm处测光密度值，以加0 ml 标准酪蛋白液的试管为对照，以光密度值为纵坐标，以加入标准酪蛋白液ml数为横坐标，制定标准曲线。
(二)血清稀释液蛋白质的测定
取2支洁净试管，各加入1.0 ml血清稀释液，再按标准曲线制作方法先后加入双缩脲试剂及福林酚试剂。
然后进行分光光度计测定。
(三)计算
首先计算出血清稀释液平均光密度值，对照标准曲线找出相应的标准酪蛋白ml数(a)，则每100 m1血清中含蛋白质的mg数为：血清中蛋白质含量(mg/100 m1)=a×500×500×100/1000
五、注意事项
1. 制作标准曲线时，吸量必须准确。
2. 因植物材料中酚类物质含量较多，本法不适宜测定植物粗提物中蛋白质含量。
3. 福林酚试剂只在酸性条件下稳定，因此在将其加入到碱性的铜-蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以保证还原反应正常进行。
六、实验作业及思考
1．计算出样品中蛋白质的百分含量。
2．Lowry法测定蛋白质含量的原理是什么？优缺点有哪些？
3. 作为标准蛋白的酪蛋白或牛血清清蛋白在应用时有何要求？（余嗣明陈彦）。
