实验十二 DNA的限制性内切酶酶切分析

实验四限制性内切核酸酶的酶切与鉴定一、实验原理限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特异核苷酸序列的DNA水解酶，主要存在于原核生物中。

根据限制酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。

其中Ⅱ类酶在分子克隆和基因操作中最为有用，是常用的分子生物学工具酶。

限制性内切酶识别序列长度一般为4～8个呈回文序列的特异核苷酸对。

一般情况下，识别序列越长，在同一DNA分子中识别位点出现的频率就越小。

许多限制性内切酶的酶切位点已被确定。

例如EcoRl 酶的识别与切割序列为以下6个碱基对。

5′……GAATTC……3′3′……CTT AAG…… 5′这些末端为互补的，即粘性末端，并可在连接酶的催化下与由EcoR I产生的其它分子末端相连接。

限制性内切酶主要用于基因组DNA的片段化、重组DNA分子的构建与鉴定、载体中目的基因片段的分离与回收以及DNA分子物理图谱的构建等。

根据酶切目的和要求不同，可有单酶切、双酶切或部分酶切等不同方式。

根据酶切反应的体积不同，可分为小量酶切反应和大量的酶切反应。

小量酶切反应主要应用于质粒的酶切鉴定，体积为20 μl, 含0.2～1 μg DNA，大量酶切反应用于制备目的基因片段，体积为50～100 μl，DNA用量在10～30ug。

本实验为EcoR I对质粒pUC18的小量酶切。

在质粒的双链环状DNA分子上有多个限制性内切核酸酶酶切位点。

在用特定的限制性内切核酸酶对质粒进行酶切反应后，通常可采用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定酶切效果。

二、仪器与试剂1.仪器：水浴锅、离心管、移液器、吸头、电泳设备等。

2.试剂：质粒pUC18、EcoR I限制性内切核酸酶、内切酶反应缓冲液、琼脂糖、电泳缓冲液、6×上样缓冲液、溴化乙啶染液、无菌水等。

DNA的限制性酶切及电泳分析DNA的限制性酶切及电泳分析实验目的：1．掌握限制性核酸内切酶消化DNA的原理。

2．掌握重组质粒DNA的酶切鉴定方法。

3．掌握琼脂糖凝胶电泳分析酶切结果。

基本原理限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA中特定碱基顺序的核酸水解酶（水解磷酸二酯键）。

根据酶的识别切割特性、催化条件及是否具有修饰酶活性，可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。

通常所指的DNA限制性核酸内切酶就是Ⅱ型酶。

主要试剂:重组质粒DNA 插入片段300bp本实验所用限制性核酸内切酶为EcoRⅠ，其识别顺序为：5′----G↓AATT C----3′3′----C TTAA↑G----5′磷酸二脂键断裂产生5′粘性末端。

操作步骤1. 反应体系的建立：⑴在一无菌1.5 ml Eppendorf管中加入：无菌双蒸水7 μl10×酶切缓冲液2 μl质粒DNA(100 ng/μl) 10 μlEcoRⅠ(5 U/μl) 1 μl总体积为20μl⑵轻轻混匀，12000 rpm离心5 sec。

2. 37 ℃水浴1 h。

3. 将Eppendorf管置65 ℃水浴中10 min，通过加热使酶失活以终止反应。

4. 12000 rpm离心5 sec，将管盖及管壁上的水离下。

5. 取10 μl消化产物，与2 μl 6×上样缓冲液混匀，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约100 V 30～60 min。

6 结果观察。

操作注意事项：1. 吸样量一定要准确2. 为了不使酶污染而导致浪费，最后才加酶3. 要求在冰上操作，并充分混匀，4. 开启Eppendorf管时，手不要接触到管盖内面，以防污染。

5. 样品在37 ℃与65 ℃保温时，将离心管盖严，以防水进入管内造成实验失败。

限制性内切酶酶解中常见的问题和原因1．DNA完全没有被限制性内切酶切割：①限制性内切酶失活；②DNA不纯，含有SDS、有机溶剂、EDTA等；③非限制性内切酶最佳反应条件；④酶切位点被修饰；⑤DNA上不存在该酶的识别顺序。

DNA限制性内切酶酶切分析一、原理限制性内切酶和基因载体是DNA重组技术中的两个极其重要的方面。

限制性内切酶是首先在大肠杆菌中发现的能够分解外来DNA的核酸酶。

与核酸外切酶相比，该酶可从DNA双链内部特异的核苷酸序列处将DNA双链切断，产生带有粘性或平头末端的DNA片段。

把要克隆的外来DNA和载体DNA用同一种限制性内切酶切割，即可产生带有相同粘性末端的DNA片段。

如果同时用两种不同的酶切割，则可产生带不同粘性末端的片段，通过电泳分离出所需要的目的基因片段。

把目的基因与切开的载体DN A混合，再经过DNA连接酶处理，转化和筛选即可得到希望的重组子。

进行DNA酶切时，根据具体情况可用单酶切或双酶切。

特定的酶有其配套的缓冲液。

进行双酶切时，应选用两种酶都适合的缓冲液；如果两种酶要求的温度不同时，先在较低温度下酶切，然后在较高的温度下酶切。

二、目的了解限制性内切酶的特性和DNA分子的结构，掌握DNA限制性内切酶酶切的图谱的分析方法。

三、材料、试剂与器具1、DNA样品。

2、限制性内切酶。

3、10×限制性内切酶反应缓冲液。

4、无菌双蒸水。

5、0.5M EDTA (pH 8.0)溶液。

6、10×TBE buffer。

7、琼脂糖。

8、溴化乙锭溶液。

9、上样缓冲液（40%蔗糖，0.25%溴酚兰）。

10、微量离心管、微量加样器、水浴锅、台式高速离心机、电泳仪、水平电泳槽。

11、10mg/ml Rnase。

四、操作步骤1、将在－20℃保存的DNA样品和10×限制性内切酶反应缓冲液取出，放在冰浴上融化待用。

2、取一干净无菌的微量离心管,按顺序加入以下组分：DNA样品 0.1-2mg10×内切酶反应缓冲液 1ml内切酶1 1ml内切酶2 1ml加无菌水至 10ml3、离心1秒钟，使管壁上的溶液集中到管底。

用手指轻弹管底部位使之混合，再离心一次，使管壁上的溶液集中到一起。

4、在37℃温育60－120分钟。

实验十二DNA的限制性内切酶酶切分析实验十二DNA的限制性内切酶酶切分析课程名称：生物化学与分子生物学实验课年级：2006专业、层次：临床医学本科授课教师：许成山职称：讲师学时：4学时基本教材：自编《生物化学与分子生物学实验指导》教学目的与要求：1、实现DNA的体外重组，鉴定Bcl-2重组质粒中的插入片段。

2、学会设计构建体外重组DNA分子，根据目的基因合理选择载体与限制性内切酶以及DNA的酶切技术。

大体内容与时间安排：1、DNA限制性内切酶酶切分析与琼脂糖凝胶电泳的原理10min2、DNA琼脂糖凝胶电泳的操作过程（录像）5min3、Eco RⅠ酶切操作步骤的改动注意事项5min4、学生做实验140min教学方法：讲授式+启发式教学重点、难点：重点：1、DNA限制性内切酶酶切分析与琼脂糖凝胶电泳的原理2、DNA限制性内切酶酶切分析的注意事项难点：DNA限制性内切酶酶切分析的原理一、实验原理（一）Eco RⅠ酶切重组质粒Bcl-2的原理：限制性内切酶(restriction endonuclease，RE)是由细菌自己产生的能识别双链DNA分子中的特定碱基顺序，并以内切方式水解核酸中的磷酸二酯键的核酸水解酶。

它可分为三种类型：Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型，Ⅱ型酶就是通常所指的RE，能识别双链DNA的特异顺序，并在这个顺序内进行切割。

它是基因工程中剪切DNA 分子的常用工具酶，被誉为分子生物学家的手术刀。

临床上某些遗传病是由于基因的缺失或插入或突变所致，可造成RE酶切位点的改变，故当用一定的RE切割时，其切开的片段(分子量)大小与正常人发生差异，即DNA限制性图谱发生改变，据此可达到基因诊断的目的。

实验可选用价格低廉、酶切效果好的Eco RⅠ(识别位点G↓AATTC)对λDNA进行酶切，观察RE的特定切割作用及其限制性图谱，理论上可产生分子量分别为21 226bp，7 421bp，5 804bp，5 604bp，4 878bp和3 530bp片段。

DNA的酶切与连接1. 实验目的了解DNA限制性内切酶和连接的作用原理，学习和掌握利用限制性内切酶进行DNA 消化和片段的方法和技术。

2. 实验原理DNA限制性内切酶和连接酶是遗传工程中实现DNA的切割和重组的重要工具酶，也是基因工程技术赖以生存的基础。

1970年Smith H·O等从流感病毒中提取了第一个限制性内切酶Hind II，其作用于外源DNA后，切割产生平末端。

人们经过研究发现，限制性内切酶可以识别双链DNA分子上的特异序列，通常识别区具有回纹结构，并使两个特定核苷酸之间的磷酸二酯键断裂。

目前已经从微生物中发现了200多种限制性内切酶，其中大部分可以切割DNA形成粘性末端。

如EcoR I，可以识别6个碱基的序列：▼5’ ――――――GA TTC――――――3’3’ ――――――CTTAAG――――――5’▲切割后形成的片段5’――――――G AA TTC――――――3’3’――――――CTTAA G――――――５’当限制性内切酶作用于DNA时可以形成的酶切片段数为：片段数目= 切点数+1 （线状DNA）片段数目= 切点数（环状DNA）切点出现的频率为1/4s（S为识别顺序所含的碱基数目）DNA连接酶则可以将切开的DNA片段连接起来，此时需要接口两端具有磷酸根。

对粘性末端的单链可以进行点接，对于平末端来说也可以进行连接，但是需要较多的酶。

在基因工程中，可以利用同一种限制性内切酶分别切割目标DNA和运载体，然后利用T4DNA 连接酶将目标序列整合到运载体中，使DNA中的3’-OH与5’-P生成磷酸二酯键。

3. 实验用具及材料电泳仪、恒温水浴锅、紫外检测仪、微量移液器、Eppendorf离心管10×酶切反应缓冲液、T4DNA连接酶缓冲液、溴酚蓝指示液、EB电泳缓冲液、PBR322质粒DNA、pXZ6质粒DNA，λphage DNA、DNA Marker EcoRI Hind III。

DNA的限制性内切酶酶切实验目的1.掌握DNA限制性内切酶酶切的原理与实验方法。

2.了解限制性内切酶的特点。

实验原理限制性内切酶是基因工程中剪切DNA分子常用的工具酶，它能识别双链DNA分子内部的特异序列并裂解磷酸二酯键。

根据限制性内切酶的组成、所需因子及裂解DNA的方式不同可分为三类，即Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。

重组DNA技术中所说的限制性内切酶通常指Ⅱ型酶。

绝大多数Ⅱ型酶识别长度为4～6个核苷酸的回文对称特异核苷酸序列（如EcoRⅠ识别六个核苷酸序列5′-G↓AATTC-3′），有少数酶识别更长的序列或简并序列。

实验器材移液器、移液器吸头、1.5ml离心管、离心管架、水浴锅、离心机、制冰机、漂浮板等。

实验试剂（1）DNA样品：质粒pUC19和基因3055。

（2）限制性内切酶、BamH I和EcoR I。

（3）通用型DNA纯化回收试剂盒（试剂盒组成见本篇“实验四DNA片段的纯化与回收”）。

实验操作（1）取2支离心管，在冰上按以下顺序分别配制酶切反应体系（50μl）：质粒pUC19/基因3055 43μl限制性内切酶5μlBamH I 1μlEcoR I 1μl（2）加完反应体系后，用手指弹管壁混匀，短暂离心，使反应液甩入离心管底部。

（3）将离心管插入漂浮板上，放置于水浴锅中，37℃水浴15min，然后80℃加热20min终止反应。

（4）使用通用型DNA纯化回收试剂盒回收酶切产物。

注意事项（1）注意要在冰上操作。

（2）加入限制性内切酶时，移液器吸头应贴着离心管壁沿着液面加入。

实验意义限制性内切酶是重组DNA技术中常用的工具酶，在体外构建重组载体时，用于特异性切割载体及目的基因。

思考题如何根据载体和目的基因选取合适的限制性内切酶？。