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第八章高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatograph)第一节概述（Generalization）以高压液体为流动相的液相色谱分析法称高效液相色谱法（HPLC）。
HPLC是20世纪70年代初发展起来的一种新的色谱分离分析技术。
具有分离效能高、选择性好、灵敏度高、分析速度快、适用范围广（样品不需气化，只需制成溶液即可）的特点，适用于高沸点、热不稳定有机及生化试样的分离分析。
HPLC基本方法是用高压泵将具有一定极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂泵入装有填充剂的色谱柱，经进样阀注入的样品被流动相带入色谱柱内进行分离后依次进入检测器，由记录仪、或数据处理系统记录色谱信号再进行数据处理而得到分析结果。
高效液相色谱法按固定相不同可分为液－液色谱法和液－固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液－液色谱）和吸附色谱法（液－固色谱）等。
目前，化学键合相色谱应用最为广泛，它是在液－液色谱法的基础上发展起来的。
将固定液的官能团键合在载体上，形成的固定相称为化学键合相，具有固定液不易流失的特点，一般认为有分配与吸附两种功能，常以分配作用为主。
C18（ODS）是最常使用的化学键合相。
根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。
《中国药典》中有50种中成药的定量分析采用HPLC法，在中药制剂分析中，大多采用反相键合相色谱法。
一、高效液相色谱法的特点目前经典LC主要用于制备，若用于分析则采用脱机或非连续检测。
经典LC填料缺陷，通常是填料粒度大、范围宽、不规则，不易填充均匀，扩散和传质阻力大，谱带展宽加大。
它存在致命弱点：速度慢、效率低和灵敏度低。
HPLC填料（高效固定相）颗粒细、直径范围窄、能承受高压。
高效液相色谱法（HPLC）一、方法原理1、液相色谱法概述高效液相色谱分析法其工作流程为：高压输液泵将贮液器中的流动相以稳定的流速(或压力)输送至分析体系，在色谱柱之前通过进样器将样品导人，流动相将样品依次带入预柱、色谱柱，在色谱柱中各组分被分离，并依次随流动相流至检测器，检测到的信号送至数据处理系统记录、处理和保存。
HPLC仪器的基本结构2、高效液相色谱法的特点（HPLC）与经典柱色谱原理相同，是由液体流动相将被分离混合物带入色谱柱中，根据各组分在固定相及流动相中吸附能力、分配系数、离子交换作用或分子尺寸大小的差异来进行分离。
由于高压输液泵、高灵敏度检测器和高效固定相的使用，提高了柱效率，降低了检出限，缩短了分析时间。
特点是选择性高、分离效能高、分析速度快的特点。
高沸点有机物的分析、离子型化合物、高分子化合物、热稳定性差的化合物以及具有生物活性的物质，弥补了气相色谱法的不足。
高效液相色谱法与气相色谱法相比，各有所长，互相补充。
如果能用气相色谱法分析的样品，一般不用液相色谱法，因为气相色谱法分析速度更快、更方便、成本更低。
3、高效液相色谱法的固定相和流动相（1）固定相表面多孔型和全多孔型两大类。
（2）流动相（淋洗液）流动相的选择对改善分离效果产生重要的辅助效应。
从实用，选用的流动相具有廉价、易购的特点外，还应满足下列要求：①与固定相互不相溶，并能保持色谱柱的稳定性。
②高纯度，以防所含微量杂质在柱中积累，引起柱性能的改变。
③与所用的检测器相匹配。
④应对样品有足够的溶解能力，以提高测定的灵敏度。
⑤具有低的黏度（可减少溶质的传质阻力，提高柱效）和适当低的沸点。
⑥应避免使用具有显著毒性的溶剂，以保证工作人员的安全。
液相色谱法中常用的流动相有正己烷、正庚烷、甲醇、乙腈等。
4、高效液相色谱法的主要类型（1）液—固吸附色谱法①分离原理：基于各组分吸附能力的差异来进行混合物分离的。
②固定相：极性和非极性两种。
极性固定相：硅胶、氧化镁。
HJ997-2018土壤和沉积物醛、酮类化合物的测定高效液相色谱法Soil and sediment—Determination of carbonyl compounds—High performance liquid chromatography（发布稿）本电子版为发布稿。
请以中国环境出版集团出版的正式标准文本为准。
2018-12-26发布2019-06-01实施生态环境部发布目次前言 (ii)1适用范围 (1)2规范性引用文件 (1)3方法原理 (1)4试剂和材料 (1)5仪器和设备 (2)6样品 (3)7分析步骤 (4)8结果计算与表示 (5)9精密度和准确度 (6)10质量保证和质量控制 (7)11废物处理 (7)12注意事项 (7)附录A（规范性附录）方法的检出限和测定下限 (8)附录B（资料性附录）15种醛、酮类腙衍生物的参考色谱图 (9)附录C（资料性附录）方法的精密度和准确度 (10)附录D（资料性附录）2,4-二硝基苯肼（DNPH）的纯化及空白检验 (16)i前言为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国土壤污染防治法》，保护生态环境，保障人体健康，规范土壤和沉积物中醛、酮类化合物的测定方法，制定本标准。
本标准规定了测定土壤和沉积物中醛、酮类化合物的高效液相色谱法。
本标准的附录A为规范性附录，附录B～附录D为资料性附录。
本标准为首次发布。
本标准由生态环境部生态环境监测司、法规与标准司组织制订。
本标准起草单位：天津市生态环境监测中心。
本标准验证单位：国家环境分析测试中心、上海市环境监测中心、沈阳市环境监测中心站、青岛市环境监测中心站、天津市产品质量监督检测技术研究院和天津市滨海新区环境保护监测站。
本标准生态环境部2018年12月26日批准。
本标准自2019年6月1日起实施。
本标准由生态环境部解释。
ii土壤和沉积物醛、酮类化合物的测定高效液相色谱法警告：实验中使用的有机溶剂和标准物质为有毒有害物质，标准溶液配制及样品前处理过程应在通风橱中进行；操作时应按要求佩戴防护器具，避免直接接触皮肤和衣物。
1适用范围本标准规定了测定土壤和沉积物中醛、酮类化合物的高效液相色谱法。
本标准适用于土壤和沉积物中甲醛、乙醛、丙烯醛、丙酮、丙醛、丁烯醛、丁醛、苯甲醛、异戊醛、正戊醛、邻-甲基苯甲醛、间-甲基苯甲醛、对-甲基苯甲醛、正己醛、2,5-二甲基苯甲醛等15种醛、酮类化合物的测定。
当取样量为10g，定容体积为10ml时，15种醛、酮类化合物的方法检出限为0.02 mg/kg~0.06mg/kg，测定下限为0.08mg/kg~0.24mg/kg。
详见附录A。
2规范性引用文件本标准内容引用了下列文件或其中的条款。
凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。
GB17378.3海洋监测规范第3部分样品采集、贮存与运输GB17378.5海洋监测规范第5部分：沉积物分析HJ494水质采样技术指导HJ613土壤干物质和水分的测定重量法HJ/T166土壤环境监测技术规范3方法原理土壤和沉积物样品用醋酸-醋酸钠溶液振荡提取，提取液中醛、酮类化合物在一定温度和pH值下与2,4-二硝基苯肼（DNPH）发生衍生化反应，生成稳定的腙类化合物，经萃取浓缩后，用高效液相色谱分离，紫外检测器检测，根据保留时间定性，外标法定量。
4试剂和材料除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂。
实验用水为二次蒸馏水或纯水设备制备的水，使用前需经过空白检验，确认目标化合物浓度低于方法检出限。
4.1氯化钠（NaCl）。
400℃灼烧4h，稍冷后置于干燥器中冷却至室温，转移至磨口玻璃瓶中，于干燥器中保存。
4.2无水硫酸钠（Na2SO4）。
400℃灼烧4h，稍冷后置于干燥器中冷却至室温，转移至磨口玻璃瓶中，于干燥器中保1存。
4.3醋酸钠（CH3COONa）。
4.4冰醋酸（CH3COOH）：含量≥98%。
4.5柠檬酸（C6H8O7）。
4.6柠檬酸钠（C6H5Na3O7·2H2O）。
4.72,4-二硝基苯肼[NH2NHC6H3(NO2)2，DNPH]：纯度≥99%。
4.8乙腈（CH3CN）：液相色谱纯。
4.9二氯甲烷（CH2Cl2）：液相色谱纯。
4.10氯化钠溶液：ρ（NaCl）=0.365g/ml。
称取36.5g氯化钠(4.1)，用水溶解定容至100ml。
4.11提取剂：醋酸-醋酸钠溶液。
称取5.3g醋酸钠（4.3），用水溶解后加入2.0ml冰醋酸（4.4），用水稀释定容至1L。
4.12缓冲溶液：pH≈3。
称取84.0g柠檬酸（4.5）和29.4g柠檬酸钠（4.6），用水溶解定容至500ml。
4.13衍生剂：ρ（DNPH）=3.00mg/ml。
称取3.00g2,4-二硝基苯肼（4.7）于乙腈（4.8）中，用乙腈溶解定容至1L。
4.14醛、酮类-DNPH标准溶液：ρ=100μg/ml（以醛、酮类化合物计）。
包括甲醛-DNPH、乙醛-DNPH、丙烯醛-DNPH、丙酮-DNPH、丙醛-DNPH、丁烯醛-DNPH、丁醛-DNPH、苯甲醛-DNPH、异戊醛-DNPH、正戊醛-DNPH、邻-甲基苯甲醛-DNPH、间-甲基苯甲醛-DNPH、对-甲基苯甲醛-DNPH、正己醛-DNPH、2,5-二甲基苯甲醛-DNPH。
溶剂为乙腈（4.8）。
可购买市售有证标准溶液。
4.15醛、酮类标准贮备液：ρ=1000μg/ml。
包括甲醛、乙醛、丙烯醛、丙酮、丙醛、丁烯醛、丁醛、苯甲醛、异戊醛、正戊醛、邻-甲基苯甲醛、间-甲基苯甲醛、对-甲基苯甲醛、正己醛、2,5-二甲基苯甲醛。
溶剂为乙腈（4.8）。
可购买市售有证标准溶液。
4.16醛、酮类标准使用液：ρ=100μg/ml。
移取1.00ml醛、酮类标准贮备液（4.15）于10ml容量瓶中，用乙腈（4.8）稀释定容。
4℃以下可冷藏保存2个月。
4.17石英砂：粒径为0.297mm~0.84mm（50目~20目）。
400℃灼烧4h，稍冷后置于干燥器中冷却至室温，转移至磨口玻璃瓶中，于干燥器中保存。
4.18玻璃纤维滤膜：孔径0.45μm。
4.19氮气：纯度≥99.9%。
5仪器和设备5.1高效液相色谱仪：具紫外检测器或二极管阵列检测器。
5.2色谱柱：十八烷基硅烷键合硅胶柱（C18），填料粒径5.0μm，柱长250mm，内径4.6mm，或其他等效色谱柱。
25.3样品瓶：不小于60ml具聚四氟乙烯-硅胶衬垫螺旋盖的棕色广口玻璃瓶。
5.4振荡器：水平振荡器或翻转振荡器。
5.5恒温振荡器：温度精度为±2℃。
5.6萃取设备：固相萃取装置或液液萃取装置。
5.7浓缩设备：旋转蒸发装置、K-D浓缩仪或氮吹浓缩仪等性能相当的设备。
5.8天平：感量为0.01g。
5.9固相萃取柱：C18柱或其他等效固相萃取柱，规格为1000mg/6ml或更大容量规格。
5.10分液漏斗：250ml，聚四氟乙烯活塞或不涂润滑油的玻璃活塞。
5.11提取瓶：200ml，具聚四氟乙烯-硅胶衬垫螺旋盖的玻璃瓶。
5.12平底烧瓶：200ml，具塞平底玻璃烧瓶。
5.13一般实验室常用仪器和设备。
6样品6.1样品采集和保存按照HJ/T166的相关规定进行土壤样品的采集和保存。
按照HJ494的相关规定进行水体沉积物样品的采集。
按GB17378.3的相关规定进行海洋沉积物样品的采集。
用铁铲或不锈钢勺将样品尽快采集至样品瓶（5.3）中，并填满。
快速清除掉样品瓶螺纹及外表面上黏附的样品，密封样品瓶，避光保存。
如不能及时分析，于4℃以下冷藏，5d 内完成衍生及萃取，衍生化提取物在7d内分析完毕。
6.2样品的制备去除样品中的异物（石子、叶片等），称取10g（精确到0.01g）样品于提取瓶（5.11）中。
同时称取另一份样品用于测定干物质含量或含水率。
6.3水分的测定按照HJ613测定土壤样品干物质含量，按照GB17378.5测定沉积物样品含水率。
6.4试样的制备6.4.1提取在装有样品（6.2）的提取瓶中，加入200ml提取剂（4.11），密封，在振荡器（5.4）中振荡不少于18h，用玻璃纤维滤膜（4.18）过滤，收集提取液，待衍生。
6.4.2衍生取100ml提取液（6.4.1）于平底烧瓶（5.12）中，加入4ml缓冲溶液（4.12）、6ml衍生剂（4.13），置于恒温振荡器（5.5）中，40℃振荡1h。
注：可使用可控温超声清洗器或超声萃取仪代替恒温振荡器，超声时间不少于30min，超声温度不超过40℃±2℃。
36.4.3萃取和浓缩6.4.3.1固相萃取法将固相萃取柱（5.9）固定在固相萃取设备（5.6）上，分别用10ml乙腈（4.8）和10ml 水活化萃取柱。
向衍生后的溶液（6.4.2）中加入10ml氯化钠溶液（4.10），并转移至萃取柱，上样速度为3ml/min~5ml/min。
再用10ml水冲洗容器和管路，完成后继续抽吸1min。
用9ml乙腈（4.8）以3ml/min~5ml/min的流速洗脱萃取柱，收集洗脱液至10ml容量瓶中，用乙腈（4.8）稀释至标线，混匀，待测。
6.4.3.2液液萃取法将衍生后的溶液（6.4.2）转移至分液漏斗（5.10）中，加入1.5g NaCl（4.1），分别用15ml和10ml二氯甲烷（4.9）分两次萃取，合并萃取液，萃取液经无水硫酸钠（4.2）脱水，用浓缩设备（5.7）浓缩至近干，更换溶剂为乙腈（4.8），用乙腈准确定容至10ml，混匀，待测。
注：高浓度样品可适当增加一次萃取。
6.5空白试样的制备以石英砂（4.17）代替样品，按照与试样的制备（6.4）相同的步骤进行空白试样的制备。
7分析步骤7.1参考色谱条件流动相：60%乙腈+40%水，等度洗脱，保持30min；检测波长：360nm；流动相流速：1.0ml/min；柱温：30℃；进样量：10μl。
7.2标准曲线的建立分别移取适量的醛、酮类-DNPH标准溶液（4.14），用乙腈（4.8）配制成质量浓度为0.03 mg/L、0.05mg/L、0.10mg/L、0.50mg/L、1.00mg/L和1.50mg/L的标准系列。
按照参考色谱条件（7.1）进行测定，以标准系列目标化合物浓度为横坐标，以其对应的峰面积或峰高为纵坐标，建立标准曲线。
7.3参考色谱图15种醛、酮类腙衍生物在C18柱（5.2）上的色谱图见图1。
注：其他不同类型色谱柱分离情况参见附录B。
451.甲醛-DNPH ；2.乙醛-DNPH ；3.丙烯醛-DNPH ；4.丙酮-DNPH ；5.丙醛-DNPH ；6.丁烯醛-DNPH ；7.丁醛-DNPH ；8.苯甲醛-DNPH ；9.异戊醛-DNPH ；10.正戊醛-DNPH ；11.邻-甲基苯甲醛-DNPH ；12.间-甲基苯甲醛-DNPH ；13.对-甲基苯甲醛-DNPH ；14.正己醛-DNPH ；15.2,5-二甲基苯甲醛-DNPH 。
