皱纹盘鲍细胞培养基及细胞系的构建方法与制作流程

第38卷第6期大连海洋大学学报Vol.38No.6 2023年12月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Dec.2023DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2023-111文章编号:2095-1388(2023)06-0947-09皱纹盘鲍肽聚糖识别蛋白的表达及免疫功能特性乔琨1,郑春花2,陈贝1,苏永昌1,郝华3,许旻1,蔡水淋1,刘智禹1∗(1.福建省水产研究所福建省海洋生物增养殖与高值化利用重点实验室,福建厦门361013;2.集美大学海洋食品与生物工程学院,福建厦门361021;3.厦门大学海洋与地球学院,福建厦门361102)摘要:为研究皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)肽聚糖识别蛋白HdhPGRP-SC2-like的免疫功能特性,利用RACE技术克隆了HdhPGRP-SC2-like基因的全长cDNA序列,采用实时荧光定量PCR(qPCR)分析了Hdh-PGRP-SC2-like基因的组织分布特征,通过原核表达获得了重组蛋白rHdhPGRP-SC2-like,并对其酰胺酶活性及免疫特性进行了验证㊂结果表明:HdhPGRP-SC2-like基因的cDNA全长为938bp,开放阅读框为780bp,编码260个氨基酸,包含保守的PGRP结构域和Ami_2结构域;HdhPGRP-SC2-like属于短型PGRP,与软体动物近缘物种PGRP具有高度相似性;qPCR分析显示,HdhPGRP-SC2-like mRNA在皱纹盘鲍各组织中均有表达,其中,鳃中表达量最高,外套膜㊁消化腺中表达量次之,腹足和血细胞中表达量较低;进一步构建原核表达载体pET-28a(+)-HdhPGRP-SC2-like,经诱导表达㊁分离纯化获得重组蛋白rHdhPGRP-SC2-like,该蛋白具有肽聚糖结合活性,且在Zn2+存在的情况下显示出酰胺酶活性㊂研究表明,HdhPGRP-SC2-like能够结合细菌肽聚糖成分,在机体抵御入侵细菌等免疫防御中发挥重要作用㊂关键词:皱纹盘鲍;肽聚糖识别蛋白;酰胺酶活性;免疫防御;细菌结合中图分类号:S917.4㊀㊀㊀㊀文献标志码:A㊀㊀贝类动物缺乏特异性免疫系统,主要依靠先天性免疫防御功能来抵御病原体的入侵,它们的免疫系统由物理防御㊁细胞免疫和体液免疫共同组成㊂当生物体受到外源病原微生物入侵时,天然免疫系统通过一系列基因编码的模式识别受体(pattern-recognition receptor,PRR)对微生物病原进行识别㊂在果蝇和按蚊中发现的PRR分为6个类型[1],包括肽聚糖识别蛋白(PGRP)㊁革兰阴性细菌结合蛋白(GNBP)㊁C型凝集素(CTL)㊁清道夫受体(SCR)㊁硫脂蛋白(TEP)和半乳糖凝集素(GALE)等㊂PRR可以识别多种病原体相关分子模式(PAMP),如细菌DNA㊁脂多糖(LPS)㊁肽聚糖(PGN)㊁双链病毒RNA和其他存在于多细胞生物[2]表面的非自身分子㊂肽聚糖识别蛋白(PGRP)是先天性免疫系统中一类重要的模式识别受体,可特异性识别细菌细胞壁主要成分肽聚糖㊂PGRP最初从家蚕的血淋巴中被发现并命名,其可以与革兰氏阳性细菌中Lys 型PGN结合[3]㊂PGRP广泛存在于从昆虫到人类的各种生物体中,哺乳动物中发现了4个PGRPs,即PGLYRP1㊁PGLYRP2㊁PGLYRP3和PGLYRP4㊂PGRP分为PGRP-S㊁PGRP-I和PGRP-L3种类型[4],其中PGRP-S和PGRP-L主要存在于一些无脊椎动物和脊椎动物中,而PGRP-I仅在哺乳动物中存在[4]㊂在软体动物中也鉴定出上百种PGRPs,例如大竹蛏(Solen grandis)SgPGRP-S1[5]㊁刺参(Apostichopus japonicus)AjPGRP-S[6]和皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai)HdPGRP[7]等㊂肽聚糖识别蛋白作为一种主要的模式识别受体,在先天性免疫中发挥着重要的作用㊂PGRP具有保守的酰胺酶活性结构域,能水解肽聚糖的酰胺键,从而降解病原体[8],也可激活Toll㊁IMD等信号通路的转录因子,诱导抗菌肽㊁活性氧的生成,发挥免疫效应[9]㊂皱纹盘鲍隶属于软体动物门(Mollusca)腹足纲(Gastropoda)前鳃亚纲(Prosobranchia)原始腹足目(Archaeogastropoda)鲍科(Haliotidae)㊂近㊀收稿日期:2023-05-12㊀基金项目:厦门市青年创新基金(3502Z20206002);福建省种业创新与产业化工程项目(2021FJSCZY02);福建省促进海洋与渔业产业高质量发展专项资金项目(FJHYF-L-2023-23);厦门市海洋与渔业发展专项资金资助项目(21CZP006HJ04)㊀作者简介:乔琨(1983 ),女,博士,助理研究员㊂E-mail:qiaokun@㊀通信作者:刘智禹(1971 ),男,博士,教授级高级工程师㊂E-mail:139****8638@年来,随着水产养殖规模的扩大㊁集约化程度的提高及沿海水质的日趋恶化,养殖鲍疾病频发,给养殖生产带来巨大的经济损失,严重阻碍了鲍产业的发展[10]㊂鲍疾病的发生与鲍自身的抗病能力㊁养殖密度㊁水质环境及病原菌有着密切的关系[11]㊂鲍免疫力下降和感染致病菌是鲍死亡的主要原因,因此,寻求免疫防治是保障鲍养殖业健康发展的重要措施㊂本研究中,从皱纹盘鲍机体自身的免疫防御体系入手,克隆了皱纹盘鲍肽聚糖识别蛋白基因HdhPGRP-SC2-like,通过体外重组表达获得了rHdhPGRP-SC2-like重组蛋白,并探讨了其与PGN 的结合活性及结合模式,以期为深入探索鲍抵御病原微生物的免疫应答机制提供科学参考㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料试验用皱纹盘鲍体质量为(63ʃ5)g,购自福建晋江福大鲍鱼水产有限公司,暂养于充氧并经沙滤的海水中,每日更换海水并投喂新鲜细基江蓠㊂试剂:RNAprep Pure动物组织总RNA提取试剂盒㊁RNAprep Pure培养细胞/细菌总RNA提取试剂盒㊁PrimerScript TM RT-PCR(Perfect Real Time)试剂盒均购自TaKaRa公司;FastStart Essential DNA Green Master购自Roche公司;M-MuLV Reverse Transcriptase㊁柱式DNA胶回收试剂盒㊁BL21 (DE3)感受态细胞㊁LB肉汤琼脂培养基㊁IPTG 和非预染蛋白marker均购自生工生物工程(上海)股份有限公司;Pierce BCA Protein Assay Kit购自Thermo公司;PGRP兔多克隆抗体(bs-7673R)购自Bioss公司;大肠杆菌肽聚糖㊁藤黄微球菌(Micrococcus luteus)肽聚糖均购自Sigma公司㊂1.2㊀方法1.2.1㊀HdhPGRP-SC2-like全长cDNA序列克隆㊀使用RNAprep Pure总RNA提取试剂盒提取皱纹盘鲍鳃总RNA[12]㊂利用酶标仪测得RNA的浓度㊂以特异性引物RT1/RT2逆转录得到cDNA,经RNase H和TdT处理后,用接头引物5ᶄadaptor㊁P1及特异引物R1㊁R2进行巢氏PCR,扩增5ᶄRACE序列㊂以3ᶄadaptor引物逆转录合成的cDNA为模板,用接头引物P1㊁P2及基因特异性引物F1㊁F2进行巢氏PCR,扩增3ᶄRACE序列,引物序列见表1㊂PCR反应程序:95ħ下预变性3min;95ħ下变性30s,58ħ下退火30s,72ħ下延伸60s,共进行33个循环;最后在72ħ下再延伸7min㊂将PCR产物克隆到pMD-18T载体并送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序㊂表1㊀引物序列Tab.1㊀Primer sequence information引物primer序列sequence(5ᶄ-3ᶄ)用途usage㊀㊀5ᶄadaptor GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-GCATGACAGTGCCCCCCCCCCCCCCC5ᶄRACE3ᶄadaptor GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-GCATGACAGTGTTTTTTTTTTTTTTTTTT3ᶄRACEP1GCTGTCAACGATACGCTACGTAAC5ᶄRACE㊁3ᶄRACE P2GCTACGTAACGGCATGACAGTG3ᶄRACE RT1TCTGATAGCTCCTGACTCTCT逆转录RT2TGATGGATGAAGGCGTAT逆转录F1ATCAACACCGTCAAGGCTCTCATTGCT3ᶄRACE F2AGGTACAGTGTTCTTTTATTAGGACGCCCA5ᶄRACE R1GCAAGATTCAGTCCAGCTACACCCTCAG3ᶄRACE R2GAATGCCTTGTTCCCACCCCAGA5ᶄRACE QF1GATTGAGCGGGTATTCGGGT RT-qPCR QR1CGTCAACAACCAGGCACTCT RT-qPCR RPL3F TCATTGCACACACCCAGACT内参基因RPL3R CAATGACCTCATCCTGTTCG内参基因1.2.2㊀HdhPGRP-SC2-like序列分析㊀使用DNASIS MAX软件预测HdhPGRP-SC2-like序列的开放阅读框(ORF)㊂通过ExPASy-Prosite()和SMART在线软件(http://smart.em-bl-heidelberg.de)预测HdhPGRP-SC2-like蛋白的特征㊂使用ExPASyprotParam工具(/protparam)预测HdhPGRP-SC2-like蛋白的分子质量和理论等电点㊂使用NCBI CD(Conserved Domain Search,https:/// Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析蛋白的保守结构域㊂使用NCBI Net WWW的BLASTN2和BLASTP程序进行同源性搜索(/ blast)㊂利用Clustal W创建多序列比对,并用邻接法和MEGA7.0软件构建HdhPGRP-SC2-like蛋白的系统进化树㊂1.2.3㊀HdhPGRP-SC2-like基因组织表达模式㊀随机选取3只皱纹盘鲍,分别采集其血细胞㊁鳃㊁上足㊁腹足㊁闭壳肌㊁外套膜和消化腺组织样本㊂使用RNAprep Pure总RNA提取试剂盒提取各组织的总RNA,并按照PrimerScript TM RT-PCR试剂盒说明书,将提取的总RNA进行反转录,合成第一链cDNA㊂采用实时定量PCR(qPCR)测定Hdh-PGRP-SC2-like mRNA的转录表达,用特异性引物QR1/QF1扩增HdhPGRP-SC2-like mRNA片断,以RPL3为内参基因[13](表1)㊂反应程序:95ħ下849大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第38卷变性10min;95ħ下变性10s,60ħ下退火10s, 72ħ下延伸10s,共进行45个循环㊂使用2-ΔΔCt 方法计算目的基因相对表达量㊂1.2.4㊀rHdhPGRP-SC2-like蛋白的重组表达㊀首先合成HdhPGRP-SC2-like pET-28a(+)重组表达载体,并转化至大肠杆菌BL21(DE3)pLysS中表达重组质粒㊂经IPTG诱导,用质量分数为12%的SDS-PAGE分析目标蛋白的表达水平㊂重组蛋白使用HisTrap TM FF Crude镍柱纯化[14],利用含不同浓度咪唑(20㊁50㊁500mmol/L)的磷酸盐洗脱缓冲液,收集蛋白的洗脱峰,最后将收集的样品用尿素梯度透析复性至PBS缓冲液中㊂使用BCA法测定重组蛋白的浓度㊂1.2.5㊀蛋白免疫印迹(Western blot)分析㊀重组表达的粗蛋白用质量分数为12%的SDS-PAGE分离,并转移到PVDF膜上㊂用含5%脱脂奶粉的PBST在37ħ下封闭2h,用PGRP兔多克隆抗体(1ʒ3000)在37ħ下孵育3h㊂用PBST洗涤4次,在37ħ下用辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔二抗(1ʒ10000稀释度)孵育60min㊂用PBST 洗涤4次后,再用3,3ᶄ,5,5ᶄ-Tetramethylbenzi-dine(TMB)显色并拍照㊂1.2.6㊀HdhPGRP-SC2-like结构预测与分子对接㊀采用AlphaFold2软件[15]对HdhPGRP-SC2-like蛋白的三维结构建模㊂采用MOE[16]软件对大肠杆菌PGN与HdhPGRP-SC2-like进行分子对接模拟㊂采用ChemDraw绘制PGN的二维结构,在MOE中通过能量最小化获得PGN的三维结构并作为配体,通过AlphaFold2预测获得HdhPGRP-SC2-like的三维结构并作为受体㊂参考果蝇PGRP-LB 蛋白[17]的PGN结合位点确定对接口袋,包括H108㊁H109㊁H132㊁Y143㊁H217㊁T223和C225等残基㊂对接流程选择柔性的Induced fit模式,结合口袋氨基酸的侧链并根据配体构象进行优化调整,约束侧链转动的权重设置为10㊂所有结合模式首先通过London dG打分函数进行排序,前30个构象通过进一步能量优化和GBVI/WSA dG方法对结合自由能再次评价㊂将最有可能的结合模式使用LigPlus进行分析,并采用PyMOL软件作图㊂1.2.7㊀rHdhPGRP-SC2-like与PGN结合活性测定㊀通过ELISA试验检测HdhPGRP-SC2-like蛋白与藤黄微球菌PGN㊁大肠杆菌PGN的结合情况㊂将藤黄微球菌PGN和大肠杆菌PGN用MilliQ配制质量浓度为1mg/mL的母液,用包被液分别稀释至质量浓度为80μg/mL,取50μL包被液加入微孔板,60ħ热击2h,封闭反应2h,用PBST洗涤3次;加入50μL不同质量浓度(0㊁6.25㊁12.5㊁25㊁50㊁100㊁200㊁400μg/mL)的纯化蛋白, 28ħ下孵育2h,用PBST洗涤3次;加入PGRP 兔多克隆抗体,37ħ下孵育1h,用PBST洗涤3次;用辣根过氧化物酶标记的二抗(1ʒ10000) 37ħ下孵育1h,用PBST洗涤3次;TMB显色液避光孵育20min,用浓度为2mol/L的H2SO4终止反应㊂使用酶标仪测定OD450nm吸光度㊂1.2.8㊀rHdhPGRP-SC2-like的酰胺酶活性测定㊀参照文献[8]中的方法,测定HdhPGRP-SC2-like 的酰胺酶活性㊂取一定量的藤黄微球菌PGN母液,分别溶解于HEPES缓冲液(20mmol/L,pH7.2,含150mmol/L NaCl)㊁HEPES-ZnCl2缓冲液(20mmol/L,pH7.2,含150mmol/L NaCl㊁10mmol/L ZnCl2)和HEPES-ZnCl2EDTA缓冲液(20mmol/L,pH7.2,含150mmol/L NaCl㊁10mmol/L ZnCl2㊁10mmol/L EDTA)中,并加入50μg/mL HdhPGRP-SC2-like,使其终浓度为1mg/mL,以PBS缓冲液作为阴性对照㊂在120min内每隔15min测定一次OD540nm吸光度㊂1.3㊀数据处理试验数据均以平均值ʃ标准误(meanʃS.E.)表示,采用SPSS19.0软件对试验数据进行单因素方差分析(ANOVA),显著性水平设为0.05㊂2㊀结果与分析2.1㊀HdhPGRP-SC2-like全长cDNA序列克隆HdhPGRP-SC2-like基因的ORF从实验室前期建立的Haliotis discus hannai转录组数据库中获得㊂通过巢氏PCR获得了5ᶄRACE序列和3ᶄRACE序列(图1)㊂经序列拼接最终获得938bp的Hdh-PGRP-SC2-like全长cDNA(GenBank登录号OQ621429),其中包含74bp的5ᶄ非翻译区和一个具有典型poly(A)尾巴的81bp3ᶄ的非翻译区㊂使用DNASIS MAX软件预测HdhPGRP-SC2-like cDNA的ORF,共编码260个氨基酸组成的多肽链(图2)㊂预测该蛋白的理论相对分子质量为28600,等电点为9.62㊂通过SMART预测Hdh-PGRP-SC2-like蛋白含有1个信号肽(1~20aa), 1个低复杂性结构域(83~96aa)㊁1个PGRP结构域(99~241aa)和1个Ami_2结构域(111~ 247aa)(图2)㊂949第6期乔琨,等:皱纹盘鲍肽聚糖识别蛋白的表达及免疫功能特性M DNA marker;1 5ᶄRACE PCR 产物;2 3ᶄRACE PCR 产物㊂M DNA marker;1 5ᶄRACE PCR product;2 3ᶄRACE PCRproduct.图1㊀HdhPGRP-SC 2-like RACE PCR 产物电泳图谱Fig.1㊀RACE PCR amplification of the full-lengthcDNA sequence of HdhPGRP-SC 2-like蓝色阴影表示信号肽;灰色阴影表示低复杂性结构域;黄色阴影表示PRGP 结构域;下划线表示Ami_2结构域;红色方框表示酰胺酶催化位点;蓝色圆框表示Zn 2+结合位点㊂Blue shadow indicates signal peptide;Gray shadow indicates lowcomplexity domain;yellow shadow indicates PRGP domain;Under-line indicates Ami_2domain;Red box indicates amidase catalytic site;Blue circle indicates Zn 2+binding site.图2㊀HdhPGRP-SC 2-like 全长cDNA 序列及推导的氨基酸序列Fig.2㊀Complementary DNA and predicted amino acidsequences of HdhPGRP-SC 2-like2.2㊀HdhPGRP-SC2-like 多序列比对及进化树通过Clustal W 软件对HdhPGRP-SC2-like 与其他物种的PGRP 结构域进行多序列比对,发现PGRP 结构域氨基酸序列具有高度的保守性(图3)㊂使用MEGA 7.0软件构建HdhPGRP-SC2-like 系统进化树(bootstrap 设置为1000次)㊂结果显示,皱纹盘鲍与软体动物分支中黑唇鲍(Hali-otis rubra )和红鲍(H .rufescens )的PGRP SC2-like 亲缘关系较近(图4)㊂2.3㊀HdhPGRP-SC2-like 的结构预测通过AlphaFold2预测HdhPGRP-SC2-like 蛋白的3D 结构,发现N 端由7个β折叠组成,C 端由5个ɑ螺旋与5个β折叠组成(图5)㊂HdhPGRP-SC2-like 蛋白具有8个半胱氨酸,可以形成四对二硫键,推测形成二硫键的半胱氨酸为Cys78-Cys201㊁Cys115-Cys121㊁Cys3-Cys64和Cys31-Cys5㊂2.4㊀HdhPGRP-SC 2-like 基因的组织分布通过qPCR 检测HdhPGRP-SC 2-like 基因在皱纹盘鲍各组织中的表达,结果显示,在各组织中均有一定的表达量,其中,在鳃中表达量最高,其次为外套膜㊁消化腺㊁上足㊁闭壳肌㊁腹足,血细胞中表达量最低(图6)㊂2.5㊀rHdhPGRP-SC2-like 的载体构建及重组表达HdhPGRP-SC 2-like pET-28a (+)重组表达载体质粒的双酶切结果如图7(a )所示㊂用0.5mmol /L IPTG 于20ħ下诱导表达16h 收集菌体,使用超声破碎使其充分溶解后离心,分别对上清和沉淀进行SDS-PAGE 电泳,结果如图7(b)所示,rHdhPGRP-SC2-like 蛋白在超声破碎的沉淀中表达,上清液中未见目的蛋白㊂2.6㊀rHdhPGRP-SC2-like 蛋白的纯化及鉴定融合蛋白的氨基端连接6ˑHis taq 标签,通过Ni 2+亲和层析可纯化目的蛋白,分别使用浓度为20㊁50㊁500mmol /L 的咪唑溶液进行梯度洗脱㊂对粗蛋白㊁洗杂流出和洗脱流出分别进行处理,收集样品并进行SDS-PAGE 检测,结果如图8(a)所示㊂利用Western blot 对纯化后的蛋白进行验证,结果显示,杂交条带与预期一致(图8(b))㊂2.7㊀rHdhPGRP-SC2-like 蛋白与PGN 结合的活性通过ELISA 法检测rHdhPGRP-SC2-like 与肽聚糖结合的活性,结果显示,重组蛋白以浓度依赖的方式与藤黄微球菌PGN㊁大肠杆菌PGN 结合,并且对藤黄微球菌PGN 的亲和力更高(图9)㊂说明rHdhPGRP-SC2-like 可以结合革兰氏阳性菌细胞壁㊂2.8㊀rHdhPGRP-SC2-like 蛋白的酰胺酶活性通过控制缓冲液中Zn 2+含量,分析rHdhPGRP-059大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第38卷Sources and GenBank numbers of PGRPs are as follows:Haliotis discus hannai PGRP (MZ150581),Haliotis discus hannai PGRP-SC2-like(OQ621429),Haliotis discus discus PGRP (KF554145.1),Solen grandis PGRP2(AEW43447.1),Crassostrea gigas PGRP S2(BAG31898.1),Azumapecten farreri PGRP S1precursor (AAY53765.1),Euprymna scolopes PGRP1(AAY27974.1),Xenopus tropicalis PG-LYRP1(AAH91103.1),Drosophila melanogaster PGRP-SD (CAD89198.1),Mus musculus PGLYRP1(AAH05582.1)and Homo sapiens PGRP1(AAI01848.1).图3㊀HdhPGRP-SC2-like 与部分已知物种PGRPs 的氨基酸序列比对Fig.3㊀Multiple alignment of amino acid sequences of HdhPGRP-SC2-like and some known speciesPGRPs图4㊀HdhPGRP-SC2-like 氨基酸序列的系统进化树Fig.4㊀Phylogenetic tree of HdhPGRP-SC2-like amino acid sequenceSC2-like 的酰胺酶活性,结果显示,随时间延长,藤黄微球菌PGN 被重组蛋白逐渐降解,含有Zn 2+的试验组OD 值下降最显著(图10),表明rHdh-PGRP-SC2-like 的酰胺酶活性具有Zn 2+依赖性㊂159第6期乔琨,等:皱纹盘鲍肽聚糖识别蛋白的表达及免疫功能特性图5㊀HdhPGRP-SC2-like 的三维结构Fig.5㊀3D structural diagram ofHdhPGRP-SC2-like标有不同字母者表示组间有显著性差异(P <0.05),标有相同字母者表示组间无显著性差异(P >0.05)㊂The means with different letters are significant differences in groupsat the 0.05probability level,and the means with the same lettersare not significant differences.图6㊀HdhPGRP-SC 2-like 在皱纹盘鲍组织器官中的表达Fig.6㊀Distribution of HdhPGRP-SC 2-like transcripts indifferent tissues of normal Haliotis discushannaiM DNA marker;M1 蛋白marker;1 双酶切后的目的基因;2 未诱导;3 上清液;4 沉淀㊂M DNA marker;M1 protein marker;1 the target gene afterdouble digestion;2 pre-induction protein;3 supernatant;4precipitation.图7㊀rHdhPGRP-SC2-like 的载体构建及重组表达Fig.7㊀Construction of rHdhPGRP-SC2-like vector andrecombinant expression2.9㊀HdhPGRP-SC2-like 蛋白与肽聚糖的分子对接大肠杆菌PGN 结构与HdhPGRP-SC2-like的对M 蛋白marker;1 纯化前总蛋白;2 流出组分;3 20mmol /L咪唑洗脱组分;4 50mmol /L 咪唑洗脱组分;5㊁6 500mmol /L咪唑洗脱组分;7 rHdhPGRP-SC2-like 蛋白㊂M protein marker;1 total protein before purification;2 outflowcomponent;3 20mmol /L imidazole elution component;4 50mmol /L imidazole eluting component;5and 6 500mmol /L im-idazole eluting component;7 rHdhPGRP-SC2-like protein.图8㊀rHdhPGRP-SC2-like 蛋白的纯化及鉴定Fig.8㊀Purification and identification of rHdhPGRP-SC2-likeprotein图9㊀rHdhPGRP-SC2-like 与肽聚糖的结合活性Fig.9㊀Binding activity of rHdhPGRP-SC2-like withpeptidoglycan图10㊀rHdhPGRP-SC2-like 的酰胺酶活性Fig.10㊀Amidase activity of rHdhPGRP-SC2-like接打分为-7.9046kcal /mol,预测的PGN 与Hdh-PGRP-SC2-like 的三维结合模式如图11所示,PGN与HdhPGRP-SC2-like 的结合位点形成了合适的空间互补,此外,PGN 与HdhPGRP-SC2-like 还形成了氢键㊁疏水作用和范德华力相互作用㊂PGN 上的3个氧原子(O40㊁O42㊁O68)作为氢键受体,与HdhPGRP-SC2-like 上的残基Ser222㊁Arg183㊁259大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第38卷His217和His108分别形成了4个氢键;PGN上的2个氮原子(N8㊁N14)作为氢键供体,分别与HdhPGRP-SC2-like上的残基Asn135㊁Asn134的骨架氧原子形成了2个氢键;PGN还与HdhPGRP-SC2-like有疏水相互作用,涉及的残基有Arg93㊁Met133㊁His132㊁Ser127㊁Arg136㊁Arg124㊁Gly110㊁Leu111㊁Cys225㊁Tyr131㊁Thr223㊁Lys167㊁Trp138㊁Asp224和Val221㊂图11㊀PGN与HdhPGRP-SC2-like的分子对接(三维结合模式)Fig.11㊀Molecular docking of PGN with HdhPGRP-SC2-like(predicted3D binding mode)3㊀讨论3.1㊀HdhPGRP-SC2-like氨基酸序列特征本研究中,从皱纹盘鲍克隆获得了一个新的HdhPGRP-SC2-like基因㊂在HdhPGRP-SC2-like蛋白结构中发现了1个信号肽和1个典型的PGRP结构域,无跨膜结构域,为短型肽聚糖识别蛋白[6,18-19]㊂通过多序列比对发现,从昆虫到哺乳动物PGRP在结构上高度保守㊂皱纹盘鲍与黑唇鲍㊁红鲍的PGRP-SC2-like显示出较高的一致性,这与物种的进化密切相关㊂在HdhPGRP-SC2-like序列中发现了4个Zn2+结合位点(H128㊁Y174㊁H237和C245)和5个酰胺酶催化位点(H128㊁Y174㊁H237㊁T243和C245),这些位点在HdhPGRP-SC2-like中高度保守㊂然而并非每种肽聚糖识别蛋白都具有酰胺酶活性,所有具有酰胺酶活性的PGRP在其活性中心中均具有保守的Zn2+结合位点,由2个组氨酸㊁1个酪氨酸和1个半胱氨酸组成[20]㊂而在非酰胺酶类PGRP中的半胱氨酸被丝氨酸取代㊂因此,这些关键位点的存在为Hdh-PGRP-SC2-like具有酰胺酶活性提供了理论基础㊂3.2㊀HdhPGRP-SC2-like基因的组织表达模式PGRP基因在不同物种中的组织分布表达存在一定差异㊂许多昆虫的PGRP基因主要在免疫器官中表达㊂在果蝇中,有13种肽聚糖识别蛋白基因转录形成至少17种肽聚糖识别蛋白,每个基因显示出不同的表达模式[1]㊂在昆虫中,PGRP-S和其他短型肽聚糖识别蛋白基因在血淋巴㊁表皮㊁上皮细胞及肠道中表达,长型肽聚糖识别蛋白基因在血细胞中表达量较高[21]㊂哺乳动物PGRP-L主要在肝脏中表达,并从肝脏分泌到血液中[22]㊂三角帆蚌(Hyriopsis cumingi)PGRPS1mRNA表达量在肝胰腺中最高[23]㊂海湾扇贝(A.irradians)的PGRP 是一种典型的短型PGRP,在其性腺㊁鳃㊁血细胞㊁肾和闭合肌中均有表达[24]㊂本研究中,Hdh-PGRP-SC2-like基因在皱纹盘鲍各组织中呈组成型表达,鳃中表达量最高,其次为外套膜㊁消化腺,血细胞中表达量最低㊂鳃作为对各种外源性刺激的屏障,HdhPGRP-SC2-like在消化腺和鳃中的高表达水平暗示其在免疫和抗氧化防御中的重要作用㊂3.3㊀HdhPGRP-SC2-like的免疫活性分析PGRP对不同类型的PGN表现出不同的结合亲和力㊂从Manduca sexta中鉴定出的PGRP1只与可溶性Dap型PGN结合[25],来自Bombus ignitus 的rPGRP对Lys型PGN具有亲和活性[26]㊂而rAd-PGRP-SC2对Dap型和Lys型PGN均有结合亲和力[27]㊂本研究中发现,rHdhPGRP-SC2-like对藤黄微球菌PGN㊁大肠杆菌PGN均有结合能力,且与其他研究者的结论相似,表明该蛋白在革兰氏阳性菌中比在革兰氏阴性菌中具有更强的凝集和结合细菌能力[28]㊂酰胺酶在多种生物中发挥重要的免疫作用,一些PGRP结构域与酰胺酶具有同源性,因此,可以水解不溶性PGN的N-乙酰胞苷酸和L-丙氨酸之间的酰胺键,从而降解PGN[4]㊂在日本盘鲍中发现的一种短型PGRP(AbPGRP),能够结合PGN,具有Zn2+依赖性的酰胺酶活性,且对弧菌具有较强的抗菌活性,这与先前在其他软体动物中报道的PGRP功能特性一致[29]㊂陈钰莹等[7]从皱纹盘鲍中克隆了肽聚糖识别蛋白(HdPGRP),重组表达产物rHdPGRP对革兰氏阳性菌藤黄微球菌具有显著的抑制作用,且具有Zn2+依赖的酰胺酶活性,可催化降解不溶性肽聚糖㊂本研究中发现,Zn2+对359第6期乔琨,等:皱纹盘鲍肽聚糖识别蛋白的表达及免疫功能特性HdhPGRP-SC2-like发挥酰胺酶活性至关重要,表明PGRP在机体抵御细菌入侵等免疫防御中发挥重要作用㊂此外,一些研究表明,PGRP蛋白可以增强巨噬细胞对细菌的吞噬作用[30],并参与肠道免疫应答,在维持肠道内微生物稳态中发挥关键作用[31]㊂HdhPGRP-SC2-like是否也能促进细胞吞噬或具有其他功能,还有待进一步研究㊂4　结论1)从皱纹盘鲍体内克隆并鉴定了HdhPGRP-SC2-like基因,生物信息学分析表明,HdhPGRP-SC2-like蛋白含有4个Zn2+结合位点㊁5个酰胺酶催化位点和1个PGRP结构域,表明其在进化上高度保守㊂2)HdhPGRP-SC2-like mRNA在皱纹盘鲍各组织中均有表达,在鳃㊁外套膜与消化腺中表达量较高,表明该基因参与机体的抗氧化和免疫防御㊂3)重组表达产物rHdhPGRP-SC2-like具有肽聚糖结合活性和酰胺酶活性,在抵御细菌入侵机体的过程中发挥重要作用㊂参考文献:[1]㊀CHRISTOPHIDES G K,ZDOBNOV E,BARILLAS-MURY C,etal.Immunity-related genes and gene families in 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rHdhPGRP-SC2-like was obtained byprokaryotic expression,and its amidase activity and immune characteristics were verified.The results showed that the cDNA of the HdhPGRP-SC 2-like gene was 938bp in length,with an open reading frame of 780bp,encoding260amino acids and containing the conserved PGRP and Ami_2structural domains.HdhPGRP-SC2-like gene as ashort type PGRP had high similarity with the closely related species PGRP of mollusks.qPCR analysis showed that HdhPGRP-SC 2-like mRNA was expressed in all tissues of the disk abalone,with the maximal expression level in gill,a certain amount of expression level in mantle and digestive gland,and the minimal content in foot and hemo-cyte.The prokaryotic expression vector pET-28a(+)-HdhPGRP-SC 2-like was further constructed,and the recombi-nant protein rHdhPGRP-SC2-like gene was obtained by induction of expression,isolation,and purification.The re-combinant protein had peptidoglycan binding activity and showed amidase activity in the presence of Zn 2+.Thefinding indicated that HdhPGRP-SC2-like gene binded bacterial peptidoglycan components and played an important role in the immune defence against invading bacteria.Key words :Haliotis discus hannai ;peptidoglycan recognition protein;amidase activity;immune defence;bacteri-al binding559第6期乔琨,等:皱纹盘鲍肽聚糖识别蛋白的表达及免疫功能特性。

[19]中华人民共和国国家知识产权局[12]发明专利申请公开说明书[11]公开号CN 1418542A[43]公开日2003年5月21日[21]申请号02144515.X[21]申请号02144515.X [22]申请日2002.11.01[71]申请人中国科学院海洋研究所地址266071山东省青岛市南海路7号[72]发明人张国范 赵洪恩 刘晓[74]专利代理机构沈阳科苑专利代理有限责任公司代理人许宗富 周秀梅[51]Int.CI 7A01K 67/033权利要求书 1 页 说明书 5 页[54]发明名称一种橘红壳色皱纹盘鲍新品系的制种方法[57]摘要本发明涉及皱纹盘鲍，具体地说是一种橘红壳色皱纹盘鲍新品系的制种方法。

它利用皱纹盘鲍橘红壳色突变体间的单交或群交，获得壳色性状一致的皱纹盘鲍新品系，具体是：取性成熟的皱纹盘鲍橘红壳色的突变体作为种鲍，置于海水中，饲以天然饵料，充天然空气，至性腺发育成熟；再采用阴干、升温和紫外线照射海水刺激方法进行催产；然后将分别获得的雌雄配子以单交或群交方式进行人工授精，经常规孵化及后期培育获得橘红壳色皱纹盘鲍新品系苗种。

本发明利用了自然群体或人工繁育群体内壳色突变体培育出具有鲜明特色的皱纹盘鲍新品系，没有外源基因的导入，方法简便，具有较强的可操作性，生产性状明显优于普通皱纹盘鲍，可以实现产业化应用。

02144515.X权 利 要 求 书第1/1页1.一种橘红壳色皱纹盘鲍新品系的制种方法，其特征在于：利用皱纹盘鲍橘红壳色突变体间的单交或群交，获得壳色性状一致的皱纹盘鲍新品系；可按如下步骤操作：1)种鲍选择：取自然地理群体或人工繁育群体中的性成熟皱纹盘鲍橘红壳色突变体作为种鲍；2)种鲍促熟：取大小为中等偏上的性成熟个体，置于16～20℃的海水中，培育密度为25～80枚/m3，饲以天然饵料，每天全量换水一次，充天然空气，有效积温900～1400度·日，培育环境照度为20～100Lux，至性腺发育成熟；3)催产：将性腺发育成熟的个体采用阴干、升温和紫外线照射海水刺激方法进行催产，具体为：在18～20℃、空气湿度为50～90％的条件下阴干60～120分钟，然后将雌雄种鲍分别置于不同的容器内，雌雄个体严格分离，注入升温至22～23℃、照射强度为300～1000mwh/L的紫外线处理海水，40～90分钟后可获得雌雄配子；4)将分别获得的雌雄配子以单交或群交方式进行人工授精；5)按常规孵化及后期培育方法即可获得橘红壳色皱纹盘鲍新品系苗种。

生物细胞培养基制备过程与设备概论在生物医学研究中，细胞培养基是一种重要的实验材料，用于培养和繁殖生物细胞。

制备细胞培养基需要一定的设备和材料，并遵循一定的步骤和原理。

首先，制备细胞培养基需要一定的设备和材料，包括试管、培养皿、pH计、电炉、干燥器、称量器等实验室常用设备，以及培养基成分，如葡萄糖、氨基酸、维生素和生长因子等。

这些设备和材料都是制备细胞培养基的必备条件，通过它们可以完成培养基的各种操作和加工过程。

其次，制备细胞培养基的过程主要包括计量、混合和调节pH值等步骤。

在制备培养基的过程中，需要按照一定的比例计量各种成分，然后将它们混合均匀，最后调节pH值至适合生物细胞生长的范围。

这些步骤保证了细胞培养基的质量和适用性，从而确保细胞在培养基中能够稳定生长和繁殖。

细胞培养基的制备过程中，设备和材料的选用与操作技术的熟练程度都会直接影响到培养基的质量和成效。

因此，在实验室中，常规的生物细胞培养基制备过程需要得到研究人员的认真对待和细致操作。

只有这样，才能保证制备出的细胞培养基在细胞培养实验中能够取得较好的结果和应用价值。

细胞培养是生物医学研究中的重要实验技术，它对疾病研究、药物筛选和基因编辑等领域具有重要意义。

在细胞培养过程中，细胞培养基是必不可少的材料之一。

制备高质量的细胞培养基对于获得稳定、可靠的实验结果至关重要。

首先，让我们来看看细胞培养基的主要成分。

通常细胞培养基主要由无机盐、氨基酸、葡萄糖、维生素和生长因子等组成。

这些成分是提供细胞生长所需的营养物质，提供细胞分裂所需的能量。

制备细胞培养基的首要任务是准备好各种成分。

在实验室中，我们需要仔细称量和混合不同成分，确保各种营养物质的浓度和比例符合细胞的生长需求。

一般来说，实验室会提前准备好各种常用成分的溶液，以便随时制备新的培养基。

在制备细胞培养基的过程中，pH值的调节也是非常重要的。

大多数细胞需要在pH值为7.2-7.4的环境中生长，因此需要通过加入缓冲溶液来调节培养基的pH值。

细胞培养的方法与步骤细胞培养是一种重要的实验技术，用于研究和生产生物学医学领域的许多问题。

下面是细胞培养的方法和步骤：1.细胞系的选择：选择适合研究目的的合适细胞系，如HeLa细胞，CHO细胞等。

细胞系应具有稳定的生长特性和易于操作。

2.细胞培养基的选择：根据细胞系的需求选择合适的培养基。

常用的培养基包括DMEM、RPMI-1640等。

3.预处理培养器具：将培养器具(如培养瓶、细胞培养皿）进行高温高压消毒，确保无细菌和病毒的污染。

4.细胞的解冻：将冻存的细胞样品取出，快速解冻，并转移到预先加热的培养瓶中。

解冻过程应尽量避免温度和时间的过度变化。

5.培养细胞：将细胞培养物转移到含有培养基的培养瓶中。

细胞培养瓶应放置于恒温培养箱中，并设定适当的温度和湿度。

培养基应每两到三天更换一次。

6.细胞的分离：当细胞达到较高的密度时，需要将细胞分离为新的培养瓶中。

这可以通过使用胰酶酶解进行细胞分离，或使用细胞刮刀进行机械分离。

7.细胞传代：当细胞达到生长的饱和状态时，需要进行传代以扩大培养规模。

传代可以进行有限次数，直到细胞进入老化期。

8.细胞生长的监测：定期检测细胞的存活率、增殖率和形态，以确保细胞在最佳状态下生长。

这可以通过显微镜观察和染色实验来完成。

9.细胞的冻存：当需要保留细胞的长期存储或备份时，细胞可以通过冻存的方式保存。

使用适当的冻存液和冷冻方法进行细胞冻存。

10.细胞实验的应用：根据实验需求，可以将培养细胞用于细胞学、分子生物学、药理学等多个领域的实验研究。

总之，细胞培养是一项复杂的技术，需要仔细选择合适的细胞系、培养基和培养条件，并进行严格的操作和监控，以确保细胞的良好生长和结果的可靠性。

皱纹盘鲍遗传多样性的研究及遗传图谱构建的开题
报告
一、研究背景
皱纹盘鲍是一种经济价值较高的海产品，被广泛应用于食品、保健
品等领域。

然而，由于野生皱纹盘鲍资源的日益减少，养殖已成为满足
市场需求的主要来源。

因此，对皱纹盘鲍的遗传多样性进行研究，不仅
可以提高养殖效率、增加产量，还能为种质资源保护和品种改良提供科
学依据。

二、研究目的
本研究旨在对皱纹盘鲍的遗传多样性进行研究，并建立遗传图谱，
以期为进一步开展品种改良和保护种质资源提供科学依据。

三、研究内容和方法
1. 采集皱纹盘鲍样本，提取DNA，并通过PCR扩增特定基因片段。

2. 利用基因测序技术对扩增的PCR产物进行测序，获得DNA序列。

3. 对获得的DNA序列进行多态性分析，包括单核苷酸多态性和简单序列重复多态性。

4. 建立皱纹盘鲍的遗传图谱，包括树状图和主成分分析图。

通过遗
传图谱分析皱纹盘鲍不同个体之间的遗传关系，评估遗传多样性水平。

四、预期结果
1. 获得皱纹盘鲍的遗传多态性数据。

2. 构建皱纹盘鲍的遗传图谱。

3. 对皱纹盘鲍不同个体之间的遗传关系进行分析和比较，评估遗传
多样性水平。

五、研究意义
本研究可以为皱纹盘鲍的种质资源保护和品种改良提供基础数据和科学依据，有助于推动皱纹盘鲍养殖的可持续发展。

同时，本研究也可为其他相关物种的遗传多样性研究提供借鉴和参考。

实验室细胞培养的一般步骤细胞培养是一项重要的实验室技术，广泛应用于生命科学研究以及医药产业中。

下面将为您介绍一般的细胞培养步骤，希望能为您提供一些指导意义。

第一步：制备培养基细胞培养的第一步是制备适合细胞生长的培养基。

培养基通常包括营养物质、氨基酸、维生素、生长因子等，可以为细胞提供足够的养分和环境条件。

根据不同的细胞类型和实验目的，制备不同种类和浓度的培养基。

第二步：分离细胞在细胞培养之前，需要将细胞从组织、器官或已有培养物中分离出来。

通常采用酶消化、机械剪切或离心等方法来分离细胞。

分离后，细胞可以在培养基中生长和繁殖。

第三步：细胞接种将分离出的细胞接种到含有培养基的培养皿或培养瓶中。

接种密度要适当，不宜过稀或过密。

同时，需要将培养基中的氧气和二氧化碳平衡，通常使用CO2培养箱来提供适宜的气体环境。

第四步：细胞培养经过接种后，细胞开始在培养基中生长和分裂。

在培养过程中，需要控制细胞的温度、湿度和pH值，保持适宜的生长条件。

此外，定期更换新鲜的培养基可以提供足够的营养物质，维持细胞的正常生长。

第五步：细胞检测和观察细胞培养的过程中，需要定期对细胞进行检测和观察。

包括细胞数量的计数、形态的观察和生长曲线的绘制等。

通过这些检测和观察，可以了解细胞的健康状态、增殖速率以及其他相关参数。

第六步：细胞应用或冻存根据研究或实验的需要，可以选择将细胞用于进一步的实验、传代培养或冻存保存。

冻存细胞需要使用适当的冻存液，将细胞缓慢冷冻并存放在液氮罐中，以便长期保存。

细胞培养是一项需要耐心和细心的工作，每一步都需要严格控制条件和遵循操作规范。

只有如此，才能获得可靠的实验结果和高质量的细胞培养。

希望本文能为您提供参考，更好地开展细胞培养工作。

皱纹盘鲍血细胞分类及活性氧产生机理的研究
张剑诚;张峰;王吉桥
【期刊名称】《大连海洋大学学报》
【年(卷),期】2004(019)003
【摘要】研究了皱纹盘鲍Haliotis discus hannai Ino血细胞的组成、数量、吞噬作用及活性氧产生机理.皱纹盘鲍血细胞分为透明细胞和颗粒细胞两大类.透明细胞无颗粒,具嗜碱性细胞质,约占循环血细胞总量的60%;颗粒细胞含嗜酸性颗粒.这两种血细胞都有吞噬作用,尤其是颗粒细胞,经酵母细胞刺激后,血细胞释放活性氧,还原氮蓝四唑(NBT)形成甲肷沉淀,有化学发光现象.长期饥饿的皱纹盘鲍,血细胞活性氧量低于正常水平.
【总页数】7页(P182-188)
【作者】张剑诚;张峰;王吉桥
【作者单位】大连水产学院,农业部海洋水产增养殖学与生物技术重点开放实验室,辽宁,大连,116023;大连水产学院,农业部海洋水产增养殖学与生物技术重点开放实验室,辽宁,大连,116023;大连水产学院,农业部海洋水产增养殖学与生物技术重点开放实验室,辽宁,大连,116023
【正文语种】中文
【中图分类】Q246
【相关文献】
1.杂色鲍与皱纹盘鲍、盘鲍杂交的初步研究 [J], 柯才焕;田越;周时强;李复雪
2.皱纹盘鲍血细胞吞噬发光的研究 [J], 张峰;李光友
3.皱纹盘鲍血细胞的亚显微结构及分类研究 [J], 陈全震;杨俊毅;王小谷;高爱根
4.4种多糖对皱纹盘鲍血细胞活性氧和血清凝集活力的影响 [J], 张剑诚;张峰;王吉桥
5.皱纹盘鲍血细胞活性氧产生的研究 [J], 张峰;李光友;张培军
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细胞培养的操作步骤细胞培养是一种常见的实验室技术，用于研究和生产生物学领域的细胞。

细胞培养的操作步骤通常包括以下几个环节：准备培养基和试剂、细胞传代和细胞分离、细胞接种和培养条件的控制。

一、准备培养基和试剂1.确定所使用的培养基类型，如DMEM、RPMI-1640等，并根据实验的需求将其配制好。

2.购买所需的培养基添加剂，如胎牛血清（FBS）、生长因子、抗生素等，并根据实验要求将其加入到培养基中。

3.清洁工作台，并将所需的器具和试剂取出，进行消毒处理。

二、细胞传代和细胞分离4.将细胞传代物接种到一个新的培养器中。

根据实验的要求，可以使用细胞培养瓶或细胞培养皿等容器。

5.静置一段时间，让细胞附着在底部表面上，并增加培养基的吸附。

6.将旧的培养基小心地倒掉，并用含有酶的溶液，如胰酶-EDTA或胰蛋白酶，洗涤细胞。

此步骤旨在除去细胞表面的蛋白质和粘附物，使细胞能够自由分离。

7.加入一定量的培养基，将细胞解离，并通过轻轻摇动容器促进细胞的分散。

8.将分散的细胞转移到新的培养器中，并加入适量的培养基使其恢复生长。

三、细胞接种9.将细胞培养器中的细胞进行视觉检查，确保它们的形态和数量适合接种。

10.使用显微镜检查细胞的活力、纯度和质量。

如果细胞质量不佳，应根据需要调整细胞密度或传代更多次。

11.根据实验要求，将细胞重新分散并计算细胞密度。

12.准备接种物：使用无菌技术，将细胞和培养基混合，并在接种器中将混合物分散均匀。

13.将接种物小心地滴入新的培养器中，确保细胞均匀分布。

14.检查细胞的附着情况并加入适量的培养基。

四、培养条件的控制15.放置培养器在恒温培养箱中，保持适当的温度（通常在37摄氏度）、湿度和二氧化碳浓度（通常是5%）。

16.定期检查细胞的生长状况，观察细胞的形态和数量，以确定培养基是否需要更换或细胞是否需要传代。

17.如果需要传代，在细胞接种后一段时间内，观察细胞的生长速率和密度，根据需要调整传代时间和细胞密度。