丙烯葡聚糖凝胶层析纯化

葡聚糖凝胶层析法分离蛋白质实验简介：凝胶层析法是用一般的柱层析法使分子量不同的溶质通过具有分子筛效应的介质(如葡聚糖凝胶)，从而达到分离提纯的目的。

凝胶层析设备简单，操作简便，条件温和，已成为分离分析蛋白质等生物大分子不可缺少的实验手段。

一、实验目的1、掌握葡聚糖凝胶柱层析法的工作原理及基本操作技术。

2、掌握蛋白质分离纯化的一般操作技术。

二、实验原理凝胶层析是按溶质分子大小不同而进行分离的一种层析技术，当溶质分子大小不同的样品溶液通过凝胶柱时，由于凝胶颗粒内部的网络结构具有分子筛作用，分子大小不同的溶质就会受到不同的阻滞作用。

本实验采用葡聚糖凝胶G-50作为固相载体，它适用于相对分子质量范围在1500～30000之间的多肽与蛋白质的分离。

当蓝色葡聚糖-2000(相对分子质量在200万以上，蓝色)，细胞色素C(相对分子质量12800，红色)和重铬酸钾(相对分子质量294，黄色)的混合物流经层析柱时，三种物质的分级分离明显可见。

蓝色葡聚糖因完全被排阻在凝胶颗粒之外而首先流出，细胞色素C渗入凝胶颗粒内部而其次流出，重铬酸钾则完全渗入凝胶内部最后流出。

通过作洗脱曲线便可清楚地表示出葡聚糖凝胶G-50对这三种物质的分离效果。

样品中的各组分的流出顺序，可用有效分配系数K av表示：K av =(V e-V o)/(V t -V o)上式中，K av指的是分子量不同的溶质在凝胶内部和外部的分配系数，只与被分离物质分子的大小和凝胶颗粒孔径的大小分布有关，而与柱的长短粗细无关。

外水体积V o(outer volume)指基质颗粒之间体积的总和；内水体积V i(inner volume)指基质颗粒内部体积的总和；基质体积(V g)指基质自身所具有的体积。

V。

、V i和V g都是随着床体积和基质性质变化而变化的；洗脱体积V e(elution volume)指从加样到柱出现最大浓度(峰)时所流过的洗脱液的体积(如图1)。

【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。

2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。

【实验原理】凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。

层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。

葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。

凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。

可分离的分子量范围从几百到几十万不等。

葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。

分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。

若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。

本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。

蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。

【实验材料】1.实验器材层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计2.实验试剂(1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900ml，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。

实验五. 葡聚糖凝胶层析【实验目的】1.掌握葡聚糖凝胶的特性及凝胶层析的原理。

2．学习葡聚糖凝胶层析的基本操作技术。

【实验原理】凝胶层析又称分子排阻层析或凝胶过滤，是以被分离物质的分子量差异为基础的一种层析分离技术，这一技术为纯化蛋白质等生物大分子提供了一种非常温和的分离方法。

层析的固定相载体是凝胶颗粒，目前应用较广的是：具有各种孔径范围的葡聚糖凝胶（Sephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）。

葡聚糖凝胶是由直链的葡聚糖分子和交联剂3—氯1，2—环氧丙烷交联而成的具有多孔网状结构的高分子化合物。

凝胶颗粒中网孔的大小可通过调节葡聚糖和交联剂的比例来控制，交联度越大，网孔结构越紧密；交联度越小，网孔结构就越疏松，网孔的大小决定了被分离物质能够自由出入凝胶内部的分子量范围。

可分离的分子量范围从几百到几十万不等。

葡聚糖凝胶层析，是使待分离物质通过葡聚糖凝胶层析柱，各个组分由于分子量不相同，在凝胶柱上受到的阻滞作用不同，而在层析柱中以不同的速度移动。

分子量大于允许进入凝胶网孔范围的物质完全被凝胶排阻，不能进入凝胶颗粒内部，阻滞作用小，随着溶剂在凝胶颗粒之间流动，因此流程短，而先流出层析柱；分子量小的物质可完全进入凝胶颗粒的网孔内，阻滞作用大，流程延长，而最后从层析柱中流出。

若被分离物的分子量介于完全排阻和完全进入网孔物质的分子量之间，则在两者之间从柱中流出，由此就可以达到分离目的。

本实验以葡聚糖凝胶G—25作为固定相载体，来分离蓝色葡聚糖—2000和溴酚蓝。

蓝色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚蓝分子量为670，二者分子量相差较大，前者完全排阻，而后者则可完全进入凝胶颗粒网孔内，二者通过层析柱的时间不同而分开。

【实验材料】1.实验器材层析柱(1×20cm)附有一小段乳胶管及螺旋夹；洗脱液瓶(带下口的三角瓶，250m1)；试管及试管架；量筒10m1；721型分光光度计2.实验试剂(1) Tris—醋酸缓冲液(pH7.0):取0.0lmol/L Tris溶液(含0.1mol/L KCl)900m l，用浓醋酸调pH至7.0，加蒸馏水至1000m1。

葡聚糖凝胶柱的使用方法一、准备工作：1.准备好葡聚糖凝胶柱和所需的缓冲液，如PBS（磷酸盐缓冲液）、TBS（三甲基氨基甲烷缓冲液）等。

2.将葡聚糖凝胶柱放入柱层析设备中，并根据设备的要求进行调整和固定。

3.预冲柱层析设备和葡聚糖凝胶柱，以去除可能的污染和杂质。

二、样品处理：1.将待纯化的生物大分子样品先进行预处理，如去除悬浮物、离心沉淀等。

2.将样品溶液以适当的缓冲液进行稀释，以达到最佳的样品浓度和适合葡聚糖凝胶柱操作的样品体积。

三、样品加载：1.将处理好的样品溶液缓慢地倒入柱顶，让样品从柱顶进入柱内。

避免产生气泡。

2.分子在葡聚糖凝胶柱中会根据分子大小和亲疏水性质的不同而发生分离和吸附。

较大分子会在柱上层析，而较小分子会透过凝胶层均匀流出。

因此，样品会在柱内逐渐被分离和纯化。

四、缓冲液流动：1.样品完成加载后，使用适当的缓冲液进行柱洗涤，以洗掉非特异结合的杂质。

2.缓冲液的选择应根据样品的性质而定，具体的选择和流动条件可以参考相关的文献或经验。

五、洗脱纯化：1.在用于洗脱纯化的缓冲液中，调整适当的条件以实现目标分子的洗脱。

如调整pH值、离子浓度、添加洗脱剂等。

2.根据分子的亲疏水性质，选择适当的缓冲液浓度梯度进行洗脱。

一般来说，较强亲疏水性的分子需要更高浓度的洗脱缓冲液。

六、收集洗脱液：1.将洗脱液通过柱底收集，收集不同时间点或不同分析目的的洗脱液。

2.根据实验需要，将洗脱液分为不同部分进行后续的分析或纯化处理。

七、重复使用：1.柱层析后，葡聚糖凝胶柱可以进行再生，以重复使用。

具体的再生方法可以参考柱层析设备和葡聚糖凝胶柱的说明书。

总结：葡聚糖凝胶柱是一种常用的生物大分子纯化方法，通过分子在柱内的分离和纯化来实现样品纯化的目的。

使用葡聚糖凝胶柱时，需要根据样品的特性和需求进行适当的样品处理、缓冲液选择、洗脱纯化条件的优化等。

如操作规范且配合适当的实验条件，葡聚糖凝胶柱可以快速、高效地纯化和富集生物大分子。

丙烯葡聚糖凝胶柱丙烯葡聚糖凝胶柱（Acrylamide-grafted-dextran gel column）是一种用于生物大分子分离纯化的柱层析材料。

它的主要特点是基质材料采用了由Dextran和Acrylamide共聚物构成的凝胶，具有良好的化学稳定性、物理强度、较高的柱效以及优秀的卫生性等优点。

丙烯葡聚糖凝胶柱广泛应用于生物医学、制药、食品及环境领域等，是纯化比较复杂的生物大分子时的首选柱层析材料之一。

丙烯葡聚糖凝胶柱的制备的主要步骤包括：基质制备、柱层析填料、柱装填、洗脱条件的选择。

基质制备时，首先制备一定浓度的Dextran/丙烯酰胺共聚物水溶液，然后将其加入化学引发剂，并在反应后迅速凝胶化。

柱层析填料时，制备出适当大小的凝胶颗粒，并进行化学处理，使其能够在柱层析过程中稳定地固定在柱内。

柱装填时，将处理好的凝胶颗粒装入柱体中，并使其达到充填度。

洗脱条件的选择则需要根据大分子的特性选择不同的缓冲液、pH和盐度等，以最大限度地提高纯化效果。

1. 高柱效：丙烯葡聚糖凝胶柱具有良好的化学稳定性和物理强度，使其在高线速度下运行时也能保持良好的传质条件和柱效。

2. 容量大：由于基质凝胶中Acrylamide含量较高，其微孔结构也比较丰富，因此其容量比市面上其他吸附性柱层析材料大不少。

3. 极佳的卫生性：丙烯葡聚糖凝胶柱的基质对微生物生长、热辐射、紫外线等均有较好的抵抗力，能够在保证高生物质量的前提下有效防止杂质交叉污染。

4. 广泛应用：丙烯葡聚糖凝胶柱广泛应用于制药、食品、环境和生物领域，例如：分离免疫球蛋白、病毒蛋白、血凝素、酶、细胞因子、抗原和肽等。

丙烯葡聚糖凝胶柱在生物大分子的分离纯化中发挥着重要的作用。

在免疫学领域，丙烯葡聚糖凝胶柱可用于分离IgG和IgM。

在病毒学领域，丙烯葡聚糖凝胶柱可用于纯化HIV、疱疹病毒、流感病毒等。

在药物研发领域，丙烯葡聚糖凝胶柱则可用于纯化药物，如重组蛋白、激素等。

葡聚糖凝胶层析实验报告一、实验目的1、学习凝胶(Gel)层析法的基本原理；2、掌握葡聚糖凝胶（Sephadex）柱层析的操作技术。

二、实验原理凝胶层析又称排阻层析，凝胶过滤，渗透层析或分子筛层析等。

对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外（所用洗脱液的体积为外水体积）；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，尔后又被流出的洗脱液带走（所用洗脱液的体积为内水体积）。

分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。

一些中等大小的分子介于大分子与小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，亦即部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。

这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。

三、仪器、材料和试剂1、仪器：内直径为1cm，外直径为1.5cm的层析柱，恒流泵、收集器、酶标仪、试管、烧杯、移液枪。

2、材料与试剂：交联葡聚糖、双蒸水、蛋白溶液样品。

四、实验步骤1、装柱将交联葡聚糖溶液用玻璃棒引流导入层析柱中，要注意，不能让柱子中有气泡，可以边装边用玻璃棒搅拌。

2、上样装好柱后，用移液枪将柱子中上面的水吸出，再用移液枪将1ml 的蛋白溶液加入层析柱中。

3、洗脱和收集打开恒流泵和收集器装置，待样品刚好渗入到凝胶中时，再向层析柱中加入3-4ml的蒸馏水，此时盖上层析柱的上盖，将上盖的细管插入到盛有双蒸水的烧杯中，调节恒流泵的速度和收集器时间，开始洗脱收集。

4、样品的检测收集一段时间后，将样品取出，依次编号，依次加入200μl到酶标版上，选用一个孔加入双蒸水作为对照，用酶标仪在280nm下测检测。

五、实验结果及分析1、实验结果：序号 2 4 6 8 10 12 14吸光0．051 0.045 0.051 0.071 0.195 0.127 0.067 度A序号16 8吸光0.055 0.039 0.066 0.027 0.053 0.049 0.011度A2、蛋白质样品洗脱曲线：收集样品时设置的时间为3min每管，收集得到每管的体积为1.4ml，则计算：流速=每管体积/每管时间=1.4/3=0.47ml/min。