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第一章绪论1.生物技术的概念，基因工程、细胞工程、发酵与酶工程、蛋白质及抗体工程及生物转化的概念。
P1生物技术biotechnology又称生物工程bioengineering，指人们以现代生命科学为基础，结合先进的工程技术手段和其他基础学科的科学原理，按照预先的设计改造生物体或加工生物原料，为人类生产出所需产品或达到某种目的的技术。
基因工程genetic engineering也称遗传工程，是现在生物技术的核心和主导。
主要原理是应用人工方法将生物的遗传物质，通常是DNA分离出来，在体外进行切割、拼接和重组，然后将重组了的DNA导入某种宿主细胞或个体，从而改变它们的遗传品性；有时还使新的遗传信息在新的宿主细胞或个体中大量表达，以获得基因产物（多肽或蛋白质）。
（DNA重组技术，分子杂交技术，基因操作）细胞工程cell engineering指以细胞为基本单位，在体外条件下进行培养、繁殖，或人为地使细胞某些生物学特性按人们的意愿发生改变，从而达到改良生物品种和创造新品种，加速繁育动植物个体，或获得某种有用的物质的过程。
发酵工程fermentation engineering是通过现代技术手段，利用微生物的特殊功能生产有用的物质，或直接将微生物应用于工业生产的一种技术体系。
酶工程enzyme engineering 是利用酶或细胞所具有的特异催化功能，或对酶进行修饰改造，并借助生物反应器和工艺过程来生产人类所需产品的一项技术。
抗体工程antibody engineering是利用细胞生物学或分子生物学手段在体外进行遗传学操作，改变抗体的遗传特性和生物学特性，以获得具有适合人们需要的、有特定生物学特性和功能的新抗体，或建立能稳定获得高质量和产量抗体的技术。
生物转化biotransformation也称生物催化biocatalysis是利用酶或有机体（细胞、细胞器）作为催化剂实现化学转化的过程，是生物体系的酶制剂对外源性底物进行结构性修饰所发生的化学反应。
第一章1、生物技术与微电子技术，新材料、新能源并列，是四大科学技术支柱，生物技术是以生命科学为基础，利用生物体的特性和功能，设计构建具有预期性状的新物种或新品系，并与工程相结合，利用这样的新物种，进行加工生产，为社会提供商品和服务的一个综合性的技术体系。
2、生物技术可以分为传统生物技术、近代生物技术、现代生物技术。
3、近代生物技术的特点：（1）产品类型多（2）生产技术要求高（3）生产设备规模大（4）技术发展速度快4、现代生物药物四大类型：（1）应用重组DNA技术（2）基因药物（3）来自动、植物和微生物的天然生物药物（4）合成与部分合成的生物药物5、根据生物药物的功能途径可分为：（1）治疗药物（2）预防药物（3）诊断药物6、生物技术药物的特性（1）分子结构复杂（2）具有种属特异性（3）治疗针对性强、疗效高（4）稳定性差（5）基因稳定性（6）免疫原性（7）体内半衰期短（8）受体效应（9）多效性和网络性效应（10）检验的特殊性7、生物技术制药的特征：（1）高技术（2）高投入（3）长周期（4）高风险（5）高收益第二章1.基因工程药物分类：（1）免疫性蛋白（2）细胞因子（3）激素（4）酶类2.基因工程生产药物的优点在于：（1）可大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用建立有效的保障。
（2）可提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入研究，从而扩大这些物质的应用范围。
（3）可以发掘更多的内源性生理活性物质。
（4）内源性生理活性物质在作为药物使用时，存在不足，可通过基因工程和蛋白质工程对其进行改造。
（5）可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
3.基因工程药物制造的主要步骤:目的基因的克隆，构建DNA重组体，构建工程菌，目的基因的表达，外源基因表达产物的分离纯化，产品的检验。
4.制备基因工程药物的基本过程：获得目的基因—构建重组质粒—构建基因工程菌—培养工程菌—产物分离纯化—除菌过滤—半成品检定—成品检定—包装5.目的基因的获得：（一）反转录法：（1）mRNA的纯化（2）cDNA第一链的合成（3）cDNA第二链的合成（4）cDNA克隆（5）将重组体导入宿主细胞（6）cDNA文库的坚定（7）目的cDNA克隆的和鉴定（二）反转录—聚合酶链反应法（三）化学合成法（四）筛选基因的新方法（五）对已发现基因的改造6.基因表达：是指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有加工过程。
《生物技术制药》课程笔记第一章：绪论一、生物技术的发展史1.1 生物技术概述生物技术是指人们利用微生物、动植物体对物质、能量、信息进行操纵的技术。
它广泛应用于食品、农业、环境保护、能源、医药等领域。
1.2 生物技术的发展简史生物技术的发展可以分为三个阶段：（1）传统生物技术阶段：早在公元前22世纪，中国就开始了酿酒、制酱、制醋等传统生物技术应用。
此后，世界各国也逐渐发展了各自的发酵技术。
（2）现代生物技术阶段：20世纪初，科学家们开始研究酶和微生物，发现了遗传物质DNA和RNA，并逐步揭示了生物体的遗传密码。
这一阶段的代表性成果包括抗生素的发现、遗传工程的创立以及生物制品的生产。
（3）生物技术革命阶段：20世纪70年代末，基因工程技术的发展使生物技术进入了一个新的时代。
基因克隆、基因编辑、基因组学等技术的突破，为生物技术在医药、农业、能源等领域的应用开辟了广阔前景。
二、生物技术药物1.2.1 生物技术药物概述生物技术药物是指利用生物技术方法生产的药物，主要包括蛋白质药物、抗体、疫苗、寡核苷酸药物等。
1.2.2 生物技术药物的特性生物技术药物具有以下特点：（1）高特异性：生物技术药物针对性强，能够精确作用于疾病相关分子。
（2）低毒性：生物技术药物通常来源于自然界中的生物体，毒副作用较低。
（3）复杂性：生物技术药物的结构复杂，生产过程需要严格控制条件。
（4）生产成本高：生物技术药物的生产设备、工艺和原材料成本较高。
三、生物技术制药1.3.1 生物技术制药概述生物技术制药是指利用生物技术方法生产药物的过程。
它主要包括基因工程、细胞培养、蛋白质工程等技术。
1.3.2 生物技术制药特征生物技术制药具有以下特征：（1）生产过程高度自动化、精确化。
（2）药物作用机制明确，针对性强。
（3）生产周期较长，生产成本较高。
（4）药物质量和安全性要求严格。
1.3.3 生物技术在制药中的应用生物技术在制药领域的应用主要包括：（1）生产生物技术药物，如蛋白质药物、抗体、疫苗等。
第一章生物技术：（Biotechnology）是人类对生物资源（包括微生物、植物、动物）的利用、改造并为人类服务的技术。
生物技术制药：就是利用基因工程技术、细胞工程技术、微生物工程技术、酶工程技术、蛋白质工程技术、分子生物学技术等来研究和开发药物，用来诊断、治疗和预防疾病的发生。
第二章基因工程技术：基因工程技术又叫基因拼接技术或DNA重组技术。
将重组对象的目的基因插入载体，拼接后转入新的宿主细胞，构建成工程菌；实现遗传物质的重新组合，并使目的基因在工程菌内进行复制和表达的技术。
补料分批培养：补料分批培养是将种子接入发酵反应器中进行培养，经过一段时间，间歇或连续地补加新鲜培养基，使菌体进一步生长的培养方法。
连续培养：连续培养是将种子接入发酵反应器中，搅拌培养至菌体浓度达到一定程度后，开动进料和出料蠕动泵，以一定稀释率进行不间断培养。
透析培养技术：透析培养技术是利用膜的半透性原理使培养物和培养基分离，其主要目的是通过去除培养液中的代谢产物来解除其对生产菌的不利影响。
高密度发酵：是指培养液中菌体的浓度在50gDCW/L以上，目的是降低成本，提高效率。
离子交换层析：是依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。
疏水层析：是利用蛋白质表面的疏水区域和固定相上疏水基团之间的相互作用力差异，对蛋白组分进行分离的层析方法。
亲和层析：是利用固定化配体与目的蛋白质之间非常特异的生物亲和力进行吸附，这种结合既是特异的，又是可逆的，改变条件可以使结合解除。
凝胶过滤层析：是以多孔性凝胶填料为固定相，按分子大小对溶液中各组分进行分离的液相层析方法。
利用基因工程技术生产药物的优点？答：1大量生产过去难以获得的生理活性蛋白和多肽，为临床使用提供有效的保障；2、可以提供足够数量的生理活性物质，以便对其生理、生化和结构进行深入的研究，从而扩大这些物质的应用范围；3、可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质；4、内源生理活性物质在作为药物使用时存在的不足之处，可通过基因工程和蛋白质工程进行改造和去除；5、可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。
第一章总则第一条为规范药品生产质量管理，根据《中华人民共和国药品管理法》、《中华人民共和国药品管理法实施条例》，制定本规范。
第二条企业应当建立药品质量管理体系。
该体系应当涵盖影响药品质量的所有因素，包括确保药品质量符合预定用途的有组织、有计划的全部活动。
第三条本规范作为质量管理体系的一部分，是药品生产管理和质量控制的基本要求，旨在最大限度地降低药品生产过程中污染、交叉污染以及混淆、差错等风险，确保持续稳定地生产出符合预定用途和注册要求的药品。
第四条企业应当严格执行本规范，坚持诚实守信，禁止任何虚假、欺骗行为。
第二章质量管理第一节原则第五条企业应当建立符合药品质量管理要求的质量目标，将药品注册的有关安全、有效和质量可控的所有要求，系统地贯彻到药品生产、控制及产品放行、贮存、发运的全过程中，确保所生产的药品符合预定用途和注册要求。
第六条企业高层管理人员应当确保实现既定的质量目标，不同层次的人员以及供应商、经销商应当共同参与并承担各自的责任。
第七条企业应当配备足够的、符合要求的人员、厂房、设施和设备，为实现质量目标提供必要的条件。
第二节质量保证第八条质量保证是质量管理体系的一部分。
企业必须建立质量保证系统，同时建立完整的文件体系，以保证系统有效运行。
第九条质量保证系统应当确保：（一）药品的设计与研发体现本规范的要求；（二）生产管理和质量控制活动符合本规范的要求；（三）管理职责明确；（四）采购和使用的原辅料和包装材料正确无误；（五）中间产品得到有效控制；（六）确认、验证的实施；（七）严格按照规程进行生产、检查、检验和复核；（八）每批产品经质量受权人批准后方可放行；（九）在贮存、发运和随后的各种操作过程中有保证药品质量的适当措施；（十）按照自检操作规程，定期检查评估质量保证系统的有效性和适用性。
第十条药品生产质量管理的基本要求：（一）制定生产工艺，系统地回顾并证明其可持续稳定地生产出符合要求的产品；（二）生产工艺及其重大变更均经过验证；（三）配备所需的资源，至少包括：1.具有适当的资质并经培训合格的人员；2.足够的厂房和空间；3.适用的设备和维修保障；4.正确的原辅料、包装材料和标签；5.经批准的工艺规程和操作规程；6.适当的贮运条件。
生物制药行业自学知识点生物制药行业是一个高度专业化和快速发展的领域，它结合了生物学、化学、医学和工程学等多个学科的知识。
自学生物制药行业的关键知识点，可以从以下几个方面入手：1. 基础生物学知识：- 细胞生物学：了解细胞的结构和功能，细胞周期和细胞死亡等基本概念。
- 分子生物学：掌握DNA、RNA和蛋白质的结构与功能，以及基因表达调控机制。
- 遗传学：学习遗传信息的传递、变异和表达，以及遗传病的分子机制。
2. 药物作用机制：- 药理学：研究药物如何影响生物体，包括药物的吸收、分布、代谢和排泄。
- 药物动力学：分析药物在体内的动态变化过程，以及药物浓度与药效之间的关系。
3. 生物技术与制药工程：- 基因工程：学习如何通过基因克隆、基因编辑等技术改造生物体，以生产药物蛋白。
- 蛋白质工程：掌握如何设计和优化蛋白质结构，以提高药物的稳定性和活性。
- 生物反应器设计：了解如何设计和操作生物反应器，以实现大规模细胞培养和蛋白质生产。
4. 药物开发流程：- 药物发现：探索新药的发现过程，包括高通量筛选、计算机辅助药物设计等。
- 临床前研究：了解药物在进入临床试验前所需的毒理学、药效学研究。
- 临床试验：学习药物临床试验的设计、执行和数据分析，以及如何确保试验的伦理性。
5. 法规与质量控制：- 药品监管：熟悉各国药品监管机构的法规要求，如FDA、EMA等。
- 质量保证：掌握GMP（良好生产规范）和GLP（良好实验室规范）等质量控制标准。
6. 市场分析与商业策略：- 市场趋势：分析生物制药行业的市场动态，包括新兴技术、竞争格局和市场需求。
- 商业模式：探讨如何将科研成果转化为商业产品，包括专利策略、合作开发等。
7. 伦理与社会责任：- 伦理问题：讨论生物制药领域中的伦理问题，如基因隐私、人体实验等。
- 社会责任：了解生物制药企业如何承担社会责任，包括环境保护、公平获取药物等。
通过系统地学习上述知识点，可以为进入生物制药行业打下坚实的基础，并为未来的职业发展提供支持。
第一章生物药物概论1、生物药物分类：（1）基因重组多肽、蛋白类治疗剂（2）基因药物（3）天然生物药物（4）合成与部分合成药物。
DNA重组药物与基因药物区别：DNA重组药物即应用重组DNA 技术（包括基因工程技术与蛋白质工程技术）制造重组多肽、蛋白质类药物与疫苗、单克隆抗体与细胞因子等；基因药物即以基因物质（DNA或RNA）为基础，研究而成基因治疗剂、基因疫苗、反义药物与核酶等。
2、生物药物作用特点：药理学特性：（1）药理活性高（2）治疗针对性强，治疗生理、生化机制合理，疗效可靠。
（3）毒副作用较少，营养价值高。
（4）生理副作用常用发生。
理化特性：（1）生物材料中有效物质含量低，杂质种类多且含量相对较高。
（2）生物活性物质组成结构复杂、稳定性差。
（3）生物材料易染菌，腐败。
（4）生物药物制剂特殊要求。
3．DNA重组药物有：（1）细胞因子干扰素类：α-干扰素、β-干扰素、γ-干扰素（2）细胞因子白介素类与肿瘤坏死因子：白介素-2（IL-2）与突变型白介素-2（Ser125-IL-2）肿瘤坏死因子类主要有TNF-α与TNF-α受体。
（3）造血系统生长因子类：粒细胞集落刺激因子（G-CSF）、巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF）、巨噬细胞粒细胞集落刺激因子（GM-CSF）、促红细胞生成素（EPO）、促血小板生成素（TPO）干细胞生长因子（SCF）（4）生长因子类：胰岛素样生长因子（IGF）、表皮生长因子（EGF）、血小板衍生生长因子（PDFD）、转化生长因子（TGF-α与TGF- β）、神经生长因子及各种神经营养因子。
（5）重组多肽与蛋白质类激素：重组人胰岛素（rhInsulin）、重组人生长激素（rhGH）、促卵胞激素（FSH）、促黄体生成素（LH）与绒毛膜促性腺激素（HCG）、重组人白蛋白与重组人血红蛋白（6）心血管病治疗剂与酶制剂：Ⅷ因子、水蛭素、tpA、rtpA、尿激酶、链激酶、葡激酶、天冬酰胺酶、超氧化歧化酶、葡萄糖脑苷酶及DNsae 等（7）重组疫苗与单抗制品：重组乙肝表面抗原疫苗、乙肝基因疫苗、AIDS疫苗、流感疫苗、痢疾疫苗与肿瘤疫苗。
生物技术制药重点一、名解1、载体：携带外源目的基因或DNA进入宿主细胞，实现外源基因或DNA的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子，主要有粒载体和入噬菌甾体。
2、铁壁培养：大多数动物细胞进行培养时需要贴附因子，内细胞自身分泌或认为在培养基中加入，使细胞在支持物表面贴附伸展和生长繁殖的培养方法。
3、基因工程制造：利用基因重组技术将外源基因导入宿主菌或细胞进行大规模培养以获得蛋白质药物的过程。
4、人鼠嵌合抗体：利用DNA重组技术，将鼠抗体轻、重链可变区基因插入含有人体抗体恒定的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达的抗体。
5、转化细胞系：正常的细胞经过某个轻化过程，失去正常细胞的转点而获得无限增殖的能力，得到的细胞系称为轻化细胞系。
6、离子交换层析：利用蛋白质等电点的差异来实现不同蛋白质间的分离和纯化。
7、生物技术制药：指利用基因工程、细胞工程、发酵工程、蛋白质工程等生物技术来研究、开发和生产用于预防、治疗和诊断疾病的药物。
8、人源化抗体：CDR移植即把鼠抗体的CDR移植到人抗体的可变区内，所得到的抗体称CDR移植抗体或改型抗体，也就是人源化抗体。
9、前体：在药物的生物合成过程中，被菌体直接用于药物合成而自身结构无显著改变的物质。
10、接种量：移种的种子液体和接种后发酵罐培养夜体积之比。
11、次级代谢产物：微生物从合成代谢的中间产物出发合成一些生理功能不明确，化学结构特殊，且对细胞生命并非必须的产物。
12、固定化酶，是将具有一定的胜利功能的酶或生物细胞，用物理或化学方法将其固定，作用固定生物催化而加以利用的一种技术。
13、凝胶过滤层析：凝胶是一种惰性的不带电荷具有三维结构的多孔网状物质，当样品随流动相经过凝胶柱时大分子不能进入凝胶微孔而被洗脱出来，小分子能进入微孔流出速度慢，从而实现分离纯化的目的。
二、问答题1、疏水层析的原理是什么？需要进行几步操作？洗脱顺序是什么？答：原理：利用蛋白质分子表面上的疏水区域（非极性氨基酸残基的侧链）和介质的疏水基因之间的相互作用。
1.生物药剂学：是研究药物及其剂型在体内的吸收、分布、代谢与排泄的过程，阐明药物的剂型因素、机体的生物因素与药物效应三者之间相互关系的学科。
2.药物跨膜转运：药物通过生物膜（或细胞膜）的现象。
3.被动扩散：存在于膜两侧的药物服从浓度梯度，即从高浓度一侧向低浓度一侧扩散的过程，分为单纯扩散和膜孔转运两种形式。
4.膜孔转运：在胃肠道上皮细胞膜上有0.4-0.8nm大小的微孔，这些贯穿细胞膜且充满水的微孔是水溶性小分子药物的吸收途径。
5.易化扩散：某些物质在细胞膜载体的帮助下，由膜高浓度侧向低浓度侧扩散的过程。
6.主动转运：借助载体或酶促系统的作用，药物从较低浓度向高浓度侧的转运。
7.胃排空：胃内容物从胃幽门排入十二指肠的过程称为胃排空。
8.吸收：物质通过细胞膜或其它膜状物而到达细胞内部的过程。
9.药物分布：药物在血液和组织之间的转运过程。
10.表观分布容积V：用来描述药物在体内分布状况的重要参数，是将血浆中的药物浓度与体内药量联系起来的比例常数。
11.蓄积：当长期连续用药时，在机体的某些组织中的药物浓度有逐渐升高的趋势。
12.血药蛋白结合：进入血液的药物，一部分在血液中呈非结合的游离状态存在，一部分与血浆蛋白结合成结合型药物，暂时失去活性，“储存”于血液中，不能向组织器官内转运。
13.血脑屏障：脑毛细血管阻止某些物质由血液进入脑组织的结构。
14.前体药物：有一些药物本身没有药理活性，在体内经过代谢后产生有活性的代谢产物。
15.药物代谢：药物被机体吸收后，在体内各种酶以及体液环境作用下，可发生一系列化学反应，导致药物化学结构上的转变。
16.酶诱导作用：药物代谢被酶促进的现象。
17.酶抑制作用：药物代谢被酶减慢的现象。
18.首过效应：吸收过程中，药物在消化道和肝脏中发生的生物转化作用，使部分药物被代谢，最终进入体循环的原型药物量减少的现象。
19.肝肠循环：由肝脏排泄的药物，随胆汁进入肠道再吸收而重新经肝脏进入全身循环的过程。
第一章绪论1、生物技术制药是指采用现代生物技术可以人为地创造一些条件，借助某些微生物，植物或动物来生产所需的医药品。
它包括基因工程制药，动物细胞工程制药，抗体制药，植物细胞工程制药，酶工程制药。
4、生物技术药物的分类，按功能用途分：一是治疗药物，独特的生理调节，毒副作用低；二是预防药物，传染性疾病；三是诊断药物，疾病的临床诊断，速度快，灵敏度高，特异性强5、生物技术制药的特性：高技术、高投入、长周期、高风险、高收益第二章基因工程制药Gene Engineering for Biopharmaceutics 第二节基因工程药物生产的过程基因工程制药所使用的生物技术:（1）DNA重组技术（2）淋巴细胞杂交瘤技术（3）细胞培养技术（4）克隆表达技术DNA重组技术DNA重组（DNA recombination）指DNA分子内或分子间发生的遗传信息的重新共价组合过程。
包括同源重组、特异位点重组和转座重组等类型，广泛存在于各类生物。
体外通过人工DNA重组可获得重组体DNA，是基因工程中的关键步骤。
淋巴细胞杂交瘤技术又称单克隆抗体技术。
它是在体细胞融合技术基础上发展起来的。
克勒（Kohler）和米尔斯坦（Milstein）（1975）证明，骨髓瘤细胞与免疫的动物脾细胞融合，形成能分泌针对该抗原的均质的高特异性的抗体——单克隆抗体，这种技术通称为杂交瘤技术。
基因工程制药生产的基本步骤1、流程图获得目的基因--组建重组质粒--构建基因工程菌或细胞--培养工程菌--产物分离纯化--除菌过滤--半成品检定--成品检定--包装2、上游阶段主要是分离目的基因和构建工程菌细胞，其工作主要是在实验室内完成。
具体内容包括：（1）获得目的基因（2）用限制性内切酶和连接酶将目的基因插入到适当的载体质粒和噬菌体之中（3）将重组后的基因转移到大肠杆菌或者其它宿主细胞内3、下游阶段是指从工程菌的大规模培养，一直到产品的分离纯化，其工作主要是将实验室成果产业化、商品化。
其工作重点是：（1）必须保证所表达的蛋白质具有生物活性，（2）考虑基因工程蛋白质表达量的多少，（3）蛋白质分离纯化的难易程度。
第二节目的基因的获得一、反转录法反转录法就是分离纯化目的基因的mRNA，再反转录成cDNA，然后进行cDNA 克隆表达。
1、mRNA的纯化2、cDNA第一链的合成3、cDNA第二链的合成4、cDNA 克隆5、将重组体导入宿主细胞6、cDNA 文库的鉴定7、目的cDNA克隆的分离和鉴定1、mRNA的纯化（mRNA purification）①细胞内RNA的组成和含量：DNA：95%核内，5％细胞器RNA：75％细胞质，10%核内，15%细胞器rRNA：80-85%RNA tRNA：10-15%mRNA：2-5%②真核细胞mRNA 的特点及分离纯化方法。
3’-polyA（20-250AAA）-oligo(dT)cDNA第一链的合成由于mRNA的3-末端常常含有一多聚腺苷酸polyA，所以可以用寡聚脱氧胸腺苷酸Oligo（dt）做引物，在逆转录酶的催化下，合成cDNA。
为了测算cDNA的合成效率，可以在合成反应体系中加入一种放射性标记的dNTP，如a-32P-dATP、a-32P-dCTP，这样就可以通过放射自显影技术，来计算出dNTP的渗入量。
cDNA第二链的合成先用碱水解的方法，或者用RNaseH酶解的方法，除去cDNA-mRNA杂交链中的mRNA 链。
然后，再以cDNA第一链为模板，在DNA聚合酶的作用下，合成DNA互补双链。
cDNA的克隆当cDNA的插入片段小于10KB时，应选用质粒载体。
当cDNA的插入片段大于10KB时，应选用噬菌体载体。
表达型----是指重组后插入的cDNA能够经过转录、转译，最终合成蛋白质。
非表达型----是指重组后插入的cDNA不能经过转录、转译，合成蛋白质。
质粒噬菌体表达型PUC λgt11非表达型pBR322 λgt10cDNA的片段与载体的连接（1）借助同型多聚体尾巴的连接方法----用3-末端脱氧核苷酸转移酶催化，在cDNA的末端加上polyG（或者polyT）的尾巴、而在载体的末端加上polyC（或者polyA）的尾巴，就能够实现cDNA的片段与载体DNA的连接。
（2）加人工接头的连接法----所谓加人工接头的连接法，是指用采用T4DNA连接酶，在cDNA的末端加上人工接头，然后再使用特定的限制酶来切出粘性末端，从而实现与载体DNA的连接（3）加衔接子----衔接子也是人工合成的短的双链DNA片段。
其一端为平末端（供与平末端cDNA连接），另一端是已形成好的限制酶粘末端（供与载体相连），但5’端无磷酸基团。
将重组体导入宿主细胞:氯化钙或电转化法cDNA文库的鉴定表型鉴定法：分子鉴定法：（1）抗性基因失活法，（1）凝胶电泳，（2）菌落颜色，（2）分子杂交，（3）噬菌斑颜色改变。
（3）DNA序列测定。
目的cDNA克隆的分离和鉴定（1）核酸探针杂交法----根据目的蛋白质纯品的氨基酸序列分析结果，人工合成相应的单链寡核苷酸作为探针，从cDNA文库分离特异的cDNA克隆。
核酸探针分子杂交是指具有一定同源性的两条核酸单链在一定条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。
杂交的双方是待测核酸及探针。
（2）免疫反应鉴定法----以某种特定蛋白质的抗体，来寻找相应的cDNA克隆。
本法是筛选特异cDNA克隆的重要途径，在没有可供选择的基因表型时，或者在没有合适的核苷酸探针时，利用免疫反应鉴定法可以逐一鉴定各cDNA克隆的表达产物二、反转录-PCR法cDNA第一链合成PCR扩增克隆重组分离（A）高温变性-------通过加热，使双螺旋DNA变性，分离为单链。
（B）低温退火------在低温条件下，令人工合成有二个寡聚糖核苷酸引物分别与DNA 的二条单链模板发生互补性的结合。
（C）适温延伸------在四种脱氧核苷酸（dNTP）存在下，经过DNA聚合酶催化，令单核苷酸从引物3-端开始渗入，沿着单链DNA模板的3-末端、向着5-末端进行延伸，最终合成新的DNA互补链（c-DNA）。
（D）DNA互补链（c-DNA）的循环扩增-------以新合成的DNA互补链（c-DNA）为模板，进入下一个PCR循环。
第三节基因表达3、真核基因在大肠杆菌中的表达方式（1）以融合蛋白的形式表达药物基因：融合蛋白氨基端是原核序列，羧基端是真核序列。
优点：操作简便，蛋白质在菌体内比较稳定；易高效表达；但只能做抗原。
一般不做人体注射用药。
（2）以非融合蛋白的形式表达药物基因：易被蛋白酶破坏；N端有甲硫氨酸，易引起免疫反应。
OP:P-SD-ATG-St.gene-Stop C.融合蛋白的氨基酸端由大肠杆菌原核基因编码、而另一端（羧基端）则由真核基因编码。
最终表达出来的蛋白质=1条原核多肽+1条真核多肽，因此称为融合蛋白。
（3）分泌型表达蛋白药物基因：外源基因融合到原核蛋白信号肽序列的下游。
基因结构为“原核启动子—原核SD序列—原核结构基因片段—细菌信号肽基因—真核结构基因序列—原核终止密码子”。
三类主要基因工程表达体系的比较表达体系产物产生部位培养方式提纯产物活性潜在危险大肠杆菌多肽、蛋白融合蛋白菌体内容易部分可高产一般对原核好不大酵母多肽、蛋白糖基化蛋白菌体内分泌出细胞容易可高产菌体内复杂真核接近天然不大动物细胞完整糖基化蛋白分泌出细胞较难成本高可高产简单几乎可为天然产物可能有致癌因素第四节基因工程菌的不稳定性一、质粒不稳定产生的原因分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一定比例不含质粒子代菌的现象。
(常见)结构不稳定：指外源基因从质粒上丢失或碱基重排、缺失所致工程菌性能的改变二、提高质粒稳定性的方法1、分阶段培养法2、在培养基中加入抗生素，形成选择性压力3、通过温度、PH值、培养基组分、溶解氧的综合调节措施第七节基因工程菌的培养2、基因工程菌的培养方式（1）补料分批培养（2）连续培养（3）透析培养（4）固定化培养第三章动物细胞工程制药1、动物细胞融合方式：（1）病毒诱导融合（2）PEG诱导融合（3）电场诱导融合（4）其它诱导融合第四节动物细胞的培养条件和培养基一、动物细胞的培养条件1、器材的清洗和消毒器材的清洗：一般来说，需经浸泡、刷洗、泡酸和冲洗四个步骤，用过的器材最好尽快地浸泡在3%的磷酸三钠溶液内过夜，以除去蛋白质和残余细胞等污垢。
第五节动物细胞培养的基本方法细胞计数1、自动细胞计数器计数2、血球计数板计数3、结晶紫染色细胞核计数4、MTT染色计数第六节动物细胞培养的方法和操作方式从生产实际来看，动物细胞的大规模培养主要可分为悬浮培养、贴壁培养和贴壁-悬浮培养。
动物细胞培养的操作方式1、悬浮培养2、贴壁培养3、贴壁-悬浮培养（或称假悬浮培养）动物细胞培养的操作方式1、分批式操作2、半连续式操作3、灌流式操作第八节动物细胞制药的前景和展望1、改进表达载体，提高表达水平和产量2、利用代谢工程，改进培养工艺，降低生产成本3、抑制细胞凋亡，延长培养周期4、采用糖基化工程，提高产品质量5、转基因动物的研究6、组织工程的研究第四章抗体制药第二节单克隆抗体及其制备1、抗原与动物免疫2、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养3、筛选阳性克隆与克隆化4、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定5、单克隆抗体的大量制备6、单克隆抗体的纯化第三节鼠源性单克隆抗体的改进改造鼠源性单克隆抗体的目的：一是降低免疫原性；二是降低相对分子量，增加组织通透性。
改进后的抗体：一、人-鼠嵌合抗体二、改形抗体，用鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列第四节抗体工程噬菌体抗体库技术的原理，简言之就是用PCR技术从人免疫细胞中扩增出整套的抗体重链可变区（VH）和轻链可变区（VL）基因，克隆到噬菌体载体上并以融合蛋白的形式表达在其外壳表面。
这样一来噬菌体DNA中有抗体基因的存在，同时在其表面又有抗体分子的表达，就可以方便地利用抗原—抗体特异性结合而筛选出所需要的抗体，并进行克隆扩增。
一、噬菌体抗体库技术的基本方法1、获得目的基因2、抗体库技术的载体3、淘筛4、表达与鉴定第五章植物细胞工程制药第五节进展与展望新技术的出现和发展：诱导子、前体喂养、两相法培养、质体转化、毛状根培养、植物生物转化等。
1、诱导子的应用植物抗毒素是在植物防御系统内能对抗微生物进攻的某些次级代谢产物，有些时候连续合成，有些时候在被刺激下才会产生抗毒素，或仅在被诱导下其产量才能增加。
触发形成植物抗毒素信号的物质称为诱导子，能够诱导植物细胞中的一个反应，并能形成特征性自身防御反应的分子。
诱导子有两种分类，一种是根据在细胞内或细胞外形成而将其分为内源性诱导子和外源性诱导子；另一种是根据其来源分为生物诱导子和非生物诱导子。
