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浅析细菌内毒素检测方法及常见问题(ppt)

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《细菌内毒素检查》课件

《细菌内毒素检查》课件

其他检测方法
热原质鲎试剂盒法
利用鲎试剂与内毒素结合后加热，通 过凝胶形成或浊度变化来检测内毒素 的含量。该方法适用于注射剂、输液 等样品。
高效液相色谱法
利用高效液相色谱技术分离内毒素， 通过紫外吸收或荧光检测器来检测内 毒素的含量。该方法适用于生物制品 、血液制品等样品。
03
细菌内毒素检查的应用
实验后的处理和安全防护
废液的处理
实验后产生的废液应按照实验室规定进行处理， 不得随意倾倒或排放。
实验垃圾的处理
实验后产生的垃圾应按照实验室规定进行分类和 处理。
ABCD
仪器的清洗和维护
实验后应对使用的仪器进行清洗和维护，以确保 其性能和精度。
个人防护
实验人员应穿戴个人防护装备，如实验服、手套 、口罩等，以降低交叉污染和感染的风险。
饮用水监测
01
通过细菌内毒素检查，可以检测饮用水中的细菌内毒素含量，
确保饮用水安全。
污水处理监测
02
在污水处理过程中，对出水进行细菌内毒素检查，可以评估污
水处理效果和出水质量。
环境样品监测
03
对土壤、空气等环境样品进行细菌内毒素检查，可以了解环境
中的细菌污染状况，为环境治理提供依据。
04
细菌内毒素检查的注意事 项
开发新型检测方法和技术
开发多组分检测技术
将多种细菌内毒素相关分子同时纳入检测范围，实现多组分的同 时检测，提高检测效率和准确性。
开发新型免疫学检测方法
利用新型免疫学技术，如单克隆抗体、免疫磁珠等，提高检测的特 异性和灵敏度。
开发新型生物信息学技术
利用生物信息学手段，对细菌内毒素相关基因和蛋白质进行高通量 筛选和鉴定，为新型检测方法的开发提供有力支持。

内毒素检查-PPT

内毒素检查-PPT

鲎试剂灵敏度复核
加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，垂 直放入37℃±1℃恒温器中，保温60±2分钟。
❖ 结果观察
将试管轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并 且凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，未形成凝胶或形成 的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。
阳
阴
性
性
❖ 计算
当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性 ，阴性对 照为阴性 时实验为 有效，按 下式计算 反应终点 浓度的几 何平均值 即为鲎试 剂灵敏度 的复核结 果。
干扰实验
加样 准备好的36支鲎试剂放在试管架上，按下图加样。
干扰实验
0.1ml内毒素标准液 0.1ml检查用水
0.1ml含内毒素的供试品液 0.1ml供试品液
加样结束后，用封口膜封口，轻轻振动混匀，避免产生 气泡，放入37℃±1℃恒温器中，保温60±2分钟，观察 并记录结果。
实 验 结 果 计算 如两组最大浓度2.0λ均为阳性，最低浓度0.25λ均为阴 性，阴性 对照4管均 为阴性时 ，按下式 计算用检 查用水制 成的内毒 素标准溶 液的反应 终点浓度 的几何平 均值（Es ）和用供 试品溶液 或稀释液 制成的内 毒素溶液 的反应终 点浓度的 几何平均 值（Et）。
❖
刻度吸管、凝集管（10×75mm） 、三角瓶 、小试管 （16×100m m）、 试管架、 洗耳球、 封口膜或 金属试管 帽、时钟 、脱脂棉 、吸水纸 、剪刀砂 轮。
❖
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30 分钟以上）去除，塑料用具应选用标明无内毒素并 且对试验 无干扰的 器械（目 前多为无 热原的一 次性用品 ）。
鲎试剂灵敏度复核
。
2、 按照标准品说明书，加入规定量的细菌内毒素检查用水 溶解其内 容物，用 封口膜将 瓶口封严 ，置漩涡 混合器上 混合15分钟 。然后进 行稀释， 制备成4个浓度的 细菌内毒 素标准溶 液，即 2λ、λ、0.5λ和0.25λ（λ为所复核的鲎试剂的标示灵敏度 ）四个浓 度的内毒 素标准溶 液，每稀 释一步 均应在旋 涡混合器 上混匀30 秒钟

浅析细菌内毒素检测方法及常见问题45页PPT

浅析细菌内毒素检测方法及常见问题45页PPT
浅析细菌内毒素检测方法及常见问题
1、战鼓一响，法律无声。——英国 2、任何法律的根本；不，不成文法本 身就是 讲道理 ……法 律，也 ----即 明示道 理。— —爱·科 克
3、法律是最保险的头盔。——爱·科 克 4、一个国家如果纲纪不正，其国风一 定颓败 。—— 塞内加 5、法律不能使人人平等，但是在法律 面前人 就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利

细菌内毒素检查- PPT课件

细菌内毒素检查- PPT课件

当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检 查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试 验。 当鲎试剂、供试品的配方、生产工艺改变或试验 环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时， 须进行干扰试验。

干扰实验
进行干扰试验一般步骤
供试品限值确定 根据鲎试剂的灵敏度确定MVD范围（供试品溶液浓度范围） 预试验（初筛试验）确定样品最大不干扰浓度 正式干扰试验

干扰实验
当Es 在0.5λ～2λ（包括0.λ和2λ）及Et 在0.5Es～2Es（包 括0.5Es和2Es）时，则认为供试品在该浓度下无干扰作用， 可在该浓度下对此供试品进行细菌内毒素检查。 当Et不在0.5Es～2Es（包括0.5Es和2Es）时，则认为供 试品在该浓度下干扰实验。应使用适宜方法排除干扰，如 可将供试品进行更大倍数稀释（不超过MVD ）。

干扰实验
4、当阴性对照为阴性，阳性对照为阳性时，实验有效。 当系列浓度中出现供试品溶液2管为阴性，供试品阳性对 照2管为阳性时，认为供试品在该浓度下不干扰实验，此 稀释倍数即为最小不干扰稀释倍数。即可选择该稀释倍数 进行正式干扰实验。 5、当系列浓度中所有浓度的供试品管都不为阴性，或供 试品阳性对照不为阳性时，说明供试品对内毒素与鲎试剂 的反应存在干扰，则应对供试品进行更大稀释倍数（不得 超过MVD=CL/λ0.03 ），或通过其他适宜的方法（如过滤、 中和、透析或加热处理等）排除干扰。 6、当供试品的内毒素限值单位为EU/mg或EU/U活性单位 时，应将最小不干扰稀释倍数换算成最大不干扰浓度（即 稀释倍数下溶液的浓度），以mg/ml或活性单位/ml表示。

实验原理
利用鲎试剂与微量内毒素产 生凝集反应的现象，以判断 供试品中细菌内毒素的限量 是否符合规定的一种方法。

浅析细菌内毒素检测方法及常见问题解读

浅析细菌内毒素检测方法及常见问题解读

3、实验条件达不到要求 实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室， 应备有一台超净工作台。
4、温度不符合要求 实验室温度为25±2℃较好，恒温水浴箱温度为 37±1℃为宜。
5、忽视样品本身干扰
供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采 用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要 原则是不能影响供试品中的内毒素生物活性。
《中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进 行检查。
将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在 规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供 试品中所含热原的限度是否符合规定。
热原检查法
❖ 与热源对比内毒素检查法优势
❖ 方便、快捷、经济； ❖ 重现性好、灵敏度高； ❖ 避免抗原的产生，克服生物测定的误差；
- / 0.125 -0.903
λc＝lg-1(∑X/4) ＝lg-1｛［（-1.22）＋（-0.903）＋（ -1.22 ）＋（ -1.22 ）］/4｝ ＝0.104（EU/ml）
λc在0. 5λ～2.0λ范围内，符合规定。
❖ 方法学验证—供试品干扰预试验 目的：
确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强）， 得到供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍 数，为正式干扰实验提供依据。
内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。
故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡
❖ 主要特性（实验器材处理方法）
3.水溶性与不挥发性
热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸 气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。
故：不可用湿热灭菌法处理实验器具
❖ 主要特性（去除内毒素方法）
4.滤过性
原体积很小，约在1～5 nm之间，故能通过除 菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不 能通过半透膜。
EU/ml EU/ml

《内毒素检查》PPT课件

《内毒素检查》PPT课件

鲎试剂灵敏度复核
• 计算：当最大浓度2λ管均为阳性，最低浓度0.25λ管均为阴性，阴性对照为阴性 时实验为有效，按下式计算反应终点浓度的几何平均值即为鲎试剂灵敏度的复核 结果。 • λc=lg-1（ΣX/4）
式中 X 为反应终点浓度的对数值（lg）。 反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。 • 结果判断：当λc 在0.5λ～2λ（包括0.5λ和2λ）时，方可用于细菌内毒素检查， 并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度。
• 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验结果的改变时，应 进行鲎试剂灵敏度复核试验。
鲎试剂灵敏度复核
加样结束后，将鲎试剂用封口膜封口，轻轻振动混匀，垂 直放入37℃±1℃恒温器中，保温60±2分钟。 • 结果观察 将试管轻轻取出，缓缓倒转180°，若管内形成凝胶，并且 凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性，未形成凝胶或形成 的凝胶不坚实、变形并从管壁滑脱者为阴性。
内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
鲎试剂法
凝胶法 光度测定法
浊度法 显色基质法
鲎试剂
• 从海洋无脊椎动物“鲎”的蓝色血液中提取的变形细 胞溶解物，经低温冷冻干燥精制而成的生物制剂。 鲎试剂的生物活性以其能检出细菌内毒素的最低有效 浓度表示，即鲎试剂的灵敏度，单位为EU/ml。
• 当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生可能影响检验 结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。
扰细菌内毒素检査的适宜方法（如180℃，2h）。 • 若使用塑料器具，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素
并且对试验无干扰的器具（30% H2O2 处理4h 有效）。
试验的干扰
• 该反应极其灵敏、凝胶形成速率与内毒素浓度成正比 • PH值影响细菌内毒素的检测

《细菌内毒素检查法》课件

《细菌内毒素检查法》 PPT课件
本课程将介绍细菌内毒素检查法的原理、种类、检测方法、应用领域、优势 和局限性以及实施过程，以及其在研究领域中的发展趋势。
细菌内毒素的危害
1 健康危害
因某些细菌种群大量滋生 释放内毒素而导致食物中 毒、中毒性休克等健康问 题。
2 环境危害
有些细菌内毒素难以处理 且对环境造成危害，例如 鱼类致病性细菌产生的内 毒素对水质造成危害。
3 经济危害
某些细菌内毒素对食品安 全造成威胁，导致企业经 济损失。
检测方法
酶联免疫吸附法
基于免疫抗原抗体对，可检测 极低浓度内毒素。
化学检测法
基于内毒素的化学性质，但存 在交叉反应等缺点。
电子显微镜法
可直接观察细胞内毒素的形态 和分布，但检测精度较低。
生物学检测法
基于细胞生物活性特性，能够 反映细胞内毒素的毒性，但耗 时、费力。
应用领域
食品安全
应用于食品卫生监测和食品 安全评价，确保食品安全。
环境监测
帮助研究水质、土壤污染、 制药废水等环境问题的解决。
医疗诊断
辅助疾病的早期诊断和治疗， 特别是针对慢性病。
优势和局限性
优势
• 检测灵敏度高 • 检测方法多样化 • 结果直观、准确
局限性
• 样品处理条件严格 • 存在交叉反应 • 检测过程较复杂
新材料技术
开发出更为灵敏、可靠、高通量、 低成本的检测材料。
实施过程
1
样品处理
对待检样品进行预处理，获取检测样品。
2
检测方法选择
根据不同检测目的，综合选择检测方法。
3
试剂准备
选择合适的试剂，按照比例配制好所需试剂。
4仪器操作使用合源自的仪器，操作细菌内毒素检测。发展趋势

《细菌内毒素检查法》课件


结论
根据实验结果得出结论，对样品中是 否存在内毒素进行评估，并提出建议 和改进措施。
报告实例分析
实例一
某药品细菌内毒素检查报告，通过采用鲎试剂法进行实验，得出阴性结果，证明 该药品中不存在内毒素。
实例二
某注射用水细菌内毒素检查报告，通过采用鲎试剂法进行实验，得出阳性结果， 证明该注射用水中存在内毒素，可能对使用者产生毒性作用。
内毒素可刺激机体产生炎症反 应，导致发热、白细胞反应和 组织损伤等。
内毒素还可诱导机体产生细胞 因子、补体成分和急性期蛋白 等生物活性物质。
内毒素的检测原理
细菌内毒素检测基于鲎试剂与内 毒素的凝集反应，通过检测凝集 反应的产物来反映内毒素的浓度
。
鲎试剂是一种天然的生物试剂， 具有灵敏度高、特异性强、操作
简便等优点。
检测原理基于鲎试剂与内毒素反 应后产生的凝固酶，通过比浊法 或显色法测定其浓度，从而推算
出内毒素的浓度。
03
细菌内毒素检查法实验操作流 程
样品采集与处理
样品采集
采集具有代表性的样品，确保样品无菌，避免外界污染。
样品处理
将采集的样品进行稀释、离心、过滤等处理，以去除杂质和 干扰物质。
试剂与器材准备
特点
具有灵敏度高、特异性好、操作 简便、快速等特点，是国际上普 遍采用的检测方法。
历史与发展
历史
细菌内毒素检查法自20世纪初开始 研究，经过近百年的发展，已经成为 一种成熟的检测技术。
发展
随着科学技术的发展，细菌内毒素检 查法不断改进和完善，检测灵敏度和 特异性不断提高。
应用领域
01
02
03
04
在生物制品领域，细菌内毒素检查可以用于检测疫苗 、抗体、细胞培养物等生物制品中是否存在细菌内毒 素，确保产品的安全性和有效性。
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90EU/ml
0.2ml 1.6ml
10EU/ml 0.2ml 1.8ml
1EU/ml
1ml 1ml
1ml 0.0625EU/ml 1ml 0.125EU/ml
1ml 1ml
0.5EU/ml 1ml 1ml
0.25EU/ml
0.2ml 0.2ml 1ml
1ml 1ml
1ml
溶
解
后
的
标
准
品
水
90
10
近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热源 法
❖ 在药检中的应用
细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法， 已经广泛的被世界各国药典收载。
❖ 成品检查——药品安全性检查之一
❖ 半成品（生产过程）检查——事前质控手段，避 免造成药品成批报废
二、细菌内毒素检测方法
❖ 《中国药典》批准使用方法：
凝胶
名词解释1—鲎及鲎试剂
鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物 门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一 带。
鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机 械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物， 能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应 的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体 外检测内毒素的敏感试剂。
名词解释2—国家标准品及工作ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ准品
国家标准品： （单位：EU/ml）
自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、 仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的 效价；
工作标准品：
经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符 复核、干扰试验及各种阳性对照；
名词解释3—细菌内毒素检查用水
凝胶法：
内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；
EU/ml EU/ml
水
水
水
水
水
1 EU/ml
0.5 EU/ml
（2 λ）
0.25 EU/ml
（ λ）
0.125 0.0625 EU/ml EU/ml
（0.5 λ） （0.25 λ）
2、溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml装量，则取18支，每支加入 0.1mlBET水溶解；若鲎试剂装量大于0.1ml，则取若干支， 按标示量加入 BET水溶解，再取0.1ml分装于标准玻璃试管 （10mm×75mm），将试管按如下形状排列。
浅析细菌内毒素检 测方法及常见问题
(ppt)
（优选）浅析细菌内毒素检测 方法及常见问题
一、细 菌 内 毒 素 简 介
❖ 主要内容
—— 来源 —— 特性 —— 与热源的关系 —— 在药检中应用
❖ 主要来源
主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自 溶后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖， 这是一种大分子物质，分子量约为106，其粒径约 在1~ 5纳米 。
《中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进 行检查。
将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在 规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供 试品中所含热原的限度是否符合规定。
热原检查法
❖ 与热源对比内毒素检查法优势
❖ 方便、快捷、经济； ❖ 重现性好、灵敏度高； ❖ 避免抗原的产生，克服生物测定的误差；
故：灭菌注射用水≠细菌内毒素检查用水
光度法：
内毒素含量应小于0.005EU/ml；
细菌内毒素检测之凝胶法
❖ 实验程序 1、试验准备：试剂、仪器及用具 2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度 3、鲎试剂灵敏度复核 4、供试品干扰试验（新药或新方法） 5、供试品细菌内毒素凝胶法检测
❖ 实验材料及用具
1、仪器
内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。
故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡
❖ 主要特性（实验器材处理方法）
3.水溶性与不挥发性
热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸 气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。
故：不可用湿热灭菌法处理实验器具
❖ 主要特性（去除内毒素方法）
4.滤过性
原体积很小，约在1～5 nm之间，故能通过除 菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不 能通过半透膜。
试验举例：内毒素工作标准品为90EU/支；
待测鲎试剂灵敏度λ＝0.25EU/ml。
1、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉 末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用75％酒精擦拭后启开， 加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀15min 后进行稀释，步骤如下(箭头下方为加入BET水量)：
❖ 试剂
1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号 2、内毒素工作标准品 3、内毒素检查用水 4、75％乙醇
❖ 常用英文缩写
BET：细菌内毒素检查 BET水：细菌内毒素检查用水
MVD：供试品最大有效稀释倍数 NC：阴性对照
MVC：供试品最低有效浓度
PC：阳性对照
λ：鲎试剂灵敏度
L：供试品细菌内毒素限值
❖ 灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度 复核。目的是为了对试剂、检测者的操作、环境条件、水平 条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。
5.吸附性
能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有 一定的电荷，因而可被某些离子交换介质吸附。
❖热原=内毒素 ？
热原指微生物产生的某些多糖蛋白复合物 等使人体发热的物质，不仅仅是细菌内毒素。
但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热 原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒
素就是控制热原。
❖ 热原检查方法简介
名称
天平
电热干燥箱 恒温水浴箱
水银或酒精温度计
漩涡混合器
计时器
2、器具
器具分类
要求 感量0.1mg以下
～300℃ 37±1 ℃ ～100 ℃±1 ℃
/ 60min±1min
器具名称
反应试管
玻璃试管（外径10×75mm）、试管架、 小三角瓶或磨口瓶
移液器具 刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头
其他
酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、 封口膜、记号笔
凝胶法
测定
浊度法
方法
光度测定法
显色基质法
❖ 供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。但当测 定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。
❖ 本节将着重介绍凝胶法的操作与有关原理。
鲎试剂与内毒素反应机理
内毒素
C因子
活化的C因子
B因子
活化的B因子
凝固酶原
凝固酶
凝固蛋白原 鲎凝血系统－酶联反应
细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中 含内毒素的量为1至100EU/ml。
❖主要特性（实验器材处理方法）
1.耐热性
一般在100℃加热1小时无影响，120℃加热4 小时能破坏98％，180－200℃干热2小时或 250℃干热半小时才能完全破坏。
故：注射剂的一般灭菌条件是不能破坏内毒素的。
2.不耐酸碱性