无菌、微生物限度、细菌内毒素方法学验证

摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。

关键词：细菌内毒素检查、方法、验证细菌内毒素检查法作为控制药品质量的一种有效方法，已经广泛的被世界各国药典收载。

经过30多年的不断改进，无论是凝胶法还是光度法均比较成熟和完善。

但是，在为新化合物或新药建立细菌内毒素检查方法时，常常会遇到各种各样的困难，尤其是尚处于新药研发早期阶段的药物，由于药物制剂、赋形剂等还不稳定，经常会发生变化，这样就给方法的建立带来不同程度的影响。

在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。

以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。

此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。

关键词：细菌内毒素方法建立几个内毒素检查一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。

可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。

当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。

1、细菌内毒素限值的确定一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求？样品的内毒素含量具体是多少？这些问题不但关注用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。

尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终目的还是要为控制药品质量服务。

因此，在方法建立时，不但要阐明限值的合理性，考虑技术可能达到的限值，同时还要满足相关药品管理法规的要求。

注射液研发的流程一、试验前期资料信息的收集1、初步调查品种的基本情况，包括品种的市场份额、销量，药物研究历史等安全有效的信息，有无专利和保护信息、技术壁垒等。

2、综合评估撰写项目可行性分析报告，包括产品基本信息，立项目的与依据，有无知识产权和药政保护，产品的特点及试验难易程度、设备是否齐备、国家政策风险等，有无技术壁垒，产品优劣势，经费预算与市场回报。

3、是否有合法原料提供，及价格如果只是进行制剂的仿制研究，必须提供原料药的合法证明；对于仿制原料的话，必须对药物的合成工艺打通，优化中试生产，质量合格，杂质种类和数量不高于上市品，必须与制剂一同申报。

4、了解临床资料、不良反应资料及产品说明书等相关资料5、了解国内及进口制剂剂型及规格全面掌握拟仿制药物的国内外上市情况，包括上市的剂型、规格、厂家等。

6、产品质量标准查阅产品相关的国内标准（药典标准和国内首仿标准）和进口标准，并试着草拟自己的标准。

7、工艺研究资料查阅参考文献（CNKI、博硕论文、维普、专利），查阅其合成工艺或制剂工艺，或查找相同剂型的工艺研究资料，对其分析汇总，撰写自己的初步研究方案。

8、专利、国家政策及生产注册情况查询专利、国家政策及生产注册情况，以保证产品研究能够顺利报批。

二、试验用物品的采购1、原料的采购如果只是申请制剂的仿制，必须提供原料的合法来源及其证明文件，必须选择国内外合法的厂商进行原料的购买，购买时需要厂家提供原料药的批准证明文件，药品标准，检验报告，原料药生产企业的营业执照，药品生产许可证，药品生产质量管理规范认证证书，购销发票，供货协议等复印件，并要注意原料的种类，是注射级别的还是口服级别的，原料的包装规格，原料标准是药典标准还是注册标准，原料的采购量是否充足，价格如何等。

2、辅料和包材的购买要保证辅料和包材的合法来源，通过对仿制药处方及剂型的分析，粗略知道所用辅料和包装材料的种类和用量，已有的材料不需购买，没有的在国家批准的厂家购买辅料和包材，并需要厂家提供辅料和包材的厂家资质（生产许可证和营业执照，GMP 证书），药品包装材料和容器注册证，发票，检验报告，标准，购销合同等的复印件。

无菌、内毒素检查法验证讲义1凝胶法和终点法采用单一的时间点采集结果数据，决定反应在规定的时间内是否达到预定的水平。

而动态法则是在适当的检测波长下监测整个反应过程的数据。

内毒素的浓度决定了蛋白凝胶形成的速率，因此，通过测量达到设定光密度的时间，确定光密度随时间的改变情况，以建立光密度变化的速率与参照内毒素之间的线性关系。

终点法中人为的加入反应终止剂，并且在此时间点读取和记录样品和标准曲线点的光密度，其缺点是：必须人为的终止反应，标准曲线的范围有限，仅为一个Log。

而在动态法中光度检测仪连续的读取光密度的变化，动态监测光密度的变化，记录达到设定的光密度所需要的时间。

动态法以将已知的标准内毒素浓度的对数与最终反应时间的对数作图，因此，测定范围可跨越4-5个Log（一般为0.005-50EU/ml），克服了终点法的缺点。

动态比浊法：凝胶的浊度形成是凝胶形成的前提，因此，在这个意义上浊度法其实是凝胶法的延伸。

进行浊度法的鲎试剂含有凝固蛋白原的量足以在凝固酶的作用下形成浊度，但不足以形成凝胶。

浊度法克服了凝胶法只能检测某一个限值水平的缺点，可以定量一定范围内的内毒素含量。

现在细菌内毒素定量法的使用率在国外已超过凝胶法，大约占65%～70%，并且还在逐年上升。

细菌内毒素检查方法的建立方法标准物质限值的确定干扰试验检验一、方法细菌内毒素检查法包括凝胶法和光度测定法凝胶法为限量测定方法，光度测定法为定量测定方法凝胶法分为限量试验和半定量试验；光度测定法包括动态浊度法、终点浊度法、动态显色法和终点显色法两种方法可任选一种进行内毒素的检测当测定结果有争议时，除有特殊规定外，以凝胶法结果为准二、标准物质除另有规定外，细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素工作对照品应使用由中国药品生物制品检定所统一发放的标准品三、限值的确定 1、计算公式L=K/M 药品人用最大剂量参考《国家药品标准化学药品说明书内容汇编》。

中国人均体重按60kg计算；人均体表面积按1.55m2计算。

答卷人部门得分工号考试日期：年月日本试卷得分在60分（含）以上为合格，否则为不合格。

一．选择题（每题4分，共20分）1、细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，用于凝胶法时，其内毒素含量小于:。

( )A、0.010EU/mlB、0.005EU/mlC、0.015EU/mlD、0.020EU/ml2、耐热器皿常用去除可能存在的外源性内毒素。

( )A、干热灭菌法(160℃、30分钟以上)B、干热灭菌法(250℃、30分钟以上)C、干热灭菌法(170℃、30分钟以上)D、干热灭菌法(250℃、15分钟)3、细菌内毒素的成分是。

(B)A、H抗原B、脂多糖C、肽聚糖D、荚膜多糖4、供试品溶液本身为强酸、强碱，或本身具有偏酸偏碱的缓冲作用时，排出干扰的方法为:( )A、将供试品的pH值调节至6.0~8.0B、添加适量钙离子、镁离子C、将供试品适当加热D、选择适当的超滤设备进行滤除5、细菌内毒素检查法主要依靠细菌内毒素可以活化，来检测细菌内毒素。

( )A、凝固蛋白原B、凝固酶原C、B因子D、C因子二、多选题(每题4分，共20分)1、无菌药品附录中规定，必要时，物料的质量标准中应当包括:检查项目。

( )A、微生物限度B、细菌内毒素C、热原D、培养基的外观2、细菌内毒素的活性单位的表达方式包括:。

( )A、EUB、IUC、IED、L3、细菌内毒素检查时常见的干扰因素包括:。

( )A、含有螯合剂B、含有某些抗凝因子C、含有葡聚糖类物质D、含有干扰作用的小分子4、对于存在内毒素污染的物质或器具，则可以选择下述方法去除:。

( )A、加热法B、酸碱法C、蒸馏法D、吸附法5、热原污染的途径。

( )A、注射用水B、从原辅料中带入C、从容器、用具、管道和装置等带入D、制备过程中的污染三．判断题（每空5分,共20分）1. 平皿法操作时应先注入培养基，再加入1ml供试液。

（）2. 制备的菌液若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在2-8℃可在24小时内使用（）3. 培基适用性检查是通过检验用培养基与对照培养基的比较，以阳性菌的生长状态或特征来评价判断检验用培养基是否符合检验要求。

微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题
钟长鸣;陈希;吴燕红
【期刊名称】《中国药品标准》
【年(卷),期】2011(12)1
【摘要】@@ 有些药品由于其自身杀菌和抑菌作用,在微生物限度和无菌检查时就有可能出现假阴性结果,为使检查结果真实可靠则必须消除其自身杀菌和抑菌作用.消除药品自身杀菌和抑菌作用的方法有:培养基稀释、离心沉淀集菌、薄膜过滤、中和等方法.寻找一种恰当的能消除药品其自身杀菌和抑菌作用的方法是其方法验证的内容.我所在开展方法验证工作中发现存在一些问题.
【总页数】2页(P12-13)
【作者】钟长鸣;陈希;吴燕红
【作者单位】江西省食品药品检验所,南昌,330029;江西省食品药品检验所,南昌,330029;江西省食品药品检验所,南昌,330029
【正文语种】中文
【中图分类】R927
【相关文献】
1.对替硝唑注射液无菌检查方法验证中不同厂家集菌器使用问题的探讨 [J], 凌真;陈莹洁;丁莉
2.无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析 [J], 国明;祝清芬;郑力真
3.加强药品无菌检查和微生物限度检查方法验证的对策 [J], 赵建英;寿文虹;李爱玲
4.无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析 [J], 李红
5.微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题 [J], 郭焕君
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无菌检查方法验证：取本品，分别加灭菌注射用水 1ml 溶解，采用薄膜过滤法依法检查(中国药典 2022 年版二部附录Ⅺ H )，应符合规定。

菌液制备： 10 倍稀释法培养基 营养琼脂培养基营养琼脂培养基营养琼脂培养基硫乙醇酸盐培养基改良马丁培养基改良马丁琼脂斜面 培养基菌悬液制备计数结果菌种 代数 稀释级 菌落数(cfu/ml )枯草芽孢杆菌 4 10-6 61金黄色葡萄球菌 4 10-7 89大肠埃希菌 4 10-6 78生孢梭菌 4 10-6 67白色念珠菌 4 10-7 83黑曲霉菌 4 10-4 401、供试品处理将供试品去掉铝塑盖，外表面用75%酒精全面消毒，然后向每支样品中注 入 1.0ml0.1%的蛋白胨灭菌溶液，备用。

2、检查阳性对照： 将等量的试验菌直接加入到液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液 体培养基管中，在相应的温度下培养。

液体硫乙醇酸盐培养基管在 30-35℃下培菌种枯草芽孢杆菌 CMCC(B)63501 金黄色葡萄球菌 CMCC(B)26003 大肠埃希菌 CMCC(B)44102生孢梭菌 CMCC(B)64941白色念珠菌 CMCC(F)98001黑曲霉菌 CMCC(F)98003菌悬液制备用 0.9% 无菌氯化钠溶液制成每 1ml 含菌少于 100cfu (菌落行程单 位)的菌悬液加入 5ml0.9%无菌氯化钠溶液，将 孢子洗脱，再同上制成每 ml 含菌 小于 100cfu 的菌悬液养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。

观察记录。

阴性对照：将灭菌的液体硫乙醇酸盐培养基或者改良马丁液体培养基管直接放在相应的温度下培养。

液体硫乙醇酸盐培养基管在30-35℃下培养；改良马丁液体培养基管在23-28℃下培养3-5 天。

观察记录。

样品 (薄膜过滤法)：每种实验菌取10 支处理好的供试品溶液，将溶液合并后加入制备好的菌悬液1ml，用0.1%的蛋白胨灭菌溶液稀释至100ml，按薄膜过滤法过滤，取出滤膜，将其分为3 等份，分别置于含硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基的容器中，其中一份作为阳性对照用。

微生物检测项目
食品/农产品/保健品：菌落总数、霉菌、酵母菌、大肠菌群、沙门氏菌、单核增生李斯特氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、商业无菌等
水质（饮用水/泳池水/纯化水等）：细菌总数、总大肠菌群、耐热大肠菌群、大肠埃希氏菌等
一次性卫生用品：微生物指标、抗菌性能、抑菌性能、杀菌性能等
原辅料及药品：微生物限度检查（大肠埃希菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠菌群及梭菌）及方法学验证、细菌内毒素检测、无菌检查及方法适用性验证、培养基适用性检查及灵敏度验证
医疗器械/设备：初始污染菌、无菌检查及方法适用性验证、培养基适用性检查及灵敏度验、生物负荷试验等
日化洗涤产品：微生物指标、抗菌性能、抑菌性能、杀菌性能等
抗菌制品/材料：抗菌检测（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等）、防霉检测
生物肥料：有效活菌数（地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、固氮菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、胶冻样芽孢杆菌等）
公共用品用具：细菌总数、大肠菌群、致病菌等
集中空调通风系统：军团菌、β-溶血性链球菌、细菌总数、真菌总数等
消毒产品：（消毒剂/抗抑菌剂/消毒器械）微生物指标、微生物杀灭试验、微生物抑菌试验、现场试验、模拟现场试验等。

盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液无菌检查方法学验证作者：吴羽岚嵇海澄来源：《中国医药科学》2013年第13期[摘要] 目的对盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液的无菌检查方法进行探讨，建立其无菌检查方法。

方法按《中国药典》（2010年版）附录ⅪH无菌检查方法进行。

结果在验证条件下，该方法能消除对微生物生长的抑制作用。

结论可以采用此法对本品的无菌进行检查。

[关键词] 盐酸左氧氟沙星氯化钠注射液；无菌检查方法；薄膜过滤法[中图分类号] R-331 [文献标识码] B [文章编号] 2095-0616（2013）13-95-02Study of sterile examination method of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection WU Yulan JI HaichengJiangsu Hansoh Pharmaceutical Co.Ltd.，Lianyungang 222000，China[Abstract] Objective To discuss and establish the sterile examination method of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection. Methods The test were done according to appendix XIH-sterile examination method in"Chinese Pharmacopeia"（2010 edition）. Results The method could eliminate the inhibition of microbe growth under the validation condition. Conclusion This method can be used for the sterile examination of levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection.[Key words] Levofloxacin hydrochloride and sodium chloride injection；Sterile examination method；Membrane-filter procedure盐酸左氧氟沙星（Levofloxacin Hydrochloride）化学名称：（S）-9-氟-2，3-二氢-3-甲基-10-（4-甲基-1-哌嗪基）-7-氧代-7H-吡啶并[1，2，3-de]-[1，4]苯并嗪-6-羧酸盐酸盐的水合物，属第三代喹诺酮类抗菌药。