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2008 无菌_微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析_国明

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中国药典2005年版无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证内容简介

中国药典2005年版无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证内容简介
如同时进行无菌检查一定要按照规定的 检验数量和检验量取样。
2006年8月
33
生产单位进行方法学验证时检验数量要按照表1 批出厂产品最少检验数量。检验量（每只样品 接入每种培养基的最少样品量）同上市抽验品 种。
无菌检查法中规定：只要供试品特性允许，应 将所有容器内的全部内容物过滤。因此，验证 试验中检验量就多不就少，如10ml注射液，虽 然每个滤膜每容器取2ml也符合药典规定，10支 分配至3个或更多滤筒也可，但建议取15支分3 个滤筒（贵重药品和抗生素品种可灵活掌握， 但不能低于最少量）。
2006年8月
6
1．“微生物限度检查”和“无菌检查”是药品安 全性检查的重要项目。虽然近几版《中国药典》均 收载有“微生物限度检查法”和“无菌检查法”， 但在如何保证检验方法的科学性和检验结果的准确 性方面与国外药典相比仍具有一定差距，其关键是 《中国药典》未强调对检验方法进行必要的方法验 证。为此，药典会设立专项科研课题，对2005年版 《中国药典》的“微生物限度检查法”和“无菌检 查法”增加验证试验的必要性进行研讨。根据研究 结果，2005年版《中国药典》规定当进行药品的 “微生物限度检查”或“无菌检查”时应进行方法 验证。
2006年8月
18
接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜 面培养基上，23~28℃培养5～7天，加入3～ 5ml0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱，然 后，吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌棉 花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无 菌试管内，用0.9％无菌氧化钠溶液制成每 lml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。
量，必要时说明滤膜材质、仪器、泵速等条件）。 需要中和、酶处理等特殊处理方法的需说明 逐日记录各菌的生长情况
2006年8月

浅析细菌内毒素检测方法及常见问题

浅析细菌内毒素检测方法及常见问题
细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中 含内毒素的量为1至100EU/ml。
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4
❖主要特性（实验器材处理方法）
1.耐热性
一般在100℃加热1小时无影响，120℃加热4 小时能破坏98％，180－200℃干热2小时或 250℃干热半小时才能完全破坏。
故：注射剂的一般灭菌条件是不能破坏内毒素的。
L：供试品细菌内毒素限值
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21
❖ 灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度 复核。目的是为了对试剂、检测者的操作、环境条件、水平 条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。
试验举例：内毒素工作标准品为90EU/支；
待测鲎试剂灵敏度λ＝0.25EU/ml。
1、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉 末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用75％酒精擦拭后启开， 加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀15min 后进行稀释，步骤如下(箭头下方为加入BET水量)：
❖ 本节将着重介绍凝胶法的操作与有关原理。
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13
鲎试剂与内毒素反应机理
内毒素
C因子
活化的C因子
B因子
活化的B因子
凝固酶原
凝固酶
凝固蛋白原
鲎凝血系统－酶联反应
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凝胶
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名词解释1—鲎及鲎试剂
鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物 门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一 带。
光度法：
内毒素含量应小于0.005EU/ml；
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18
细菌内毒素检测之凝胶法
❖ 实验程序 1、试验准备：试剂、仪器及用具 2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度 3、鲎试剂灵敏度复核 4、供试品干扰试验（新药或新方法） 5、供试品细菌内毒素凝胶法检测

微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题

微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题

微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题
钟长鸣;陈希;吴燕红
【期刊名称】《中国药品标准》
【年(卷),期】2011(12)1
【摘要】@@ 有些药品由于其自身杀菌和抑菌作用,在微生物限度和无菌检查时就有可能出现假阴性结果,为使检查结果真实可靠则必须消除其自身杀菌和抑菌作用.消除药品自身杀菌和抑菌作用的方法有:培养基稀释、离心沉淀集菌、薄膜过滤、中和等方法.寻找一种恰当的能消除药品其自身杀菌和抑菌作用的方法是其方法验证的内容.我所在开展方法验证工作中发现存在一些问题.
【总页数】2页(P12-13)
【作者】钟长鸣;陈希;吴燕红
【作者单位】江西省食品药品检验所,南昌,330029;江西省食品药品检验所,南昌,330029;江西省食品药品检验所,南昌,330029
【正文语种】中文
【中图分类】R927
【相关文献】
1.对替硝唑注射液无菌检查方法验证中不同厂家集菌器使用问题的探讨 [J], 凌真;陈莹洁;丁莉
2.无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析 [J], 国明;祝清芬;郑力真
3.加强药品无菌检查和微生物限度检查方法验证的对策 [J], 赵建英;寿文虹;李爱玲
4.无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析 [J], 李红
5.微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题 [J], 郭焕君
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细菌内毒素检查法常见问题与探讨

细菌内毒素检查法常见问题与探讨

此文章来源：/s/blog_4fcb513e01000bgj.html细菌内毒素检查法常见问题与探讨摘要: 目的总结归纳细菌内毒素检查法中的常见问题，方法收集整理工作中发现的问题，查阅国内外有关文献资料，对照分析应用情况并比较其差异。

结果与结论：从五个方面较为全面的总结了细菌内毒素检查法所涉及到的问题，认为在应用方面还需要进一步完善、规范。

关键词：细菌内毒素检查法；问题Discussion of common issues in the BactarilEndutoxin Test, BETZHOU Su-Wen.（Pharmacology Laboratory, Hubei Institute of Drug Examination,Wuhan 430064）ABSTRACT: OBJECTIVE to summarize and conclude the common problems in the bacterial endotoxins test. METHODS by collecting the practical problems in work and referring to the related articals and information, we compared and analyzed their differences. RESULTSand CONCLUSION the problems concerning the bacterial andotoxins test were comprehensively generalized in the review from five aspects and the conclusion showed that the application of the bacterial endotoxins test need to be further enhanced and standardized.Key word: Bactaril Endutoxin Test；problems细菌内毒素检查法(BactarilEndutoxinTest,BET )是近二十年来发展起来的用于检测药品及其中间品中内毒素污染的一种方法；作为家兔热原检查法的一种替代，已经十分成熟，美国药典迄今已为八百余种药品制定了该项检查法，中国药典自1990年版开始收载以来，每版药典细菌内毒素检查品种也逐步增多，2005年版已增加到204种，并且在增补本中将继续增加收载数量，该方法相对家兔热原检查法而言，有劳动强度低、快捷、经济、灵敏和易于标准化等优点，受到广大药品质检人员高度关注。

微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题

微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题

86 I FOOD INDUSTRY I理论THEORY微生物限度和无菌检查方法验证中存在的问题文 郭焕君河北省清河县食品药品检验检测中心的检查上，要根据药品的成分和特点进行分类检查，如对于无抑菌成分和作用的品种，就可按照常规方法进行验证；而对于有抑菌成分和效果的药品，则要根据其菌株特点进行分类验证。

三、方法验证资料尚未实现资源共享方法验证资料是反映药厂对药品的检测质量以及微生物控制效率的总结性文件。

但在实际的检验和审核工作中，由于方法验证资料的上交和共享中牵扯到了大量的人力、物力以及资金的投入，导致许多检验机构在实际的资料审核过程中，为了降低成本，减少工作任务，而忽视了方法验证资料共享的重要性。

并且，还有一部分药厂为了隐瞒自身的药品质量问题，故意拖延方法验证资料时间，从而导致药品的质检工作存在一定程度的纰漏，药品的微生物限度和无菌检查工作不符合规定。

为此，药品监督管理部门必须重视强化方法验证监督管理，严格要求药厂提供准确、可靠的方法验证数据，实现方法验证数据的实时共享，有效保障药品的安全性。

总结总而言之，药品的无菌检查和微生物限度检查是检验药品安全性和质量的重要工作。

为了能够确保药厂产品的安全性和质量，促使我国医疗事业实现可持续性发展，必须重视方法验证工作的实效性，及时反思与改正，以确保药品微生物限度和无菌检查方法验证工作有序展开。

由于目前的药品类型各不相同，其中有许多药品本身就带有一定的杀菌和抑菌作用，这就导致了在实际的微生物限度和无菌检查时会出现假阴性的检测结果，从而严重影响药品检测的真实性。

因此，为了能够更好地完善我国药品的微生物控制工作，除了要针对药品的特点进行差异化检测外，还应加强检测人员专业素养、优化方法验证形式。

一、检测人员专业能力有待加强在药品的微生物限度和无菌检查工作中，参与检测的工作人员是影响药品检测真实性的决定性因素。

由于这是一项程序较为复杂和烦琐的工作，相关工作人员不但要有一定的微生物专业基础知识，同时还要具备一定的操作技能。

浅析细菌内毒素检测方法及常见问题解读

浅析细菌内毒素检测方法及常见问题解读

3、实验条件达不到要求 实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室， 应备有一台超净工作台。
4、温度不符合要求 实验室温度为25±2℃较好，恒温水浴箱温度为 37±1℃为宜。
5、忽视样品本身干扰
供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采 用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要 原则是不能影响供试品中的内毒素生物活性。
《中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进 行检查。
将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在 规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供 试品中所含热原的限度是否符合规定。
热原检查法
❖ 与热源对比内毒素检查法优势
❖ 方便、快捷、经济； ❖ 重现性好、灵敏度高； ❖ 避免抗原的产生，克服生物测定的误差；
- / 0.125 -0.903
λc＝lg-1(∑X/4) ＝lg-1｛［（-1.22）＋（-0.903）＋（ -1.22 ）＋（ -1.22 ）］/4｝ ＝0.104（EU/ml）
λc在0. 5λ～2.0λ范围内，符合规定。
❖ 方法学验证—供试品干扰预试验 目的：
确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强）， 得到供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍 数，为正式干扰实验提供依据。
内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。
故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡
❖ 主要特性（实验器材处理方法）
3.水溶性与不挥发性
热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸 气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。
故：不可用湿热灭菌法处理实验器具
❖ 主要特性（去除内毒素方法）
4.滤过性
原体积很小，约在1～5 nm之间，故能通过除 菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不 能通过半透膜。
EU/ml EU/ml

中国药典无菌、微生物限度与细菌内毒素检查方法学验证内容详解

中国药典无菌、微生物限度与细菌内毒素检查方法学验证内容详解

国家药典委员会
中国药品生物制品检定所
二00五年十月十一日
● 验证的目的: 验证所采用的方法和条件是否适合 于供试品的无菌检查。 即确认供试品在该检验量、该检验条件下无抑菌 活性或其抑菌活性以被充分消除到可以忽略不计。 ● 验证的意义：保证检验结果的准确、可靠及检 验方法的完整性。
二、无菌检查验证的关键点
中检所和药典会多次召开会议肯定工作的成绩、 研讨存在的问题，希望各级领导能给予高度重 视，从各方面支持这项工作长期持续发展。 实际工作中，药品生产、研发企业和各级药检 所在工作中都存在很多困难和问题。
关于执行《中国药典》2005年版微生物限度 检查法和无菌检查法有关问题的说明
国药典发[2005]98号
验证的目的是为了确认试验中供试品应选择药 典中所收载的何种供试液制备方法、何种测定
方法及确定的检测系统是否适用于该供 试品的检验，即只有通过方法验证，才 能确定供试品的检验条件和方法，保证 “微生物限度检查”或“无菌检查”方法的 科学性和检验结果的准确性。
2．不同企业生产的相同品种，特别是中 成药，因原料来源、工艺、辅料的不同， 药品可能表现出不同的抑菌特性；同一个 企业生产的相同品种，因原料来源不同、 工艺改变或不同实验室等原因，也可能导 致检测结果的差异。因此，不同企业生产 的相同品种进行“微生物限度检查”或“无菌 检查”时，其具体试验方法如冲洗量等不 能简单照搬，需通过验证试验核实该试验 方法和检测系统是否适宜。
生孢梭菌 (Clostridium sporogenes) [CMCC(B) 64 941]
白色念珠菌 (Candida albicans) [CMCC(F) 98 001]
黑曲霉 (Asperglllus niger) [CMCC(F) 98 003]

中国药典2005年版无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证内容简介

中国药典2005年版无菌、微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证内容简介
2006年8月 10
对国内新药的注册检验，也应请企业提供方法验 证资料，如果企业提供不出方法学验证资料，根 据药品注册管理办法，应在审核意见中明确指出 “方法学未经验证，无法检验”，并建议企业重 新建立“微生物限度检查”或“无菌检查”方法。 监督抽验药品，由于2005年版以前历版《中国药 典》未强调进行方法学验证，故各药检所目前在 进行具体品种检验时难度较大，故也应请企业提 供方法验证资料并进行审核，未经过方法学验证 的“微生物限度检查”或“无菌检查”结果，决 不能给出“符合2005年版《中国药典》的规定” 的结论。
2006年8月 6
1．“微生物限度检查”和“无菌检查”是药品安 全性检查的重要项目。虽然近几版《中国药典》均 收载有“微生物限度检查法”和“无菌检查法”， 但在如何保证检验方法的科学性和检验结果的准确 性方面与国外药典相比仍具有一定差距，其关键是 《中国药典》未强调对检验方法进行必要的方法验 证。为此，药典会设立专项科研课题，对2005年版 《中国药典》的“微生物限度检查法”和“无菌检 查法”增加验证试验的必要性进行研讨。根据研究 结果，2005年版《中国药典》规定当进行药品的 “微生物限度检查”或“无菌检查”时应进行方法 验证。
相关规定 无菌检查验证的关键点 验证中常见的问题
2006年8月
3
一、相关规定
药品无菌和微生物限度检查方法验证作为中国药 典2005年版增订的一项重要内容对促进我国药品 微生物检验的标准化是十分重要和必要的，执行 近一年以来的情况表明，方法验证是促使我国药 品无菌和微生物限度检查方法更加合理、科学和 严谨的重要途径。（2006年6月全国会议纪要）
2006年8月
16
菌种的要求： 传代次数不得超过5代（从菌种保存中心获得的 冷冻干燥菌种为第0代），并采用适宜的菌种保 藏技术，以保证试验菌株的生物学特性。 加菌量:＜100cfu。 验证时，按“供试品的无菌检查”的规定及下 列要求进行操作。对每—试验菌应逐一进行验 证。

无菌、微生物限度检查及方法验证

无菌、微生物限度检查及方法验证
7
此法为实验室工作用菌种的最常用的保藏方法，仅能用于工作用菌种的短期保藏。
8
琼脂斜面低温保藏法保藏法（厂家常用）
保藏芽胞液对
产芽胞的微生物宜制成芽胞菌悬液后再保藏， 无菌操作，取1ml孢子液接入茄形瓶或培养皿内，轻轻转动使菌液均匀分布于培养基表面。 将培养皿在适当的温度下培养。一般需要7天或更长时间 在层流台下，取3~5ml氯化钠磷酸盐缓冲液（pH7.0）加入培养皿内 用无菌玻璃L棒轻轻刮下菌苔，注意不要划破培养基。 用无菌注射器或无菌吸管吸取菌悬液，收集于试管中。 将收集的芽胞液放在80~90℃水浴中加热15分钟，冷却。 做好标记，放至2~8℃冰箱中保藏。原始芽胞液可保存1年。 每次使用前用平皿法重新标定其浓度。
微生物实验室的质量管理
设施—洁净室、净化工作台、生物安全柜。 设备—高压蒸汽灭菌器、电热恒温干烤箱、培养箱、冰箱。 实验仪器—全封闭薄膜过滤装置、电动匀浆仪、电热恒温水浴箱、离心机、显微镜，及刻度吸管、试管、三角烧瓶、培养皿等。 建立主要设施、设备、仪器的明细记录，内容包括名称、型号、生产厂家、购买日期。 质量保证档案：购买发票、安装验收或开箱验收记录、调试记录、计量检定或运行校验合格证、指定专人负责、制订标准操作规程（SOP）、建立使用登记册，维修、保养记录、改造或更新记录、直至报废记录。
记录温湿度是否在规定的范围内，每次实验时，对操作室和层流台做微生物沉降菌落计数并记录；如发现问题应找原因，及时报修和报告并将报修原因和结果记录归档。如遇停电，应立即停止实验，重新进入无菌室前，至少开启机房运转1小时以上。
实验室使用管理
微生物实验室的质量管理
平时实验室内应尽可能减少人员的走动或活动，通向洁净室的门要关闭或安装自动闭门器使其保持关闭状态。
枯草芽孢杆菌 [CMCC（B）63501] 金黄色葡萄球菌 [CMCC（B）26003] 生孢梭菌 [CMCC（B）64941] 铜绿假单胞菌 [CMCC（B）10104] 大肠埃希菌 [CMCC（B）44102] 乙型副伤寒沙门菌 [CMCC（B）50094] 白色念珠菌 [CMCC（B）98001] 黑曲霉 [CMCC（B）9 003]

浅谈目前无菌检查和微生物限度检查存在的问题

浅谈目前无菌检查和微生物限度检查存在的问题

浅谈目前无菌检查和微生物限度检查存在的问题李玉芹(江苏省常州药品检验所,常州 213002)摘要: 中国药典 2005年版增订了无菌检查、微生物限度检查方法验证试验,本文对目前无菌检查、微生物限度检查存在的问题加以探讨,并提出了建议。

关键词: 无菌检查;微生物限度检查;方法验证中图分类号:R927 33 文献标识码:A 文章编号:1002 7777(2007)12 1011 02Discussion on the Problem Existed in Sterility Test and Microbial Limit TestLi Yuqin(Changzhou Institute for Drug Co ntro l,Chang zhou213002)ABSTRAC T Chinese Pharmaco poeia2005has revised and enlarg ed the v alidation of sterility test and micro bial lim it test.T his article discusses the pr oblems ex isted in sterility test and microbial limit test at present,and gives som e sugg estions at this po int.KEY WORDS sterility test;m icrobial limit test;validation mo thed根据国家药典会国药典发[2005]98号文 关于执行 中国药典 2005年版微生物限度检查法和无菌检查法有关问题的说明 的规定:当进行药品无菌检查或微生物限度检查时,应进行方法验证,否则决不能出具 符合2005年版 中国药典 的规定 的结论。

方法验证的目的是为了确认试验中供试品应选择 中国药典 收载的何种供试液制备方法及何种测定方法,含抑菌成分的药品进行无菌检查、微生物限度检查时,必须消除供试品的抑菌作用或使其抑菌作用可以忽略不计,才能根据 中国药典 规定的方法进行检查。

细菌内毒素检查方法以及限度要求浅识

细菌内毒素检查方法以及限度要求浅识

细菌内毒素检查方法以及限度要求浅识摘要：由于方法本身的优越性，采用细菌内毒素检查法取代热原法的国内申报资料逐年增加，但部分资料仍存在一定缺陷，本文对该法及其影响因素、质控要点等进行简要评述，以期申请人注意规范对该部分的研究工作。

关键词：细菌内毒素方法学热原检查法或细菌内毒素检查法是注射制剂的关键质控指标之一。

一直以来，热原检查在药物研发中广泛使用，方法比较成熟，目前药典和其他国家标准中有很多品种采用热原检查，但热原检查易受试验动物个体差异，方法灵敏度、药物本身性质（某些药物如乳糖酸红霉素引起降温，青霉素往往也有类似作用，两性霉素B 可引起升温）等影响，使用受到一定限制；细菌内毒素法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，检测供试品中细菌内毒素的限量的方法，由于方法灵敏度高、准确、快速和经济等优点，已在各国药典中得到推广。

当然也仍有部分药物因为药物干扰等其他因素无法使用细菌内毒素检查法。

上述两种方法目前都是可行的内毒素物质检查方法，在实际应用过程中可以结合药物本身性质进行选择。

但在审评中发现，由于细菌内毒素检查法国内研究时间不长，导致部分注册申请人在药物研发时对细菌内毒素检查法的认识上存在一定偏差，本文希望通过对该方法的方法学和限值计算的相关介绍，使研发者增进对细菌内毒素检查法的认识，提高药物研发水平。

关于细菌内毒素的研究方法，中国药典2000年版纳入的细菌内毒素检查法为凝胶法（附录XI E），在细菌内毒素检查应用指导原则中（附录XIX F）提出了浊度法和显色基质法。

即将执行的中国药典2005年版将两部分进行了合并，并进行了修订，纳入了凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。

浊度法是测定凝胶形成过程中的浊度变化，可进一步细分为终点浊度法和动态浊度法，在做细菌内毒素定量测定时，检测波长一般为360nm。

显色基质法是测定特殊底物释放出来的生色团，也可分为终点显色法和动态显色法，定量测定的检测波长一般为405nm或545nm。

浅析细菌内毒素检测方法及常见问题

浅析细菌内毒素检测方法及常见问题

其他
酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、
封口膜、记号笔
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20
❖ 试剂
1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号 2、内毒素工作标准品 3、内毒素检查用水 4、75％乙醇
❖ 常用英文缩写
BET：细菌内毒素检查 BET水：细菌内毒素检查用水
MVD：供试品最大有效稀释倍数
NC：阴性对照
MVC：供试品最低有效浓度
（2 λ）
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0.25 EU/ml
（ λ）
0.125 0.0625 EU/ml EU/ml
（0.5 λ） （0.25 λ）
23
2、溶解鲎试剂：若鲎试剂为0.1ml装量，则取18支，每支加入 0.1mlBET水溶解；若鲎试剂装量大于0.1ml，则取若干支， 按标示量加入 BET水溶解，再取0.1ml分装于标准玻璃试管 （10mm×75mm），将试管按如下形状排列。
细菌内毒素广泛存在于自然界中。如自来水中 含内毒素的量为1至100EU/ml。
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❖主要特性（实验器材处理方法）
1.耐热性
一般在100℃加热1小时无影响，120℃加热4 小时能破坏98％，180－200℃干热2小时或 250℃干热半小时才能完全破坏。
故：注射剂的一般灭菌条件是不能破坏内毒素的。
❖ 成品检查——药品安全性检查之一
❖ 半成品（生产过程）检查——事前质控手段，避 免造成药品成批报废
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12
二、细菌内毒素检测方法
❖ 《中国药典》批准使用方法：
凝胶法
测定
浊度法
方法
光度测定法
显色基质法
❖ 供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。但当测 定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。

细菌内毒素检查相关问题

细菌内毒素检查相关问题

细菌内毒素检查相关问题细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题审评四部? 王彦厚摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。

关键词：细菌内毒素检查、方法、验证细菌内毒素检查法作为控制药品质量的一种有效方法，已经广泛的被世界各国药典收载。

经过30多年的不断改进，无论是凝胶法还是光度法均比较成熟和完善。

但是，在为新化合物或新药建立细菌内毒素检查方法时，常常会遇到各种各样的困难，尤其是尚处于新药研发早期阶段的药物，由于药物制剂、赋形剂等还不稳定，经常会发生变化，这样就给方法的建立带来不同程度的影响。

在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。

以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。

此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。

一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。

可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。

当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。

1、细菌内毒素限值的确定一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求？样品的内毒素含量具体是多少？这些问题不但关注用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。

尽管细菌内毒素检查方法的建立是一个科学方法的研究过程，但其最终目的还是要为控制药品质量服务。

因此，在方法建立时，不但要阐明限值的合理性，考虑技术可能达到的限值，同时还要满足相关药品管理法规的要求。

2008 无菌_微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析_国明

2008 无菌_微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析_国明

中国药品标准 2008年第 9卷第 1 Nhomakorabea 47以减少膜的吸附, 对于抑菌性较强的注射用无菌粉 末或固体原料, 一定要充分溶解、混合均匀。 114 加菌时机不一致
验证试验主要考虑滤器中残留抗菌物质对阳性 菌生长的影响, 应与对照滤器比较而作出判断, 所以 验证试验中加菌时机要与对照一致 [ 2] 。
115 薄膜过滤法滤膜材质选择不正确, 直接影 响试验结果
20 05年 版药 典执 行以 来药 品 生 产企 业 、科 研 单 位等 在药品质量标准建立及检验工作中困难和问题较多 的项目。我们在药品注册品种的审核检验中, 发现 有的申报单位对方法学验证的意义理解不够, 验证 试验的科学性、完整性及可操作性均存在着很多问 题。为尽快提高方法学验证水平, 更好地保证用药 的安全性, 现将方法学验证工作中常遇到的问题进 行分析、讨论。 1 无菌检查方法学验证问题及分析 111 验证菌株选择不正确 11111 敏感菌株与阳性对照菌不一致, 降低了阳性 对照菌的意义。有些药品选择了敏感菌株进行方法 学验证试验, 但是无菌检查时阳性对照菌不是验证 试验选定的敏感菌株。实际工作中抑制枯草芽孢杆 菌的样品很多, 可用此作为敏感菌株, 但药典规定无 菌检查时以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌, 使金 黄色葡萄球菌失去了阳性对照菌的意义。应在此类 无菌检查时也增加敏感菌株作为阳性对照菌。 11112 2005年版药典无菌检查中规定 / 抗革兰阴 性菌为主的供 试品以大肠埃希菌为对照菌 0, 但方 法学验证规定用菌株没有大肠埃希菌, 缺少了验证 此类药物抗菌作用的代表菌株。建议对抗菌作用中 明确具有抗革兰阴性菌的药品进行无菌检查方法学 验证时, 应增加大肠埃希菌作为验证菌株。 112 验证时取样量不符合要求 11211 无菌检验量与验证试验的取样量不同, 与中 国药典 2005年版方法学验证要求不符。进行供试 品检查时, 所采用的检验方法和检验条件应与验证 的方法相同, 应按照规定的检验数量和检验量取样。 11212 有的生产单位无菌检查方法学验证仅按抽 验产品检验数量进行验证, 药典规定应按照批出厂 产品最少检验数量进行试验 [ 1] 。 113 方法选择错误或不恰当, 不符合 2005 年版中 国药典要求 11311 有的申报单位无菌检查时无论什么药品都 用直接接种法。 2005年版中国药典规定, 只要供试 品性状允许, 应采用薄膜过滤法 [ 1] 。 11312 有些申报单位对非抑菌性供试品也用大量 的冲洗液冲洗, 如每次 100 mL, 10次 /膜, 既增加了 对膜的损伤和对微生物生物特性的破坏机会, 也增 加了检验繁琐性和检验人员的工作量。所以薄膜过 滤时尽 可能 减少 冲 洗量, 冲 洗 不一 定 为每 次 100 mL, 可少量多次, 并注意充分振摇。对于抑菌性较 强的供试品, 可以先用适宜的稀释液稀释后再过滤,

微生物限度和无菌检查方法验证中存在的主要问题探讨

微生物限度和无菌检查方法验证中存在的主要问题探讨

微生物限度和无菌检查方法验证中存在的主要问题探讨摘要：微生物限度和无菌检查是现阶段医药、食品领域必须要强调的内容，因为其对药物安全、食品安全是有重大影响的。

结合社会实践对目前微生物限度和无菌检查工作进行分析，讨论检查方法在利用的过程中存在的主要问题，并就问题的解决方式等做研究与分析，这对于更加专业的开展微生物限度和无菌检查工作有突出的现实意义。

文章对相关内容进行思考与讨论，旨在为目前社会实践提供指导。

关键词：微生物限度；无菌检查；检查方法；问题；对策食品和药品是人类在社会生活实践中离不开的生活必需品，食品安全、无害的食品或者是药品可以帮助人类塑造健康的体魄，但是如果药品和食品存在问题，那不仅达不到预期的目的，还会对身体造成损害，因此在食品、药品食用的过程中做好安全检测是非常必要的。

微生物限度以及无菌检查是食品、药品安全检查中必须要强调的内容，同时其也是评价食品、药品安全性的重要指标，因此在实践中为了更加客观的反映食品、药品的具体情况，需要做微生物限度与无菌检查。

具体的检查工作开展要采用科学的方法，因为方法的差异会导致结果评价差异，所以重视方法本身的科学性和规范性是非常重要的。

对当前社会实践中的检查方法利用做分析，并基于方法问题讨论检查工作开展的有效策略，这对于当前实践来讲是有显著意义的。

一、微生物限度和无菌检查方法存在的问题对现阶段微生物限度和无菌检查工作进行分析可知，在检查方法利用的过程中存在着非常显著的问题，具体表现在如下几个方面。

第一是检查方法的验证资料存在着缺乏的情况。

在实践中，药品品质控制所利用的一种重要手段是药品抽检，且该手段在药品打假和药品市场净化方面发挥着重要作用。

然而在目前的抽检工作中，不管是微生物限度检查还是无菌检验，均存在其验证资料缺乏的情况，因此监督抽检的部分药品是难以进行全检的[1]。

回顾药品抽检历史可知，在2006年抽检的1700批监督药品中，有469批在微生物限度检查中因为缺乏验证资料而无法对其进行全检，而在无菌检查中，同样存在185批因为验证资料缺乏而无法实施全检的药品，这种情况会导致一些假冒伪劣药品流入市场，其不仅会造成市场药品安全问题，还导致了抽样资源的巨大浪费。

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中国药品标准 2008年第 9卷第 1期 46
种比例的乙腈-甲醇-水为流动相, 结果均基本相同, 淫羊藿苷色谱峰和淫羊藿定 C 色谱峰完全重叠, 色 谱参数无显著的改变, 一般情况, 除峰宽较宽外, 对 称性 (拖尾因子 ) 、理论板数等系统适用性参数均较 好。另一方面, 紫外扫描结果表明, 淫羊霍苷和淫羊 霍足 C 的紫外吸收光谱基本一致, 这必然影响使用 二极管阵列检测器鉴别色谱峰纯度的准确性。这些 可能都是导致人们稍有不慎即不能发现淫羊藿苷色 谱峰和淫羊藿定 C 色谱峰完全重叠问题的原因所 在。
文献标识码: A
文章 编号: 1009- 3656( 2008) - 1- 46- 4
Analysis on Problem s of V alidation Test for S terility Test, M icrob ial lim itD eterm ination and Bacterial Endotoxins Test
[ 6] 洪怡, 肖卫红, 卢全德. 高效液相色谱法测定 肾康胶囊中淫羊 藿苷的含量. 中国医院药学杂志, 2006, 26 ( 4) : 495-4951
[ 7] 赵大成. 高效液 相色 谱法 测定 强阳保 肾丸 中淫 羊藿 苷的含 量. 医药导报, 2006, 25( 2 ) : 150-1511
目前无菌用过滤膜有普通膜、有机膜、低吸附膜 等, 有的申报单位对供试品及其溶剂的特性不加考 虑选择滤器, 造成滤膜被破坏, 实验失败。应根据供 试品及其溶剂的特性不同选择不同材质的滤膜, 保 证滤膜在过滤前后的完整性。试验时采用全封闭过 滤器要注意观察膜的状态。某些油性供试品或采用 蓖麻油等作为溶媒的供试品可以损伤普通滤膜。 2 微生物限度检查方法学验证问题及分析 211 验证菌株不完整 21111 微生物限度检查中细菌、霉菌和酵母菌的计 数方法的验证, 应该采用 5种试验菌, 有些申报单位 只对部分试验菌进行方法验证, 常见的是缺少对黑 曲霉菌的验证。 21112 中国药典 2005年版对控制菌增加了大肠菌 群检查和梭菌检查, 在对控制菌进行检查方法验证 时, 有些申报单位往往忽视了对上述内容的验证。 212 方法选择不正确 21211 不同的样品套用同一检验方法, 有些申报单 位为了使验证资料在审核时一次通过, 把所有品种 ( 无论有无抑菌活性 ) 均用薄膜过滤法处理, 甚至每 个品种的冲洗量都定为 1 000 mL, 既增加了实验过 程的复杂性、造成浪费, 又易于造成微生物生物活性 的破坏, 影响试验结果。不同的供试品、不同的验证 菌应通过验证找出适宜的检查方法, 按照由简到繁 的原则进行试验。 21212 不同的菌株套用同一检验方法。有些申报 单位在对不同的验证菌株进行试验时, 无论用常规 法回收率是否能达到 70% 以上, 均采用较复杂的方 法进行前处理, 增加了实验过程的复杂性。应对每 个验证菌进行分别的试验, 考察药品本身的抑菌特 性。 21213 方法描述不够详细, 没有可操作性, 如某药 品验证资料 / 将规 定量的 供试品 按薄膜 过滤 法过 滤, 冲洗, 在 最后一次冲洗液 中加入小于 100 CFU 的试验菌, 过滤。取出滤膜接种至 ,,中, 或将培养 基加至滤筒中 0。缺少供 试液配制、浓度、冲洗 液、
准确、可靠及检验方法的完整性。它在保证检验方 法的科学性和检验结果的准确性方面大大缩短了中 国药典与国外药典的差距, 是促使我国药品此类检 查方法更加合理、科学和严谨的重要途径, 同时也是
作者简介: 国明, 女, 副主任药师。学科及研究方向: 药检管理。联系电话: 0531- 81216529。
D rug Standards o f C hina 2008, vo l19 N o11
Guo M ing, Zhu Q ing- fen, Zheng L -i zhen( Shandong In stitu te for Drug C on trol, Jinan 250012)
各国药典中无菌、微生物限度和细菌内毒素检 查作为药品安全性控制的重要检测项目方法已日臻 完善, 但对此类检查开展方法学验证是 2005年版中 国药典新增内容, 验证的意义在于保证检验结果的
D rug Standards o f C hina 2008, vo l19 N o11
参考文献
[ 1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典. 北京: 化学工业出版 社, 2005 年版一部: 229( 羊藿 )、445( 壮骨伸筋胶囊 ) 、453( 安 神补脑液 ) 、470( 抗骨增生胶囊 ) 、501 ( 乳疾灵颗 ) 、574( 益气 养血口服液 )1
20 05年 版药 典执 行以 来药 品 生 产企 业 、科 研 单 位等 在药品质量标准建立及检验工作中困难和问题较多 的项目。我们在药品注册品种的审核检验中, 发现 有的申报单位对方法学验证的意义理解不够, 验证 试验的科学性、完整性及可操作性均存在着很多问 题。为尽快提高方法学验证水平, 更好地保证用药 的安全性, 现将方法学验证工作中常遇到的问题进 行分析、讨论。 1 无菌检查方法学验证问题及分析 111 验证菌株选择不正确 11111 敏感菌株与阳性对照菌不一致, 降低了阳性 对照菌的意义。有些药品选择了敏感菌株进行方法 学验证试验, 但是无菌检查时阳性对照菌不是验证 试验选定的敏感菌株。实际工作中抑制枯草芽孢杆 菌的样品很多, 可用此作为敏感菌株, 但药典规定无 菌检查时以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌, 使金 黄色葡萄球菌失去了阳性对照菌的意义。应在此类 无菌检查时也增加敏感菌株作为阳性对照菌。 11112 2005年版药典无菌检查中规定 / 抗革兰阴 性菌为主的供 试品以大肠埃希菌为对照菌 0, 但方 法学验证规定用菌株没有大肠埃希菌, 缺少了验证 此类药物抗菌作用的代表菌株。建议对抗菌作用中 明确具有抗革兰阴性菌的药品进行无菌检查方法学 验证时, 应增加大肠埃希菌作为验证菌株。 112 验证时取样量不符合要求 11211 无菌检验量与验证试验的取样量不同, 与中 国药典 2005年版方法学验证要求不符。进行供试 品检查时, 所采用的检验方法和检验条件应与验证 的方法相同, 应按照规定的检验数量和检验量取样。 11212 有的生产单位无菌检查方法学验证仅按抽 验产品检验数量进行验证, 药典规定应按照批出厂 产品最少检验数量进行试验 [ 1] 。 113 方法选择错误或不恰当, 不符合 2005 年版中 国药典要求 11311 有的申报单位无菌检查时无论什么药品都 用直接接种法。 2005年版中国药典规定, 只要供试 品性状允许, 应采用薄膜过滤法 [ 1] 。 11312 有些申报单位对非抑菌性供试品也用大量 的冲洗液冲洗, 如每次 100 mL, 10次 /膜, 既增加了 对膜的损伤和对微生物生物特性的破坏机会, 也增 加了检验繁琐性和检验人员的工作量。所以薄膜过 滤时尽 可能 减少 冲 洗量, 冲 洗 不一 定 为每 次 100 mL, 可少量多次, 并注意充分振摇。对于抑菌性较 强的供试品, 可以先用适宜的稀释液稀释后再过滤,
[ 2] 国家药品监督管理 局. 国家中 成药标 准汇编, 中成药 地方标 准上升 国家标 准部 分, 2002 年, 骨 伤科分 册: 278 ( 藤 黄健骨 丸 ) 、369( 仙灵骨葆 胶 囊 ) 、373 ( 仙 灵 骨葆 片 ) ; 内 科肾 系分 册: 321 (参茸强肾片 ) 1
[ 3] 中华人民共和国卫 生部药品 标准. 中 成药成 方制剂, 第十八 册: 71 ( 古汉养生精 ) 1
同样, 当以乙腈-水系统为流动相时, 无论其中 不含或含微量醋酸或磷酸、三乙胺, 或者应用它们的 梯度洗脱, 结果均基本相同, 色谱参数无明显改善。 313 根据我们的不完全统计, 在国家药品标准中, 多数品种以乙腈-水系统为流动相测定淫羊藿苷含 量 [ 1] , 但除壮骨伸筋胶囊 [ 1] 和藤黄健骨丸 [ 2] 外, 还 有仙灵骨葆胶囊 [ 2] 、仙灵骨葆片 [ 2 ] 、参茸强肾片 [ 2 ] 、 古汉养生精 [ 3] 等是以甲醇-水系统作为流动相测定 淫羊藿苷含量, 为严格控制产品质量, 建议修订所有 相关品种的含量测定方法。同时, 以甲醇-水系统作 为流动相测定药品制剂中淫羊藿苷含量的文献报道 还较多 [ 4-11 ] , 我们的研究结果提示, 在研究建立某一 指标的含量测定方法时, 应进行充分的方法学验证, 保证方法的专属性、准确性。
中国药品标准 2008年第 9卷第 1期 48
冲洗量及冲洗次数等重要试验信息, 无法确定其检 验方法。 213 供试液制备混乱
常见到有的申报单位试验时供试液稀释级别选 择错误, 甚至有的固体供 试品选用 10b浓度。 2005 年版药典要求验证过程中的供试液, 应取样品的最 低稀释级, 除原液外, 一般指 10- 1的稀释级别 ( 特殊 情况除外 ), 有 的申请单位误解了最低稀释级的含 义, 常将供试品配制成 10- 2、10- 3的浓度。 214 试验次数不足
有的申请单位验证过程仅提供了 1次试验的数 据, 或者将同一供试品溶液同时分别作 3份平行, 作 为 3次试验, 对于菌液组也仅提供了 1次试验的数 据, 无法保证验证试验的完整性。计数验证应进行 3次独立平行试验, 要求分别取样 3次, 菌液组也应 独立进行 3次平行试验, 并在 3次平行试验基础上 应分别计算每次试验菌的回收率, 分别对每次试验 结果进行判断。 215 对照组设置或操作错误 21511 微生物限度检查计数方法常见验证时缺少 稀释剂对照。某些供试品需要采取适当方法消除或 抑制供试品中抗菌活性, 在对供试液进行特殊处理 时, 既要考察供试品的抑菌活性, 又要考察供试液制 备过程中微生物受影响的程度, 因此要求增加稀释 剂对照组以判断供试液制备过程中是否对微生物造 成破坏。有的申报单位对供试液采取了消除抑菌作 用的特殊处理方法, 但未用稀释剂对照组进行对照, 使验证试验失去科学性及准确性。有的则在用常规 法进行检测时增加了稀释剂对照, 使试验过程复杂 化。 21512 稀释剂对照组实验方法与试验组不一致, 进 行稀释剂对照组的试验时, 有的单位采用稀释剂加 菌液注皿的常规培养方法。稀释剂对照组应与试验 组的处理方法一致, 如采用薄膜过滤法, 就应用相应 稀释液替代供试品, 加入试验菌, 按照试验组的供试 液制备方法, 薄膜过滤、冲洗, 培养。需要注意保持 冲洗量和冲洗方法与试验组供试液的方法一致。 21513 控制菌验证中阴性对照菌的问题, 有的阴性 对照菌的验证方法按照阴性对照菌的自身检查方法 进行, 失去了设置阴性对照组的意义。设立阴性对 照组, 是为了验证该控制菌检查方法的专属性, 阴性 对照组的增菌培养、检查等应与验证菌一致。如验 证沙门菌检查法时的阴性对照菌用 金黄色葡萄球 菌, 其增菌及检查过程应与沙门菌的一致。