酵母双杂交实验 教案

蛋白的酵母双杂交实验——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用第一部分 系统简介1. 实验原理蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。

很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。

这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。

目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4系统两种。

在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。

cDNA 文库或DNA 与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。

一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。

在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。

GAL4系统的原理如图所示：图一：酵母双杂交系统工作原理Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA2．系统特点同以往研究蛋白质—蛋白质之间相互作用的实验手段相比，双杂交系统具有其独特优势。

酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。

很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。

这两个结构域各具功能，互不影响。

但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。

不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。

基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。

如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。

通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。

酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。

(2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。

(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。

常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。

而菌株则具有相应的缺陷型。

双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。

这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。

根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。

后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。

二.所用的载体及相关信息1. pGBKT7载体的图谱和相关信息The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1).b. pGADT7载体的图谱和相关信息pGADT7-T encodes a fusion of the SV40 large T-antigen (a.a. 86–708) and the GAL4 AD (a.a. 768–881). The SV40 large T DNA (GenBank LocusSV4CG) was derived from a plasmid referenced in Li & Fields (1993) and was cloned into pGADT7 using the EcoR I and Xho I sites. pGADT7-T has not been sequenced.三．实验主要流程A.需要准备的药品和设备1.两种酵母菌种(AH109,Y187)2.酵母培养所需的药品: Yeast nitrogen base without amino acidsAgar (for plates only)sterile 10×Dropout Solution单缺-T,-L(clontech公司)二缺-T/-L (clontech公司)四缺-T/-L/-Ade/-His(clontech公司)3.酵母转化所需的药品: 10×TE buffer10×LiAc40%PEGcarrier DNA4.酵母显色所需要的药品: x- -GAL5.其他仪器设备: 30℃恒温培养箱30℃摇床.水浴锅分光光度计B．DNA-BD和DN-AD fusion protein 载体的分别构建。

酵母双杂交具体实验流程
酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid，Y2H）是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它基于酵母细胞内存在的转录激活子结合域（Transcription Activation Domain，TAD）和DNA结合域（DNA Binding Domain，DBD），通过融合特定的蛋白质序列并在酵母细
胞中共同表达，以实现筛选并鉴定蛋白质相互作用的目的。

酵母双杂交具体实验流程如下：
1.构建启动子驱动的酵母表达载体
该载体包含两部分：AD与DB，分别携带TAD和DBD结构域。

这些结构域可以具体化作为外源蛋白的两个互补部分，这样当它们相互结
合时，激活酵母内的报告基因（RLUC或LacZ）表达，并通过信号放
大器Cre的介入增强了信号。

2.构建融合基因的酵母表达载体
将想要研究的两种蛋白质的氨基酸序列分别连接到AD与DB的C端，形成融合蛋白质基因，然后将融合基因与启动子驱动的表达载体转化
入双杂交酵母细胞。

3.获得蛋白质相互作用的筛选和确认
通过对酵母双杂交转化后的细胞进行筛选，并通过对表达的信号进行观察和测量，得到蛋白质相互作用的筛选结果。

4.确定筛选结果的真实性
在确定特定蛋白质相互作用是否真实的过程中，通常会进行一些补充实验。

例如，可以通过分析生化反应，并利用免疫共沉淀等方法验证筛选结果的可靠性。

总的来说，酵母双杂交是一种常用的蛋白质相互作用分析方法，它可以快速、可靠地鉴定蛋白质相互作用，从而帮助研究者更深入地探究蛋白质的功能和作用机制。

酵母双杂交（Yeast Two-Hybrid）一、实验目的掌握酵母双杂交原理和方法。

二、实验原理酵母双杂交系统的原理是利用转录激活因子在结构上是组件式的，即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成，其中有DNA结合结构域（DNA binding domain, DB）和转录激活结构域（activation domain, AD），它们是转录激活因子发挥功能所必需的。

单独的DB虽然能和启动子结合，但是不能激活转录。

而不同转录激活因子的DB和AD形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。

根据转录因子的这一特性，将BD 与已知的诱饵蛋白质X 融合，构建出BD-X质粒载体；将AD 基因与cDNA 文库，基因片段或基因突变体（以Y表）融合，构建AD-Y质粒载体。

两个穿梭质粒载体共转化至酵母体内表达。

蛋白质X 和Y的相互作用导致了BD与AD在空间上的接近，从而激活UAS 下游启动子调节的酵母菌株特定报告基因（如ADE2，HIS3，MEL1或 LacZ）等的表达，使转化体由于HIS3 或LEU2 表达，而可在特定的缺陷培养基上生长，同时因LacZ 表达而在X-Gal 存在下显蓝色。

图 1-1 酵母双杂交基本原理酵母双杂交系统在发展中增添了接合型酵母双杂交和反向酵母双杂交系统。

其中接合型双杂交系统就是已预先将文库转化了某个接合型的单倍体酵母，然后再和转化了诱饵质粒的相反接合型的单倍体进行接合，形成二倍体，并检测报告基因的表达。

酵母双杂交系统由三个部分组成：(1)与DBD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。

(2)与AD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称靶蛋白(prey)。

(3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。

常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。

而菌株则具有相应的缺陷型。

双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。

这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。

酵母双杂交系统常应用在：(1)研究两个已知蛋白是否存在相互作用，同一蛋白是否有自身相互作用以及相互作用的分子区域。

酵母双杂交实验报告一、实验目的酵母双杂交技术是一种用于研究蛋白质之间相互作用的分子生物学方法。

本次实验的目的是通过构建酵母双杂交载体，转化酵母细胞，筛选出与目标蛋白相互作用的蛋白质，从而深入了解蛋白质在细胞内的功能和调控机制。

二、实验原理酵母双杂交系统基于真核转录调控因子的结构和功能特点。

转录调控因子通常由两个结构域组成：DNA 结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）。

这两个结构域单独存在时不能激活转录，但当它们在空间上足够靠近时，则能够协同作用，激活报告基因的表达。

在酵母双杂交系统中，将编码目标蛋白（“诱饵”蛋白）的基因与BD 构建融合表达载体，将待检测的蛋白（“猎物”蛋白）的基因与 AD 构建融合表达载体。

如果“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白相互作用，那么 BD 和 AD 就能够在空间上靠近，从而激活报告基因的表达。

通过检测报告基因的表达情况，就可以判断“猎物”蛋白与“诱饵”蛋白是否存在相互作用。

三、实验材料与试剂1、菌株与载体酵母菌株：AH109载体：pGBKT7（含 BD 序列）、pGADT7（含 AD 序列）2、工具酶与试剂盒限制性内切酶：EcoRI、BamHI 等T4 DNA 连接酶质粒提取试剂盒PCR 试剂盒3、培养基YPD 培养基SD 缺失培养基（Leu、Trp、His、Ade 等）4、试剂氨苄青霉素卡那霉素XαGal3-AT（3-氨基-1,2,4-三唑）5、实验仪器恒温培养箱离心机PCR 仪电泳仪凝胶成像系统四、实验步骤1、目的基因的扩增通过 PCR 技术从 cDNA 文库或基因组 DNA 中扩增出目标蛋白和待检测蛋白的编码基因。

设计合适的引物，在引物的 5'端引入限制性内切酶的酶切位点。

2、载体的构建分别用限制性内切酶对目的基因和载体进行双酶切，然后通过 T4 DNA 连接酶将目的基因连接到载体上。

将连接产物转化到大肠杆菌感受态细胞中，筛选出阳性克隆，提取质粒进行酶切鉴定和测序验证。

酵母双杂交实验设计
1.实验目的：
本实验旨在研究不同基因型酵母的双杂交反应，以探索酵母双杂交的机制。

2.实验材料：
（1）酵母菌：不同基因型的酵母菌；
（2）培养基：YPD培养基；
（3）实验设备：培养箱、显微镜、离心机、超声波消毒器、混合器等。

3.实验步骤：
（1）将不同基因型的酵母菌分别放入YPD培养基中，在培养箱中培养，直到藻体膨大为止；
（2）将培养基中的酵母菌放入离心机中，进行离心，分离出酵母菌藻体；
（3）将分离出的酵母藻体放入超声波消毒器中，进行消毒；
（4）将消毒后的酵母藻体放入混合器中，混合后，放入YPD 培养基中，再放入培养箱中，培养；
（5）在培养过程中，定期使用显微镜观察培养基中的变化，以观察双杂交反应的情况。

4.实验结果：
通过实验，可以获得不同基因型酵母双杂交反应的结果，从而探索酵母双杂交的机制。

酵母双杂交（筛库）pGBK-gene 转化酵母1.酵母细胞（AH109）划线，YPDA平板，30°C烘箱培养18-20小时。

2.挑取单细胞菌落，在YPDA培养基中，30°C摇床培养18-20小时至菌液饱和。

3.次日，取饱和的酵母培养液5ml转接至100mlYPDA培养基中，30°C摇床培养2h，测定OD600，直至OD600达到0.5左右。

4.（超净台下工作，下同）将上述菌液分装在2只50ml离心管（灭菌）中，室温下3000rpm离心5min。

5.弃上清，重悬于20ml无菌水中，3000rpm离心5min。

6.弃上清，重悬于10ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。

7.弃上清，重悬于500μl 1×TE/LiAc溶液中，室温温育10min。

8.取eppendorf管，每管加100μl酵母细胞、5μl鲑鱼精DNA（10mg/ml，用之前沸水煮2-3min，立即放冰上）、15μl DNA（pGBK连接的基因）。

9.加入280μl PEG/LiAc 溶液，30°C放置45min（可摇）。

10.42°C热激10min，立即放冰上2min。

11.室温下6000-8000rpm离心20~30s，去上清。

12.重悬于500μl无菌水中，取100-200μl涂在SD-trp板上，30°C烘箱培养48-72h。

酵母大规模转化AD文库1.挑取上述SD-trp板上的pGBK连的基因转化子，YPDA培养基中培养至饱和。

2.将上述转化子转接至200mlYPDA培养基中，30°C培养至OD600 0.5-0.6左右。

3.离心收集菌体，20ml无菌水洗涤，3000rpm离心5min。

4.去上清，重悬于20ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。

5.去上清，合并菌体于一管，1ml TE/LiAc溶液悬浮菌体。

LexA酵母双杂交系统简介一、LexA酵母双杂交系统的设计原理报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。

质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。

质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。

在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。

根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。

分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。

如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。

二、商品化酵母双杂交系统的组成1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株）3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8株4. 对照质粒：质粒用途pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒5. 引物：pLexA测序引物及pB42AD测序引物。

酵母双杂交相关实验方法一、酵母总DNA的提取方法（蜗牛酶法）1、酵母质粒提取试剂Buffer I 0.9 mol/L Sorbitol0.1mol/L EDTABuffer II 50mM/L Tris20mM/L EDTABuffer III 10mM/L Tris1Mm/L EDTA2、操作步骤：(1)收集新鲜菌体重加入150μl buffer I，25μl 蜗牛酶（30mg/ml）。

.(2)37℃水浴1h。

(3)10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μl buffer II。

(4)加入25μl 10% SDS，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一次。

(5)加入25μl 5mol/L 醋酸钾，冰浴60min。

(6)4℃12000rpm离心15min，取上清。

(7)在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀静置于-20℃，1小时以上。

(8)取出，4℃12000rpm离心15min ，弃上清。

(9)加入150μl buffer III 溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提。

(10)12000rpm离心15min。

(11)将上清转入新的离心管中，加入6μl(10U/μl)RNA酶37℃放置30min。

(12)取上清，加入等体积的异丙醇。

(13)4℃静置10min，1小时以上或过夜。

(14)4℃10000rpm 离心5min。

(15)弃上清，并把沉淀溶于10μl buffer III 中。

二、小规模酵母转化1、酵母转化试剂：转化用试剂除PEG采用过滤灭菌外，其它试剂均需高温高压灭菌，条件同普通培养基灭菌。

(1)M 醋酸锂（Lithium Acetate）(2)聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）分子量3350，浓度50%（w/v）(3)PEG/LiAc 溶液的配制（现用现配）800μl 50%PEG100μl 10×TE100μl 10×LiAc1ml 总体积(4) 1.1×TE/LiAc溶液（现用现配）11ml 10×TE(5)11ml 10×LiAc(6)78ml ddH202、操作步骤：(1)第一天下午3点将酵母接种于5ml YPDA中，30℃摇菌。