水稻_9311_突变体筛选和突变体库构建

一种筛选水稻Mutmap+突变位点的简易方法王延妍;李颖颖;王子瑞;毛馨晨;唐家琪;于恒秀;张超【期刊名称】《扬州大学学报（农业与生命科学版）》【年(卷),期】2024(45)1【摘要】利用基因组重测序技术进行基因定位目前已在水稻功能基因组学研究中得到广泛应用。

其中,Mutmap+技术因无需进行杂交操作,且无需背景亲本的基因组信息,具有更广阔的应用前景。

然而,目前Mutmap+技术筛选候选突变位点的方法依赖于复杂的数据计算,要求研究者具有较高的生物信息学知识。

根据Mutmap+的实验原理,设计一种简单的筛选候选突变位点的方法。

该方法对混池测序的表型池与非表型池的突变指数分别加以限定,即表型池突变指数等于1,非表型池突变指数小于0.5。

对测序所得突变位点进行简单排序,即可得到候选突变位点。

运用该筛选方法,从6个水稻不育突变体成功克隆突变基因,并对其中1个突变体进行了细胞学表型的验证。

该方法可简化Mutmap+技术的数据分析流程,便于将Mutmap+技术更好地运用到水稻功能基因组学研究中。

【总页数】6页(P27-32)【作者】王延妍;李颖颖;王子瑞;毛馨晨;唐家琪;于恒秀;张超【作者单位】扬州大学农学院/江苏省作物基因组学和分子育种重点实验室/植物功能基因组学教育部重点实验室【正文语种】中文【中图分类】S511【相关文献】1.一种改进的简单快速的多位点突变方法2.LSSP－PCR—筛选基因突变的简易方法3.水洗城市生活垃圾焚烧飞灰作为水泥混合材的试验研究4.浅谈土建施工中深基坑支护施工技术的运用研究5.一种构建HBV聚合酶特定位点多种突变的方法因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

1文献综述1.1水稻基因组学研究现状1.1.2 水稻全基因组测序水稻(Oryza sativa L.)是世界上最主要的粮食作物之一，全世界有一半的人口食用它，水稻年总产量占世界粮食作物产量第三位，维持较多人口的生活。

亚洲是世界水稻主产区，近年稻米产量占世界的90%以上，中国稻米年产量占亚洲的38%。

大米作为我国主要粮食种类，在养活我国13亿人口和改善我国居民营养结构中具有举足轻重的影响。

同时，水稻又以其基因组相对较小(～430Mbp)，高效的遗传转化体系，与玉米、大麦和小麦等其它禾本科作物在基因组上存在明显的共线性，而成为研究单子叶植物的模式植物。

国际水稻基因组计划(IRGSP)启动于1998年，以粳稻品种(japonica)日本晴(Nipponbare)为模式材料，由中国、日本、美国等是十个国家参与，所采用的方法为逐步克隆策略(clone by clone sequencing)，随后在2002年由日本和中国科学家率先公布了第1、4染色体的精确序列(Feng et al., 2002; Sasaki et al., 2002; Consortium 2003)；2003年9月第10条染色体的全长序列由美国Clemson大学公布(Rice Chromosome 10 Sequencing Consortium, 2003)。

2005年8月水稻全基因组精确序列在Nature发表(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。

IRGSP公布的水稻“日本晴”精确序列经过分析表明：(1) 水稻“日本晴”基因组大小为389Mb，IRGSP公布的序列能够覆盖其全基因组的95%，并包含了所有的常染色质和两个完整的着丝粒；(2) 整个基因组中包含大约37544个非转座相关基因，其中71%的基因可能在拟南芥中有同源基因；(3)通过与拟南芥基因组序列对比分析发现，拟南芥90%的基因在水稻中可能存在同源物；(4) 水稻中预测的37544个基因中，29%是属于成簇的基因家族；(5) 水稻基因组中转座元件的数目和种类与玉米和高粱基因组共线性区段的扩张是一致的；(6) 有证据证明基因能从细胞器中转移到细胞核(International Rice Genome Sequencing Project, 2005)。

突变体库技术的应用和前景随着科技的不断发展，越来越多的新技术涌现出来，其中突变体库技术就是一种在生命科学领域中使用广泛的技术。

突变体库技术被广泛应用于药物研发、基因工程等领域，为人类健康和生命科学研究带来了积极的影响，并有着广阔的前景。

1.突变体库技术的简介突变体库是指在诸如细菌、酵母等微生物中，利用突变和筛选技术构建的一种含有变异蛋白的DNA或RNA的库。

在库中，存在着各种突变的蛋白，可以通过筛选得到合适的蛋白进行后续的实验或研究。

突变体库技术通过对蛋白的突变实现对其结构和功能的改变，为药物发现和基因工程等领域提供了有力的工具。

2.突变体库技术在药物研发中的应用突变体库技术在药物研发中扮演着重要的角色，其中最具代表性的就是抗体药物的研发。

抗体药物是一种基于人工合成的抗体，其具有高度的特异性和亲和性，从而使疾病治疗更加有效。

突变体库技术可以用来获得具有某种特定性质的抗体。

例如，在肿瘤治疗领域，可以利用突变体库技术获得特异性更强的抗体，以达到更好的治疗效果。

3.突变体库技术在基因工程中的应用突变体库技术在基因工程中也有着广泛的应用。

例如，可以利用突变体库技术实现蛋白的稳定性改变或功能增强，从而提高其在应用中的效果。

此外，通过构建反义RNA突变体库，可以对某些基因进行削减或靶向调控，从而在基因治疗等领域具有重要的应用价值。

4.突变体库技术的前景随着生命科学和医学领域的不断发展，突变体库技术的前景也变得十分广阔。

未来，突变体库技术还将不断推进进化，开拓出许多新的应用领域，并在药物研发、基因工程等领域中扮演着愈发重要的角色。

随着科技的不断进步，突变体库技术将会在未来的生命科学领域中发挥更为重要的作用。

总的来说，突变体库技术具有广泛的应用和前景，是生命科学领域中的一项重要技术。

突变体库技术不仅可以用来发现新药物，还可以优化蛋白的结构和性能，以满足生物学和医学研究需求。

未来，随着技术的不断发展，突变体库技术也将在更多的领域得到应用，为人类的健康和生命科学研究带来积极的影响。

创制植物突变体库的方法一、传统诱变方法1.1化学诱变化学诱变是创制植物突变体库的一种常用方法。

咱们都知道，化学物质就像一把双刃剑。

像甲基磺酸乙酯（EMS）这种化学诱变剂，它可以悄悄潜入植物的细胞，对植物的DNA分子搞点“小动作”。

它会和DNA碱基发生反应，使得碱基发生改变，就像给DNA的密码本上乱涂乱画了几笔。

这样一来，植物的基因就发生突变了。

这就好比一个精密的机器，里面的一个小零件被悄悄换了或者改造了，整个机器的运行就可能出现新的情况。

但是呢，使用化学诱变剂得小心翼翼，就像走钢丝一样，剂量控制不好就可能把植物弄得“病恹恹”的，甚至直接一命呜呼了。

1.2物理诱变物理诱变也是很有一套的。

比如说辐射诱变，γ射线就像一群无形的小炮弹，向植物细胞发起攻击。

它能量高，能够直接把植物的DNA链打断。

这就好比把一根绳子给切断了，植物细胞就得赶紧想办法把这断开的“绳子”重新连接起来。

在这个过程中，就很容易出现连接错误，这就产生了突变。

还有紫外线诱变，紫外线就像一个调皮的小精灵，它的能量虽然没有γ射线那么高，但也足以让DNA分子中的碱基之间的化学键发生变化，导致碱基配对出现错乱，这就像火车轨道接错了一样，火车就没法正常行驶了，植物的基因表达也就乱了套，从而产生突变体。

二、现代生物技术诱变2.1基因编辑技术现在的基因编辑技术那可是相当厉害。

就拿CRISPR Cas9系统来说，这简直就是基因编辑领域的“神器”。

它就像一把精准的手术刀，能够在植物基因组的特定位置进行切割。

这个系统里的Cas9蛋白就像一个聪明的小工匠，它能在向导RNA的引导下，准确地找到目标DNA序列，然后“咔嚓”一下把DNA链切断。

植物细胞为了修复这个断裂，就可能引入一些错误，这样就实现了基因的突变。

这就好比一个雕刻师，本来想在一块木头上雕刻出一个精美的图案，结果一不小心多削了一块或者少削了一块，就创造出了一个和原来不一样的造型。

2.2插入突变插入突变也是一种办法。

水稻叶尖枯突变体wlt1的遗传分析与基因定位的开题报告一、选题背景水稻是全世界重要的粮食作物之一，其产量与品质对全球粮食安全具有重要意义，而水稻的叶尖枯（WLT）现象是影响水稻产量和质量的重要病害之一。

WLT的症状为水稻叶片尖端出现枯萎、黄化、卷曲、断裂等现象，这些症状会直接影响水稻叶片的光合作用，从而导致产量下降。

因此，WLT的研究对水稻的生产具有重要意义。

目前，已有一些关于WLT的研究，但其遗传机理尚未完全解析。

因此，需要从遗传学角度对WLT进行研究，以进一步揭示其发生的分子机制。

本研究旨在通过遗传分析与基因定位对WLT突变体的基因进行研究，为揭示WLT的遗传机理提供理论基础。

二、研究目的本研究旨在通过遗传分析与基因定位，对水稻叶尖枯WLT1突变体进行遗传学分析，并在水稻染色体上定位相关基因，为进一步揭示WLT的分子机制、提高水稻产量和质量提供理论依据。

三、研究方法1. 遗传分析：利用常规的遗传学方法，通过杂交培育F2代种子，并统计各表型特征的频率，筛选出与WLT1相关的表型特征。

2. 基因定位：利用已有的分子标记构建一个遗传连锁图，利用F2代产生的后代进行基因定位。

通过PCR技术对各个F2代个体进行多个分子标记的PCR反应，得到产物后进行电泳分离，记录各个分子标记的基因型，统计各基因标记与WLT1的连锁率和重组频率，最终得到WLT1的基因位置。

四、研究意义本研究将揭示WLT1基因在水稻生长发育过程中的作用机制，对水稻产量和质量的提高具有重要意义，为水稻病害的防治提供理论依据。

此外，该研究还将丰富水稻遗传学研究领域，为今后的水稻杂交育种研究提供新思路。

中国水稻科学(Chin J Rice Sci), 2022, 36(6): 562－571 562 DOI: 10.16819/j.1001-7216.2022.20220316 OsNramp5基因变异影响水稻重要农艺性状的研究进展李小秀1吕启明1, 2袁定阳1, 2, *(1湖南大学研究生院隆平分院, 长沙 410125; 2湖南杂交水稻研究中心/杂交水稻国家重点实验室, 长沙 410125; *通信联系人, email: *********************.cn)Research Progress on the Effects of OsNramp5 Mutation on Important Agronomic Traits in RiceLI Xiaoxiu1, LÜ Qiming1, 2, YUAN Dingyang1, 2, *(1 Longping Branch of Graduate School, Hunan University, Changsha 410125,China; 2Hunan Hybrid Rice Research Center / State Key Laboratory of Hybrid Rice, Changsha 410125, China; *Correspondingauthor,email:*********************.cn)Abstract: Developing low-cadmium (Cd) rice cultivars is the most economical and effective way to solve the problem of “Cadmium Rice”. Previous studies have shown that OsNramp5 is the major transport gene for Cd uptake in rice. The functional deficiency of OsNramp5 leads to a significant decrease in the content of Cd in rice grains, and the uptake of manganese (Mn) is also affected. However, in previous studies on the effect of OsNramp5 variation on rice growth and development, the conclusions were inconsistent. The systematic understanding of the effects of OsNramp5 mutation on important agronomic traits in rice will promote the development of new rice cultivars with low-Cd and high-quality. This manuscript focuses on the effects of OsNramp5 mutation on the content of metal ions, growth and development, yield and quality of rice, so as to provide scientific guidance for the breeding of new rice cultivars with low Cd accumulation by OsNramp5 mutation.Key words: rice; OsNramp5; cadmium; manganese; agronomic trait摘要：筛选和培育镉(Cd)低积累水稻品种是解决稻米镉污染问题最经济、有效的办法。

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910379866.0(22)申请日 2019.05.08(71)申请人 中国科学院植物研究所地址 100093 北京市海淀区香山南辛村20号(72)发明人 漆小泉　张英春　冯来宝　池旭　(74)专利代理机构 北京纪凯知识产权代理有限公司 11245代理人 魏少伟(51)Int.Cl.C12Q 1/6895(2018.01)C12Q 1/686(2018.01)C12N 15/11(2006.01)(54)发明名称一种筛选水稻突变体的方法(57)摘要本发明公开了一种筛选水稻突变体的方法。

本发明公开的筛选水稻突变体的方法包括：利用多重PCR富集待测水稻中的目标DNA片段，得到富集的目标DNA片段；对富集的目标DNA片段测序，得到待测水稻目标DNA片段序列；比较待测水稻目标DNA片段序列与野生型水稻目标DNA片段的序列，确定待测水稻目标DNA片段是否发生突变，以确定待测水稻是否为突变体。

实验证明，利用本发明的方法可成功检测目标DNA片段是否发生突变，进一步可用于筛选突变体。

权利要求书3页 说明书43页序列表1页 附图7页CN 110218811 A 2019.09.10C N 110218811A权　利　要　求　书1/3页CN 110218811 A1.鉴定生物目标DNA片段突变的方法，包括：1)利用多重PCR富集待测生物中的目标DNA片段，得到富集的目标DNA片段；所述利用多重PCR富集待测生物中的目标DNA片段包括利用多重PCR方法扩增得到目标DNA片段，实现目标DNA片段的富集；所述多重PCR方法，包括：利用成套引物对目标DNA片段进行PCR扩增，得到PCR产物，将该PCR产物记为PCR产物1；所述成套引物满足如下a1)、a2)和a3)：a1)所述成套引物由n个引物对组成，n为大于等于2的自然数；a2)所述成套引物中的每个引物对的因素J小于50％，所述因素J为引物对的反向引物与所述成套引物的其它引物形成引物二聚体的个数占所述成套引物中引物个数的百分比；a3)所述成套引物中的每个引物对的9个因素中至多一个因素不在标准范围内；所述9个因素为因素A、B、C、D、E、F、G、H和I；所述因素A为引物对的反向引物的GC含量；所述因素B为引物对的反向引物的TM值，所述因素C为目标片段的GC含量；所述因素D为从目标片段上游400bp处至该目标片段下游400bp处间的DNA片段的GC含量；所述因素E为目标片段的结构自由能；所述因素F为目标片段及目标片段下游150bp的连续DNA片段的结构自由能；所述因素G为目标片段及目标片段上游150bp的连续DNA片段的结构自由能；所述因素H为引物对的正向引物3’末端5个核苷酸的结构自由能；所述因素I为引物对的反向引物与所述成套引物的其它引物中部连续大于等于5个核苷酸所形成的多个双链DNA的TM值总和；所述9个因素的标准范围如下：35％≤所述因素A≤60％；68℃≤所述因素B≤79℃；30％≤所述因素C≤70％；30％≤所述因素D≤70％；15kcal/mol≤所述因素E的绝对值≤70kcal/mol；所述因素F的绝对值＜100kcal/mol；所述因素G的绝对值＜100kcal/mol；4kcal/mol≤所述因素H的绝对值≤10kcal/mol；所述因素I＜100℃；2)对所述富集的目标DNA片段测序，得到待测生物目标DNA片段序列；3)比较所述待测生物目标DNA片段序列与野生型生物所述目标DNA片段的序列，确定所述待测生物目标DNA片段是否发生突变：所述待测生物目标DNA片段序列与野生型生物所述目标DNA片段的序列相同，所述待测生物目标DNA片段未发生或候选未发生突变；所述待测生物目标DNA片段序列与野生型生物所述目标DNA片段的序列不同，所述待测生物目标DNA 片段发生或候选发生突变。

中国水稻科学(Chin J Rice Sci), 2024, 38(2): 140－149 140 DOI: 10.16819/j.1001-7216.2024.230502水稻D1基因新等位突变体的鉴定与功能分析高郡茹权弘羽袁刘珍李钦颖乔磊李文强*（西北农林科技大学生命科学学院, 陕西杨凌 712100；*通信联系人,email:***************.cn）Map-based Cloning and Functional Analysis of a New Allele of D1, a Gene ControllingPlant Height in Rice (Oryza sativa L.)GAO Junru, QUAN Hongyu, YUAN Liuzhen, LI Qinying, QIAO Lei, LI Wenqiang*(College of Life Sciences, Northwest A&F University, Yangling 712100, China; * Correspondingauthor,email:***************.cn)Abstract:【Objective】Plant height is an important agronomic trait in rice breeding. Identification of genes controllingplant height and their functional characterization can provide useful genetic resources for high-yield breeding.【Methods】A dwarf mutant, d1-11, was screened from the rice variety Nipponbare by EMS mutagenesis. Phenotypicand cytological observations, gene expression, hormone content and drought resistance were analyzed. The d1-11mutant gene was identified through map-based cloning.【Results】The d1-11 mutant exhibits dwarfism, with moreshortened and widened leaves, and more rounded grains compared to the wild type. The d1-11 mutant leaf has asmaller midvein, reduced number and area of large and small veins, resulting in abnormal leaf morphology in thed1-11 mutant. The d1-11 gene is genetically mapped between two molecular markers on rice chromosome 5.Map-based cloning reveals that a single base substitution at the junction of the ninth exon-intron in the D1 gene resultsin the loss-of-function mutation of d1-11. The D1 gene has a higher expression level in various tissues at the seedlingstage, but the expression levels decrease from the tillering stage. Exogenous abscisic acid (ABA) treatment for 24hours induces D1 gene expression, exogenous gibberellin (GA) treatment inhibits D1 gene expression, and salt stresstreatment for 24 hours can strongly induce D1 gene expression. The contents of several hormones such as GA,brassinosteroid (BR), and indole-3-acetic acid (IAA) were increased in the d1-11 mutant. The d1-11 mutant shows asignificant increase in relative water content (RWC) and a reduced rate of water loss in leaves. Furthermore, d1-11mutant plants exhibit stronger resistance to drought stress.【Conclusion】The d1-11, a novel allele in D1 locus wasidentified in the present study. It was showed that the d1-11 mutant had increased levels of various endogenoushormones, increased leaf water content, and enhanced resistance to drought stress. This study will further enrich thegenetic resources related to dwarfism and reveals some new biological roles of the D1 gene in rice.Key words: plant height; dwarfism; D1 gene; d1-11 mutant; plant hormones; drought stress摘要：【目的】株高是作物重要的农艺性状，挖掘株高控制基因并解析其分子功能，可为作物高产育种提供更多有用的基因资源。

水稻晚开花突变体lft1的鉴定与基因克隆许乐峰;许昕阳;张欢;赵志刚;郑天慧;赵婕妤;曾召琼;刘喜;陈赛华;万建民【期刊名称】《南京农业大学学报》【年(卷),期】2018(41)1【摘要】[目的]通过对水稻晚开花突变体lft1(late flowering time)的鉴定及基因定位,解析水稻响应光周期调控开花的分子机制。

[方法]从‘日本晴’T-DNA插入突变体库中筛选得到一个在长日照下晚开花的突变体lft1。

调查了lft1/日本晴F_2分离群体的开花期表型,分析晚开花表型与T-DNA插入之间的相关性。

比较日本晴/9311 F_2群体和lft1/9311 F_2群体的开花期分布,选取群体中具有突变效应的极端晚开花单株进行基因定位。

比较突变体lft1和野生型‘日本晴’中已知开花期基因的表达水平,分析基因在调控网络中的作用。

[结果]相比于野生型‘日本晴’,突变体lft1在长日照条件下晚开花20 d,粒长和千粒质量均显著增加。

对lft1/日本晴F_2群体调查发现,晚开花性状由1对隐性基因控制,且与T-DNA插入呈现非共分离。

相比于对照日本晴/9311 F_2群体,在lft1/9311 F_2群体中出现了极端晚开花的个体,从中选取了58株极端个体用于基因的初定位。

利用‘日本晴’和‘9311’之间的多态性分子标记对极端晚开花个体进行了图位克隆,将基因限定在第9染色体短臂上,分子标记RM219与RM3912之间,物理距离为2.94 Mb的范围内。

在开发标记的过程中,发现分子标记SJ9-32能够在‘日本晴’和‘9311’中实现扩增,但是在lft1及其后代的极端个体中均不能有效扩增。

通过进一步设计标记,我们最终验证了在lft1中存在DNA片段的缺失,该缺失区段覆盖了SDG724基因。

等位性测验进一步证实lft1的晚开花表型是由于SDG724基因的缺失而引起的。

q RT-PCR结果表明,SDG724可以调节Os MADS51和RFT1的表达水平。

构建定向进化突变体库的方法
构建定向进化突变体库的方法主要有以下几种：
1. 位点突变：这是最常用的构建定向进化突变体库的方法，它使用特定的基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）在基因上进行精确的位点突变，以改变基因的功能。

2. 插入突变：这是一种构建定向进化突变体库的方法，它使用特定的基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）在基因上进行插入突变，以改变基因的功能。

3. 基因重组：这是一种构建定向进化突变体库的方法，它使用特定的基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）在基因上进行基因重组，以改变基因的功能。

4. 杂合子突变：这是一种构建定向进化突变体库的方法，它使用特定的基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）在基因上进行杂合子突变，以改变基因的功能。

5. 杂合突变：这是一种构建定向进化突变体库的方法，它使用特定的基因编辑技术（如CRISPR/Cas9）在基因上进行杂合突变，以改变基因的功能。