烟叶游离氨基酸的测定氨基酸分析仪法（YC/T 282—2009）
日期：2009/6/2 10:39:18 作者：来源：
烟叶游离氨基酸的测定氨基酸分析仪法（YC/T 282—2009）由国家烟草专卖局于2009年3月30日批准发布，自2009年5月1日起实施。
前言
本标准的附录Ａ、附录B、附录C为资料性附录。
本标准由国家烟草专卖局提出。
本标准由全国烟草标准化技术委员会卷烟分技术委员会（TC144/SC1）归口。
本标准起草单位：湖北中烟工业有限责任公司、中国烟草总公司郑州烟草研究院。
本标准主要起草人：王娟、李丹、刘建锋、马舒翼、宋旭艳、郭国宁、刘克建。
烟叶游离氨基酸的测定氨基酸分析仪法
1 范围
本标准规定了烟叶中游离氨基酸的氨基酸分析仪测定方法。
本标准适用于烟叶中天冬氨酸（Asp）、苏氨酸（Thr）、丝氨酸（Ser）、天冬酰胺（Asn）、谷氨酸（Glu）、脯氨酸（Pro）、甘氨酸（Gly）、丙氨酸（Ala）、缬氨酸（Val）、胱氨酸（Cys）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、β-丙氨酸（β-Ala）、β-氨基异丁酸（β-Aia）、γ-氨基丁酸（γ-Aba）、赖氨酸（Lys）、组氨酸（His）、色氨酸（Trp）、精氨酸（Arg）等21种游离氨基酸的测定。
2 规范性引用文件
下列文件中的条款通过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日期的引用文件，其随后所有的修改单（不包括勘误的内容）或修订版均不适用于本标准，然而，鼓励根据本标准达成协议的各方研究使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本适用于本标准。
YC/T 31-1996 烟草及烟草制品试样的制备和水分测定烘箱法
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本标准。
3.1
烟叶中游离氨基酸 dissociated amino acid（free amino acid）in tobacco leaf 烟叶的盐酸浸出物中，以游离状态存在、未结合在蛋白质分子中的氨基酸。
4 原理
氨基酸为两性电解质，在酸性环境下形成阳离子。烟叶中的游离氨基酸经酸溶液萃取后，经氨基酸分析仪的磺酸型锂离子交换柱分离，然后与茚三酮混合，通过加热反应，伯胺与之生成蓝紫色化合物，仲胺与之生成黄色化合物。两种衍生物使用波长分别为570 nm和440 nm的双通道紫外检测器同时进行定性定量分析测定（氨基酸分析仪管路图参见附录A）。
5 试剂
除特别要求以外，本标准所使用的试剂均为分析纯试剂，水为去离子水。
5.1盐酸溶液，0.005 mol/L。
准确移取420 µL浓盐酸（质量分数为36%～38%）于1000mL容量瓶中，用水定容至刻度。此溶液作为萃取溶液。
5.2样品稀释液，pH 2.20。
准确称取四水柠檬酸三锂11.3 g，柠檬酸6.0 g，溶于500 mL水中，后加入20 mL 25 %（质量分数）硫二甘醇溶液和15 mL 32 %（质量分数）盐酸溶液。转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。
5.3锂离子缓冲溶液1）
5.3.1缓冲液A，pH 2.95）。
准确称取四水柠檬酸三锂11.3 g，柠檬酸6.0 g，溶于500 mL水中，后加入50 mL甲醇溶液和9 mL 32 %（质量分数）盐酸溶液，转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。
5.3.2缓冲液B，pH 4.20。
准确称取四水柠檬酸三锂18.8 g，氯化锂4.2 g，溶于500 mL水中，后加入6 mL 32 %（质量分数）盐酸溶液，转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。
5.3.3缓冲液C，pH 3.50。
准确称取四水柠檬酸三锂18.8 g，氯化锂50.9 g，溶于500 mL水中，后加入10 mL 32 %（质量分数）盐酸溶液，转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。
5.4 钾钠缓冲液，pH 5.51。
准确称取三水乙酸钠272.0g，醋酸钾196.0 g，溶于200 mL乙酸（99%～100%（质量分数））中，转移至1000mL容量瓶中，用水进行定容。
5.5 茚三酮溶液2）
准确称取茚三酮20.0 g，苯酚2.0 g，溶于600 mL甲醇中，转移至1000mL容量瓶中，用钾钠缓冲液（5.4）定容至刻度。此溶液应现配现用。
5.6 还原剂
每1000 mL茚三酮溶液（5.5）中加入0.2 g抗坏血酸。
5.7混合氨基酸标准储备液
1）锂离子缓冲溶液的配制方法为推荐性的，操作者可根据所使用仪器的情况自行调整。
2）茚三酮溶液的配制方法为推荐性的，操作者可根据使用仪器的情况自行调整。本标准中所规定的21种氨基酸的浓度均为1.0 µmol/mL。
5.8混合氨基酸标准工作溶液3)
分别移取一定量的混合氨基酸标准储备液（5.7），用样品稀释液（5.2）配制成各氨基酸浓度均为5 nmol/mL、20 nmol/mL、50 nmol/mL、100 nmol/mL、200 nmol/mL 的系列混合氨基酸标准工作溶液。该标准工作溶液在4℃冰箱内可保存3个月。
6 仪器
常用实验仪器以及下述各项。
6.1 旋风式样品磨：60目筛网。
6.2 分析天平：感量0.0001 g。
6.3 移液器：移液范围为50 µL～200 µL 和200 µL～1000 µL。
6.4超声波振荡器：功率≥60 W。
6.5氨基酸分析仪（锂离子系统）：同时具有自动进样，梯度洗脱，以及双通道紫外检测的功能。
6.6高速离心机。
6.7水相滤膜，0.45 µm。
7 分析步骤
7.1 试样的制备
按照YC/T 31-1996中6.1的要求处理烟叶样品后，通过60目筛过滤制备试样，并按照YC/T31-1996中6.2的要求测定试样的水分含量。
7.2 测定次数
每个样品应平行测定两次。
7.3 样品分析
7.3.1 样品制备
称取约1 g试样（7.1）于100 mL磨口三角瓶中，精确至0.0001 g。准确加入盐酸溶液（5.1）
50 mL，塞上塞子，室温下超声萃取30 min。经离心后，取上清液，使用水相滤膜（6.7）过滤后上
机分析。
3）系列混合氨基酸标准工作液的浓度范围为推荐性的，操作者可根据操作习惯和所用仪器的灵敏度特点自行调整，要求至少制备5个工作标准溶液，且样品的浓度应在仪器的线性工作范围之内。
7.3.2 氨基酸分析仪分析
7.3.2.1 按照仪器说明书操作氨基酸分析仪。以下分析条件可供参考，采用其他条件应验证其适用性。
——流动相A：缓冲液A（5.3.1）；
——流动相B：缓冲液B（5.3.2）；
——流动相C：缓冲液C（5.3.3）；
——分离柱初始温度：37 ℃；
——反应管温度：130 ℃；
——流动相流速：0.45 mL/min；
——茚三酮溶液流速：0.25 mL/min；
——进样体积：100 µL；
——检测器：双通道紫外检测器，570 nm和440 nm。
7.3.2.2 仪器梯度洗脱程序见表1。
