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《分子生物学》实验指导实验1 总DNA提取生物总DNA的提取是分子生物学实验的一个重要内容。
由于不同的生物材料细胞壁的结构和组成不同，而细胞壁结构的破坏是提取总DNA的关键步骤。
同时细胞内的物质也根据生物种类的不同而有差异，因此不同生物采用的提取方法也不同，一般要根据具体的情况来设计实验方法。
本实验介绍采用CTAB法提取植物总DNA的技术。
[实验目的]学习和掌握学习CTAB法提取植物总DNA的基本原理和实验技术。
学习和掌握紫外光吸收法鉴定DNA的纯度和浓度。
[实验原理]植物叶片经液氮研磨，可使细胞壁破裂，加入去污剂（如CTAB），可使核蛋白体解析，然后使蛋白和多糖杂质沉淀，DNA进入水相，再用酚、氯仿抽提纯化。
本实验采用CTAB法，其主要作用是破膜。
CTAB 是一种非离子去污剂，能溶解膜蛋白与脂肪，也可解聚核蛋白。
植物材料在CTAB的处理下，结合65℃水浴使细胞裂解、蛋白质变性、DNA 被释放出来。
CTAB与核酸形成复合物，此复合物在高盐（>0.7mM）浓度下可溶，并稳定存在，但在低盐浓度（0.1-0.5mM NaCl）下CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白质及多糖等仍溶解于溶液中。
经过氯仿/ 异戊醇(24:1) 抽提去除蛋白质、多糖、色素等来纯化DNA，最后经异丙醇或乙醇等沉淀剂将DNA沉淀分离出来。
由于核酸、蛋白质、多糖在特定的紫外波长都有特征吸收。
核酸及其衍生物的紫外吸收高峰在260nm。
纯的DNA样品A260/280≈1.8，纯的RNA样品A260/280≈2.0，并且1μg/ml DNA 溶液A260=0.020。
[实验器材]1、高压灭菌锅2、冰箱3、恒温水浴锅4、高速冷冻离心机5、紫外分光光度计6、剪刀7、陶瓷研钵和杵子8、磨口锥形瓶（50ml）9、滴管10、细玻棒11、小烧杯（50ml）12、离心管（50ml）13、植物材料[实验试剂]1、3×CTAB buffer（pH8.0）100mM Tris25mM EDTA1.5M NaCl3% CTAB2% β-巯基乙醇2、TE缓冲液（pH8.0）10mmol/L Tris·HCl1mmol/L EDTA3、氯仿-异戊醇混合液（24：1，V/V）4、95％乙醇5、液氮[实验步骤]1、称取2g新鲜的植物叶片，用蒸馏水冲洗叶面，滤纸吸干水分。
《分子生物学实验技术实验操作指南》目录1 植物基因序列分析 (3)2 引物设计的原则 (4)3 试剂的配置和灭菌 (5)4 植物基因组DNA的提取 (6)5 DNA的定量 (8)6 DNA的电泳 (9)8 PCR产物的回收 (12)9 PCR产物连接T载体和感受态细胞的转化 (14)10 菌落（液）PCR (17)11 质粒DNA的提取 (19)12 质粒DNA的酶切 (21)1 植物基因序列分析1.基因组DNA（genomic DNA, gDNA）：功能基因包括三个基本序列：5’上游区，转录区和3’下游区。
2.5’上游区和3’下游区：转录起始位点上游和转录终止位点下游的序列，主要起到基因表达调控作用。
3.转录区：转录起始位点和转录终止位点之间的序列，经核不均一RNA最终被加工为成熟的mRNA。
4.信使RNA（messenger RNA, mRNA）：由DNA的一条链作为模板转录而来的，携带遗传信息的能指导蛋白合成的一类单链核糖核酸。
由编码区、上游的5’非编码区和下游3’非编码区组成，5’端带有7-甲基鸟苷-三磷酸帽子结构，3’端有多腺苷酸尾巴。
5.互补DNA（complementary DNA, cDNA）：具有与某mRNA链呈互补的碱基序列的单链DNA。
6.蛋白质编码区（sequence coding for amino acids in protein, CDS）：与蛋白质序列一一对应的DNA序列，且该序列中间不含其它非该蛋白质对应的序列。
只有外显子，不含内含子。
7.5’非翻译区（5’-untranslated region, 5’UTR）：mRNA位于基因转录起始位点至编码区翻译起始密码子之间顺序。
8.3’非翻译区（3’-untranslated region, 3’UTR）：mRNA位于编码区翻译终止密码子下游一段不被翻译的序列。
2 引物设计的原则1.引物长度：一般为20-25bp。
若产物长度等于或小于500bp，可选用16-18bp的引物；若产物长达5kb，则需要用更长的引物。
实验一RT-PCR法钓取小鼠肝脏GAPDH基因一、TRlzol试剂提取小鼠肝脏总RNATRIzol RNA提取试剂盒是由GIBCOBRL公司推出的产品，其操作方法简捷、方便，lh之内即可完成，所制备的RNA可用于cDNA合成及Northern blot等。
【试剂】TRlZOL试剂氯仿异丙醇75％乙醇（DEPC水配制）无RNase水【操作方法】（1）收获细胞1~5×106；或50-100mg组织，加TRlzol试剂lml匀浆。
（2），移入1.5ml Ep管中，室温静置5min。
（3）每1ml TRIZOL中加氯仿0.2m1，摇振15s，置室温2～3min。
（4）4℃离心，12,000g×15min。
（5）仔细吸取上层水相，移至另一Ep管中。
（6）加0.5ml异丙醇，混匀，置室温10min。
（7）4℃离心，12,000g×10min。
（8）弃上清，加75％乙醇1m1，轻轻摇振，充分洗涤沉淀，4℃离心，7500g×5min。
（9）弃上清，真空干燥后，沉淀重悬于50μl无RNase水中。
一70℃保存备用。
二、核酸的定量（1）分光光度法测定核酸浓度。
组成核酸分子的碱基，均具有一定的吸收紫外线特性，最大吸收波长为250~270nm之间。
例如腺嘌呤的最大紫外线吸收值在260.5nm，胞嘧啶：267nm 鸟嘌呤：276nM胸腺嘧啶：264.5 nm尿嘧啶259nm。
这些碱基与戊糖、磷酸形成核苷酸后，其最大吸收峰不会改变，但核苷酸最大吸收波长是260nm，吸收低谷在230nm，这个物理特性为紫外分光光度法测定核酸溶液浓度提供了基础。
在波长260nm紫外线下，1OD值的光密度相当于双链DNA浓度为50ug/ ml；单链DNA或RNA为40ug/ml；单链寡核苷酸为20ug/ml。
另外，还可以通过测定260nm和280nm的紫外线吸收值，然后根据其比值来估计核酸的纯度。
DNA样品的比值为1.8，RNA样品的比值为2.0。
分子生物学基本实验操作1.DNA提取：DNA提取是分子生物学中的基础实验操作，目的是从生物组织或细胞中提取出纯净的DNA样品。
常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、盐法和商业化提取试剂盒。
该实验操作通常包括细胞破碎、蛋白质去除、DNA沉淀和洗涤等步骤。
2.PCR：聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中常用的方法，用于扩增特定的DNA片段。
PCR通过加入DNA模板、引物、碱基和聚合酶，利用循环反应的方式在体外合成特定序列的DNA。
PCR通常包括三个步骤：变性、退火和延伸。
3.凝胶电泳：凝胶电泳是一种分离和分析DNA、RNA和蛋白质的常用方法。
通过将待测样品加载到凝胶中，然后通过电场使DNA、RNA或蛋白质在凝胶中迁移，可以根据迁移速度和分子大小进行分离和定性。
4. Western blot：Western blot是一种用于检测特定蛋白质的方法。
该方法通过将待测样品进行电泳分离，然后将蛋白质转移到膜上，并用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后再用染色剂或化学发光来检测目标蛋白质的存在。
5.DNA克隆：DNA克隆是将DNA片段插入到载体DNA中的过程，用于研究和重组DNA。
常用的DNA克隆方法包括限制性内切酶切割、连接酶反应和转化。
通过将DNA片段插入载体中并转化至宿主细胞，可以大量复制目标DNA并随后进行研究。
6.基因测序：基因测序是确定DNA或RNA序列的方法，用于分析基因组、转录组和序列变异。
常用的基因测序方法包括链终止法（Sanger测序）和下一代测序（NGS）。
通过测序，可以获取DNA或RNA的序列信息，并进一步研究基因功能和变异。
7.基因表达分析：基因表达分析通过检测RNA水平来研究基因的表达情况。
常用的方法包括实时定量PCR、Northern blot和转录组测序。
这些方法可以定性和定量地研究基因的表达水平，并帮助解析基因调控和信号通路。
这些是分子生物学的一些基本实验操作。
当然，随着技术和方法的不断发展，分子生物学领域中还有许多其他的实验操作，用于研究生物分子结构和功能。
分子生物学基础实验实验一质粒DNA的小量制备一、实验原理载体:要把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进细胞中去进行繁殖和表达，需要运载工具，携带外源基因进入受体细胞的这种工具就叫载体（vector）。
载体的设计和应用是DNA体外重组的重要条件。
作为基因工程的载体必须具备下列条件:(1)是一个复制子，载体有复制点才能使与它结合的外源基因复制繁殖；（2）载体在受体细胞中能大量增殖，只有高复制率才能使外源基因在受体细胞中大量扩增；（3）载体DNA 链上有1到几个限制性内切酶的单一识别与切割位点，便于外源基因的插入；（4）载体具有选择性的遗传标记，如有抗四环素基因（Tc r），抗新霉素基因（Ne r）等，以此知道它是否已进入受体细胞，也可根据这个标记将受体细胞从其他细胞中分离筛选出来。
细菌质粒具备上述条件，它是基因工程中常用的载体之一。
质粒（plasmid）是一种染色体外的稳定遗传因子，大小在1～120kb 之间，具有双链闭合环状结构的DNA分子，主要发现于细菌、放线菌和真菌细胞中。
质粒具有自主复制和转录能力，能使子代细胞保持它们恒定的拷贝数，可表达它携带的遗传信息。
它可独立游离在细胞质内，也可以整合到细菌染色体中，它离开宿主的细胞就不能存活，而它控制的许多生物学功能也是对宿主细胞的补偿。
质粒在细胞内的复制，一般分为两种类型：严密控制型（stringent control）和松弛控制型（relaxed control）。
前者只在细胞周期的一定阶段进行复制，染色体不复制时，它也不复制。
每个细胞内只含有1个或几个质粒分子。
后者的质粒在整个细胞周期中随时复制，在细胞里，它有许多拷贝，一般在20个以上。
通常大的质粒如F因子等，拷贝数较少，复制受到严格控制。
小的质粒，如ColE Ⅰ质粒（含有产生大肠杆菌素E1基因），拷贝数较多，复制不受严格控制。
在使用蛋白质合成抑制剂－氯霉素时，染色体DNA复制受阻，而松弛型ColEⅠ质粒继续复制12－16h，由原来20多个拷贝可扩增至1000－3000个拷贝，此时质粒DNA占总DNA的含量由原来的2％增加到40％－50％。
分子生物学实验报告慕蓝有志班梦想学院目录实验一细菌的培养 (2)实验二质粒DNA的提取 (4)实验三琼脂糖凝胶电泳法检测DNA (7)实验四质粒DNA酶切及琼脂糖电泳分析鉴定 (9)实验五聚合酶链反应（PCR）技术体外扩增DNA (11)实验六植物基因组DNA提取、酶切及电泳分析 (14)实验七RNA分离与纯化 (17)实验八RT-PCR扩增目的基因cDNA (19)实验九质粒载体和外源DNA的连接反应 (21)实验十感受态细胞的制备及转化 (23)实验十一克隆的筛选和快速鉴定 (25)实验十二地高辛标记的Southern杂交 (27)实验十三阿拉伯糖诱导绿色荧光蛋白的表达 (31)思考题 (32)分子实验心得总结 (33)实验一细菌的培养一、目的学习细菌的培养方法及培养基的配置。
二、原理在基因工程实验和分子生物学实验中，细菌是不可缺少的实验材料。
质粒的保存、增殖和转化；基因文库的建立等都离不开细菌。
特别是常用的大肠杆菌。
大肠杆菌是含有长约3000kb的环状染色体的棒状细胞。
它能在仅含碳水化合物和提供氮、磷和微量元素的无机盐的培养基上快速生长。
当大肠杆菌在培养基中培养时，其开始裂殖前，先进入一个滞后期。
然后进入对数生长期，以20~30min复制一代的速度增殖。
最后，当培养基中的营养成分和氧耗尽或当培养基中废物的含量达到抑制细菌的快速生长的浓度时，菌体密度就达到一个比较恒定的值，这一时期叫做细菌生长的饱和期。
此时菌体密度可达到1×109~2×109/mL。
培养基可以是固体的培养基，也可以是液体培养基。
实验室中最常用的是LB培养基。
三、实验材料、试剂与主要仪器（一）实验材料大肠杆菌（二）试剂1. 胰蛋白胨2. 酵母提取物3. 氯化钠4. 1mol/L NaOH5. 琼脂粉6. 抗生素（氨苄青霉素、卡那霉素等）（三）仪器1. 培养皿2. 带帽试管3. 涂布器4. 灭菌锅5. 无菌操作台（含酒精灯、接种环、灭菌牙签等）6. 恒温摇床四、操作步骤（一）LB培养基的配制配制每升培养基，应在950m1去离子水中加入：细菌培养用胰蛋白胨10g细菌培养用酵母提取物5gNaCl 10g摇动容器直至溶质完全溶解，用1mol/L NaOH调节pH位至7.0。
分子生物学实验教材：参考书：《分子克隆实验指南》（第三版）黄培堂等译科学出版社实验一﹑大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一.[目的要求]通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。
二.[实验原理]细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
细菌处于0︒C ，CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，外源DNA附着于细胞表面，经42︒C 短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新表型如Amp+得到表达，然后将此细菌培养物涂在选择性培养基上进行培养，从而获得转化子。
三.[教学内容]1.感受态细胞的制备基础知识及方法简介2.CaCl2法制备DH5α或JM109感受态细胞，计算转化效率3.pUC19等质粒和重组产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞四.[实验材料和用品]E. coli DH5α菌株: Rˉ,Mˉ,Ampˉ；pBS质粒DNA，eppendorf管。
超净工作台、恒温摇床、生化培养箱、平皿、LB培养基、CaCl2 溶液、氨苄青霉素、等五.[实验步骤]一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
分子生物学实验分子生物学实验I. 实验概述分子生物学是生物学的一个重要分支，主要研究生物分子的结构、功能及其在生命过程中的作用。
在现代生命科学研究中，分子生物学技术的应用越来越广泛，包括基因克隆、基因表达、蛋白质结构、信号转导等多个方面。
本实验将介绍几种基本的分子生物学实验操作，包括DNA的提取、PCR扩增、电泳检测和蛋白质的SDS-PAGE分析，旨在提高学生对分子生物学基础知识和实验技能的掌握。
II. 实验材料及设备1. 细菌培养基、磷酸盐缓冲液、EDTA、裂解液等试剂；2. 离心管、洗涤管、PCR管、电泳槽等设备；3. 离心机、PCR仪、电泳仪等设备。
III. 实验步骤1. DNA的提取(1) 收集细胞收集需要提取DNA的细胞，如细菌、白细胞等。
将细胞转移到1.5mL离心管中。
(2) 细胞裂解加入200μl裂解液，轻轻摇晃离心管，使细胞充分裂解。
离心管可置于65°C水浴中处理10分钟，使DNA完全裂解。
(3) DNA提取加入500μl磷酸盐缓冲液和10μl EDTA，混匀后离心5分钟。
取上清液转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，并轻轻倒置，使DNA在异丙醇界面上结团。
放置室温下10分钟，使用洗涤管将DNA结团转移到另一离心管中。
加入70%乙醇溶液洗涤2-3次，最后去除乙醇，用无菌水溶解DNA。
2. PCR扩增(1) 设计引物、制备PCR反应液按照所需扩增的DNA序列设计引物，制备PCR反应液，包括所需模板DNA、引物、Taq聚合酶、MgCl2等。
(2) PCR条件将PCR反应管放置PCR仪中，经过若干个循环，达到最终PCR产物的扩增。
PCR条件通常应选择对应引物特异性、Tm温度适中，并根据Taq聚合酶的活性和反应体系的最适条件优化所得。
常用的PCR条件为95℃预变性5min，94℃变性30s，Tm温度退火30s，72℃延伸1min，循环30-35次，最后72℃加延伸10min。
分子生物学实验实验一、菌株复壮与单菌落菌株的获取一、实验目的学习细菌培养的LB培养基及抗生素抗性筛选培养基的配制，掌握高压灭菌和获取细菌单菌落菌株两种基本实验操作技能。
二、实验材料、设备及试剂1、实验材料大肠杆菌（E. coli）DH5α菌株：R-，M-，Amp-2、实验设备恒温摇床，电热恒温培养箱，无菌工作台，高压灭菌锅3、试剂酵母浸膏，蛋白胨，氯化钠，琼脂，卡那霉素三、实验步骤液体LB（Luria-Bertain）培养基配方：蛋白胨(typtone) 1.0% （1 g/100 ml）酵母提取物(Yeast extraction)0.5% （0.5g/100 ml）氯化钠 1.0% （1 g/100 ml）PH 7.0固体LB培养基：每100 ml液体培养基中加入1.5g琼脂粉请按试剂瓶上的编号使用相应编号的药勺取药，防止药品相互污染！(1)每组按上述液体LB培养基配方，以配制100ml的量称取药品放入烧杯。
(2)用量筒量取约80 ml 蒸馏水注入烧杯中，玻棒搅拌使药品完全溶解后用100ml量筒定容至100ml。
(3)pH试纸检测pH值，并用1 N NaOH或1 N HCl调节pH值至7.0。
(4)将100ml溶液分装入两个三角瓶，每瓶为50ml。
(5)按固体培养基配方称取适量琼脂粉分别放入两个三角瓶中，以配制成两瓶50ml固体LB培养基。
(6)两个三角瓶分别用锡纸包扎瓶口。
并用记号笔在三角瓶上标注各组标记。
(7)把装有培养基三角瓶放入灭菌锅中，盖上锅盖，以对称方式拧紧锅盖，打开排气阀通电加热，至有连续的白色水蒸气从排气阀排出时，关闭排气阀。
当高压锅温度（气压）指示器指示锅内温度升高至121℃（0.1Mpa）时，调节电压（或利用手动开关电源的方式）使高压锅稳定在该温度（压力）下20 min，然后断开电源。
待指示器指示压力降为0时，方可打开排气阀，然后再打开锅盖小心取出锅内物品。
(8)取出三角瓶后，在酒精灯火焰旁进行下述操作。
《分子生物学》实验指导书实验学时：32学时适用专业：生物科学、生物技术实验目录实验一质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定 (1)实验二聚合酶链式反应扩增DNA片段 (3)实验三大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA分子转化 (4)实验四植物基因组DNA提取及电泳 (6)实验五植物基因组RNA提取及电泳 (7)实验一质粒DNA的提取、酶切与电泳鉴定实验项目类型：综合性一、实验目的1. 学习质粒的相关基本知识，掌握碱裂解法提取质粒DNA的原理和方法。
2. 学习和掌握限制性内切酶的特性、掌握对重组质粒进行限制性内切酶酶切的原理和方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具。
二、实验原理碱裂解法提取质粒DNA的原理是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的结构差异来实现分离的。
在pH12-12.5时，线性DNA被彻底变性，但共价闭环质粒DNA虽然氢键也发生断裂，但两条互补链仍会紧密缠绕结合在一起。
当在溶液体系中加入pH4.8的KAC时，溶液恢复中性，质粒DNA迅速复性，染色体DNA则由于变性而相互混乱缠绕，不能复性，从而离心即可以把变性的染色体DNA沉淀和蛋白-SDS复合物沉淀分离出来。
三、实验仪器与材料1. 材料：含pSV的E.coli JM109菌株、1.5ml塑料离心管、离心管架、EB、酚、氯仿、异丙醇、乙醇、琼脂糖、吸头等。
2. 溶液或试剂：LB培养基、溶液Ⅰ、溶液II（0.4mol/L NaOH、2%SDS用前等体积混合）、溶液Ⅲ、分离液：酚/氯仿/异戊醇＝25:24:1、无水乙醇、70%乙醇等。
3. 仪器或其他用具：微量移液器(20μl,200μl,1000μl)、恒温振荡摇床、高压蒸汽灭菌锅、涡旋振荡器、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温培养箱、制冰机等。
四、操作步骤质粒DNA的提取步骤：1. 用灭菌的牙签挑取白色单菌落接种于另外已制备好的LB琼脂平板上，保存菌种，并把牙签放入盛3 ml LB液体培养基的试管中，37℃振荡培养过夜。
微量加样器的使用及注意事项1 微量加样器的使用原理及分类根据其加样的物理学原理可分为两种①空气垫加样器(又称活塞冲程);②无空气垫的活塞正移动加样器，这两种加样器具有不同的特定应用范围。
活塞冲程(空气垫) 加样器可很方便地用于固定或可调体积液体的加样，加样体积的范围在小于1μl～10ml 之间。
加样器中的空气垫的作用是将吸于塑料吸头内的液体样本与加样器内的活塞分隔开来，空气垫通过加样器活塞的弹簧样运动而移动，进而带动吸头中的液体，死体积和移液吸头中高度的增加决定了加样中这种空气垫的膨胀程度。
因此，活塞移动的体积必须比所希望吸取的体积要大约2%～4%，温度、气压和空气湿度的影响必须通过对空气垫加样器进行结构上的改良而降低，使得在正常情况下不至于影响加样的准确度。
一次性吸头是本加样系统的一个重要组成部分，其形状、材料特性及加样器的吻合程度均对加样的准确度有很大的影响。
以活塞正移动为原理的加样器和分配器与空气垫加样器所受物理因素的影响不同，因此，在空气垫加样器难以应用的情况下，活塞正移动加样器可以应用，如具有高蒸汽压的、高黏稠度以及密度大于2.0g/cm3的液体；又如在临床聚合酶链反应(PCR)测定中，为防止气溶胶的产生，最好使用活塞正移动加样器。
活塞正移动加样器的吸头与空气垫加样器吸头有所不同。
2 微量加样器的一般使用原则加样器根据其加样的物理学原理和结构的不同，其应用特点也有所不同。
（1）活塞正移动加样器无需任何校正，即可用于具不同化学组成和特性(密度和黏度)的液体的吸取加样；相反，空气垫加样器的使用则较受局限。
（2）具有高蒸汽压的液体如氯仿使用空气垫加样器吸取加样通常不能得到跟吸取加样蒸馏水相同的准确度和精密度。
由于在液体吸取过程中有部分蒸发，因而加样的体积就会有所减少。
可通过预先用液体湿润吸头数次，使得蒸汽相被液体饱和，可以改善加样的准确度。
（3）为防止由高蒸汽压引起液体从吸头中漏出，可使用在底部有瓣的吸头，此瓣只在其与管壁接触的时候打开。
（4）使用空气垫加样器加样，位于液体之上的空气体积膨胀依所加液体密度的不同而不同。
当吸取密度高于水的液体时，吸入吸头的体积太低。
例如，对于一个密度为1.1的较高浓缩的液体，误差的量将达到0.2%。
而吸取较稀的水溶液的这种误差则可以忽略不计。
因此，在吸取密度高的液体时，须对加样器吸取体积的设定作相应的校正，才能保证取到正确的体积。
然而，在实验室实际工作中，加样器使用者很少碰到要准确吸取密度很高的液体的情况，故由于液体的密度所致加样器使用受限的情况通常难以遇到。
一般来说，为防止所吸取体积上出现误差，有一些基本的操作原则必须遵守。
对吸取体积误差影响的因素主要有三个方面：①流体静压；②吸头润湿；③流体动力学。
当样本体积从毫升范围降低至微升范围时，物理作用力的关系即发生变化，对于加样来说，其意味着液体表面的作用力效应与其体积或质量（例如重力）的作用力效应相比有所增加，因此，加样器生产厂家在设计和构建加样器和吸头中必须仔细考虑这种情况，而且在使用时也必须注意。
流体静压：在吸取液体时，加样器吸头只能浸入液体几毫升以确保与排出液体时相同的流体静压条件，因此，加样器必须以几乎垂直的方式加取液体，因为倾斜的方式将减少液体柱的高度，导致吸取的液体过多。
如果加样器以30℃下以垂直方式吸取液体，可吸取至0.15%更多的液体。
吸头润湿：当吸头排空时，仍会有一些残留的液体以薄膜的形式保留在吸头的侧面，其量取决于液体和吸头表面的相互作用，因此，其是一个常数，但依液体材料的不同而不同。
对于水溶液，这种润湿影响在构建加样器时就应考虑。
对于蛋白液等黏度高的液体，建议在加样前吸液体数次，以保证加样的一致性。
流体动力学：对体积吸取的第三个影响是从加样器吸头外壁液体的释放，在此过程中，吸头的几何形状起一个关键的作用。
为确保加样中的稳定条件，加样器吸头应靠在管壁上，吸头中释放。
如果吸头安装不正确或使用不相配的吸头，对加样误差将达到0.4%以上。
尽管空气垫加样器的使用有一定的局限性，但其优点耀很明显的，其所覆盖的体积范围大，使用易于掌握。
此类加样器很轻，可很空易地应用于各种情况下的加样。
3 注意事项实验室基本上以使用连续可调的加样器为主。
连续可调式加样器在使用时应注意以下几点，从而使加样器能发挥最佳性能。
3. 1 取液之前，所取液体应在室温（15℃～25℃）平衡。
3. 2 操作时要慢和稳。
3. 3 连续可调试加样器在取样加样过程中应注意移液吸头不能触及其他物品，以免被污染；移液吸头盒（架子）、废液瓶、所取试剂及加样的样品管应摆放合理，以方便操作过程、避免污染为原则。
3. 4 连续可调试加样器在使用完毕后应置于加样器架上，远离潮湿及腐蚀性物质。
3. 5 吸头浸入液体深度要合适，吸液过程尽量保持不变。
3. 6 改吸不同液体、样品或试剂前要换新吸头。
3. 7 发现吸头内有残液时必须更换。
3. 8 新吸头使用前应先预测。
3. 9 为防止液体进入加样器套筒内，必须注意以下几点：①压放按钮时保持平衡；②加样器不得倒转；③吸头中有液体时不可将加样器平放；④P5000及P10ML加样器一定要加滤芯。
3. 10 勿用油脂等润滑活塞或密封圈。
3. 11 不可把容量计数调超其适用范围。
3. 12 液体温度与室温有异时，将吸头预洗多次再用。
3. 13 移液温度不得超过70℃。
3. 14 使用了酸或有腐蚀蒸气的溶液后，最好拆下套筒，用蒸馏水清洗活塞及密封圈。
3. 15 连续可调式加样器在使用完毕后应置于加样器架上，远离潮湿及腐蚀性物质。
4. 加样器的校准加样器容量性能的鉴定，可依据国际标准化组织（ISO）文件ISO/DIS8655和国家技术监督局颁发的有关定量、可调移液器的中华人民共和国国家计量检定规程《定量、可调移液器试行检定规程》（JJG646-90）规定的重量测试方法。
这是目前用于此类仪器有效的校准方法。
4.1. 适用加样器范围各种品牌、型号的固定、可调和多通道加样器。
4.2. 校准环境和用具要求4.2.1 室温20-25℃，测定中波动范围不大于0.5℃。
4.2.2 电子天平：放置于无尘和震动影响的台面上，房间尽可能有空调。
称量时，为保证天平的湿度（相对湿度60%-90%），天平内应放置一装有10ml蒸馏水的小烧杯。
4.2.3 小烧杯：5-10ml体积。
4.2.4 测定液体：温度为20-25℃的去气双蒸水。
4.3. 选定校准体积①拟校准体积；②加样器标定体积的中间体积；③最小可调体积（不小于拟校准体积的10%）。
如为固定体积加样器，则只有一种校准体积。
4.4. 校准步骤4.4.1 将加样器调至拟校准体积，选择合适的吸头。
4.4.2 调节好天平。
4.4.3 来回吸吹蒸馏水3次，以使吸头湿润，用纱布拭干吸头。
4.4.4 垂直握住加样器，将吸头浸入液面2-3mm处，缓慢（1-3s）一致地吸取蒸馏水。
4.4.5 将吸头离开液面，靠在管壁，去掉吸头外部的液体。
4.4.6 将加样器以30角放入称量烧杯中，缓慢一致地将加样器压至第一档，等待1-3s，再压至第二档，使吸头里的液体完全排出。
4.4.7 记录称量值。
4.4.8 擦干吸头外面。
4.4.9 按上述步骤称量10次。
4.4.10 取10次测定值的均值作为最后加样器吸取的蒸馏水重量，按蒸馏水在不同温度及气压下的重量与体积的换算因子计算体积。
然后，按校准结果调节加样器。
4.5加样器的维护保养程序加样器应根据使用频率进行维护，但至少应每3个月进行一次，具体方法如下：4.5.1.一般维护可用中性洗涤剂清洁，或者用60﹪的异丙醇，然后用蒸馏水反复洗涤，去除洗涤剂或异丙醇，晾干。
清洁后活塞处可使用一定量的润滑剂。
4.5.2.如果有液体进入加样器内的严重污染，可将加样器拆开后进行清洁，具体拆开步骤参照加样器说明书。
4.5.3.高压消毒，有的加样器的吸管部分可高压消毒，但需注意的是消毒时不可超温超时，也不能挤压放置，以免造成变形。
4.5.4.可调式移液器在不使用时应妥善地竖立放于支架上，远离潮湿及腐蚀性物质。
4.5.5.在移液操作过程中为防止液体进入加样器套筒内，必须注意：压放按钮时保持平稳；加样器不得倒转；吸头中有液体时不可将加样器平放。
4.5.6.每天开始工作之前应检查移液器的外表面是否有灰尘或污物，若有则小心抹去。
田士军实验一PCR一、实验原理：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。
二、设备：微量移液器（10μl）；离心机(Eppendorf centrifuge 541B)；PCR仪（Bio-Rad S10000TM Thermal cycler）三、耗材：吸头，1.5ml，200μl PCR八连管，四、试剂和配制方法：上游引物，下游引物，模板质粒，灭菌去离子水，Kit：天根生化[ 2×Pfu Master Mix Kp201（含有pfu DNA聚合酶，dNTPs，镁离子，反应缓冲液，PCR反应的增强剂，loading buffer）]。
五、步骤：1．依次在管中加入：（25μl PCR体系）按照kit的说明书：Primer 1(10uM) 1μlPrimer 2(10μM) 1μl2×Master Mix 12.5μlddH2O 9.5μlTemplate 1μl注：空白对照不加模板；其余先加ddH2O，最后加模板。
注意加样顺序：ddH2O，Primer，2×Master Mix，Template。
2．瞬离，将样品甩至管底。
3．PCR参数：94℃5min35×(94℃25sec - 60 ℃25sec - 72℃30sec)- 72 ℃20min（第一个10min后每管加1μl的普通Taq，然后继续72 ℃10min）若无需加A尾，只需72 ℃10min 4. 立即电泳或保存于4℃注意事项：PCR只需几个DNA分子作模板就可大量扩增，应注意防止反应体系被痕量DNA模板污染和交叉污染，假阳性结果往往来自痕量污染和交叉污染，尤其在待扩增靶序列浓度低的情况下，更有必要采取防备措施。
