cDNA文库构建简易流程

CDNA 文库
CDNA 文库是一种 cDNA(互补 DNA) 文库，它包含了生物体中所有基因的 mRNA 转录本的互补 DNA 序列。

在 CDNA 文库中，mRNA 被逆转录成 cDNA，然后被克隆到载体中，最终形成一个包含所有基因信息的文库。

CDNA 文库的构建过程通常包括以下步骤:
1. 从生物组织中提取 mRNA，并去除 rRNA 和 tRNA 等非编码RNA。

2. 将 mRNA 逆转录成 cDNA，使用逆转录酶将 mRNA 转录成cDNA，并在此过程中添加适配体，以产生特定长度的 cDNA 片段。

3. 将 cDNA 片段连接到载体上，通常使用质粒载体。

4. 将连接好的载体转化到大肠杆菌中，并筛选出阳性克隆。

5. 对阳性克隆进行测序和分析，以确定其序列信息。

CDNA 文库在基因组学研究中具有广泛的应用，例如:
1. 基因克隆：通过 CDNA 文库，可以克隆出感兴趣的基因，并对其进行进一步的研究。

2. 基因表达分析：通过比较不同组织或条件下的 CDNA 文库，可以分析基因的表达情况，了解基因在生物体内的功能和调控机制。

3. 基因组测序：通过 CDNA 文库，可以对生物体的基因组进行测序，以确定其基因组序列信息。

操作一览(PT3000-2)本操作一览仅为实验流程，对于初用者，请在使用操作一览前仔细阅读SMART TM cDNA 文库构建试剂盒(Cat. No. 634901) 的说明书。

A. 第一链cDNA(fs cDNA)合成1. 在0.5-ml 离心管中混匀以下试剂：1–3 μl RNA 样本(对照反应，使用1 μl 的对照RNA)1 μl SMART™ IV Oligonucleotide1 μl CDS III/3' PCR Primer如果总体积<5 μl时，用水补齐至5 μl。

2. 混匀试剂并瞬时离心。

3. 72°C孵育2 min。

冰上冷却2 min。

4. 瞬时短暂离心。

5. 向每管反应中加入以下试剂：2.0 μl 5X First-Strand Buffer1.0 μl DTT (20 mM)1.0 μl dNTP Mix (10 mM)1.0 μl SMARTScribe MMLV Reverse Transcriptase10.0 μl 总体积6. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。

7. 42°C孵育1 hr。

之后的LD PCR（步骤B）操作需在冰上进行。

8.引物延伸合成ds cDNA分别向反应管中加入1 μl 氢氧化钠，68°C孵育30 min，然后进行步骤C。

B. LD PCR扩增合成cDNA1. 在一个新的0.5-ml 离心管中混匀以下试剂：2 μl First-Strand cDNA (from Step A.7)80 μl Deionized H2O10 μl 10X Advantage2 PCR Buffer2 μl 50X dNTP Mix2 μl5' PCR Primer2 μl CDS III/3' PCR Primer2 μl 50X Advantage2 Polymerase Mix100 μl总体积2. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。

cdna文库的构建步骤CDNA文库是基因组学和转录组学研究中非常常见的技术，它可以用来快速鉴定不同组织或不同生长条件下基因表达的变化情况。

下面将介绍CDNA文库的构建步骤。

一、RNA提取RNA提取是构建CDNA文库的第一步，它是从不同组织或生长条件下采集的样品中提取出RNA。

RNA提取需要注意以下几点：1. 样品必须在冰上保存，并尽可能快地进行处理。

2. RNA提取要使用无菌工具和试剂，并严格遵守操作规程。

3. RNA提取要避免DNA污染，可使用DNase对RNA进行处理。

4. RNA质量要进行检测，以保证后续实验的可靠性。

二、反转录反转录是将RNA转化为cDNA的过程。

反转录需要注意以下几点：1. 反转录试剂必须新鲜，并且使用前应该预先热处理。

2. 反转录反应时间和温度要根据实验需求进行调整。

3. 可以选择使用随机引物或寡聚dT引物作为反转录引物。

三、二代测序前的PCR扩增PCR扩增是将cDNA扩增为足够的量以进行二代测序的过程。

PCR扩增需要注意以下几点：1. PCR反应体系要严格控制，避免引物和模板过量。

2. PCR反应时间和温度要根据实验需求进行调整。

3. 可以选择使用高保真PCR酶，以保证扩增产物的准确性。

四、文库构建文库构建是将PCR扩增产物连接到载体上，形成完整的CDNA文库的过程。

文库构建需要注意以下几点：1. 选择合适的载体，如pBluescript II SK+、pUC19等。

2. 连接PCR扩增产物时要控制连接比例，避免连接过多或过少。

3. 连接后可以进行转化、筛选和纯化等步骤，得到CDNA文库。

五、二代测序二代测序是对CDNA文库进行高通量测序的过程。

二代测序需要注意以下几点：1. 选择合适的平台和测序模式，如Illumina HiSeq、NovaSeq等平台。

2. 测序深度要根据实验需求进行调整，以保证数据质量和覆盖度。

3. 测序后得到原始数据后，需要进行质控、去除低质量数据、拼接等步骤，得到高质量的测序数据。

cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA文库构建的具体步骤及详细说明cDNA 文库是指某生物某发育时期所转录的全部mRNA 经反转录形成的cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。

经典cDNA 文库构建的基本原理是用Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。

其基本步骤包括：（1）mRNA的提纯获取高质量的mRNA是构建高质量的cDNA 文库的关键步骤之一。

（2）cDNA第一条链的合成。

（3）cDNA第二条链的合成。

（4）双链cDNA的修饰。

（5）双链cDNA的分子克隆。

（6）cDNA文库的扩增。

（7）cDNA文库鉴定评价。

一、Superscipt II—RT合成第一链1. 在一RNase-free的0.2 ml PCR管中加入x ul mRNA(大约500 ng) 、1 ul Xho I Primer(1.4 ug/ul)(5’GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAAC TAGTCTCGAGTTTTTTTT TTTTTTTTTT…3’)、11-x ul RNase-free water（大于500 ng mRNA 分n管(500 ng/tube)合成第一链，第一链合成完毕后将n管合成一管进行第二链合成。

）。

2. 混匀后，70℃反应10分钟。

3. 反应完成后，立刻将反应体系置于冰上5 min。

4. 稍微离心一下，顺序加入以下试剂：（1）4 ul 5×first strand buffer（2）2 ul 0.1 M DTT（3）1 ul 10 mM dNTP(自己配制)5. 混匀，稍微离心反应物之后，42℃放置2分钟。

6. 反应完成,趁热加入1 ul Superscipt II—RT，混匀。

7. 42℃反应50分钟，然后70℃，15分钟灭活反转录酶。

二、cDNA第二链的合成1. 第一链反应完成后，取2ul一链产物-20℃冰箱中保存，待电泳检测。

第二节cDNA 文库的构建cDNA 文库中的外源 DNA 片段是互补 DNA （complementary DNA , cDNA）。

cDNA 是由生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内的 mRNA 经体外反转录后形成的双链 cDNA 。

cDNA 文库代表生物的某一特定器官或特定发育时期细胞内转录水平上的基因的群体，并不能包括该生物的全部基因，且这些基因在表达丰度上存在很大差异。

cDNA 文库的构建cDNA 文库的构建共分四步（图 8-2）：第一，细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；第二，第一链 cDNA 合成；第三，第二链 cDNA 合成；第四，双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖。

图 8-2 ： cDNA 文库构建流程图一、RNA 的分离cDNA 文库构建是以 mRNA 为起始材料的， mRNA 在总RNA 中所占比例很小，因此从总RNA 中富集mRNA 是构建cDNA 文库和其它应用所必需进行的步骤。

通过降低rRNA和tRNA 含量，可大大提高筛选到目标基因的可能性。

目前纯化mRNA 的方法都是在固体支持物表面共价结合固定一段由脱氧胸腺嘧啶核苷组成的寡聚核苷酸[ oligo（dT）]链，由它与mRNA 的Poly（A）尾巴杂交，从而吸附固定住mRNA ，进而将mRNA从其它组分中分离出来的。

1．mRNA 的完整性指导合成高分子量蛋白质的能力，指导合成目的多肽的能力，mRNA 的大小，总mRNA 制剂指导合成cDNA 第一链长分子的能力。

2．mRNA 的丰度高丰度mRNA ：珠蛋白，免疫球蛋白，卵清蛋白，在特定细胞中占50-90% 。

低丰度mRNA ：含量 0.5% 被称为低丰度或稀有mRNA 。

3．mRNA 的富集3.1按大小对 mRNA 进行分级分离3.2 cDNA 的分离级分离近年来多采用此方法，特别是大mRNA ，可避免降解mRNA , agarose 分离大小易辨。

cDNA⽂库制备⾮常详细cDNA⽂库组标准流程⼀. Total RNA的提取 (2)⼆. mRNA的分离 (5)三．cDNA双链合成 (8)四．载体制备 (11)五. cDNA双链和载体的连接 (13)六．电转化流程 (14)七．快速鉴定、菌落PCR (16)⼋．pBlueScript cDNA库扩增 (18)⼀.Total RNA的提取1.试剂配制准备⼯作：1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均⽤锡纸包裹⼝部，置于烤箱内,180℃，烤6⼩时。

2、50ml/1.5ml离⼼管、枪头等塑料制品⽤0.1‰DEPC⽔浸泡过夜后，121℃20mins ⾼压灭菌。

3、电泳槽及电泳托、梳⼦⽤3%双氧⽔处理。

4、常⽤试剂及其配⽅：▲DEPC⽔：在1000ml去离⼦⽔中加⼊100ul DEPC, 静置过夜后⾼压灭菌。

▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5三⽔合柠檬酸纳22.94g加DEPC⽔定容⾄100ml，室温放置备⽤。

▲10%肌氨酸钠：肌氨酸钠10g加DEPC⽔定容⾄100ml，室温放置备⽤。

▲变性裂解液：0.78M柠檬酸钠8.25ml10%肌氨酸钠12.375ml异硫氰酸胍118.05g加DEPC⽔定容⾄250ml，室温放置备⽤临⽤前加β-巯基⼄醇使其终浓度为1%（v/v）▲2M 醋酸钠PH=4.5NaAc·3H2O 13.6g加DEPC⽔定容⾄50ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲3M醋酸钠PH=5NaAc·3H2O 20.4g加DEPC⽔定容⾄50ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲4M LiCL:LiCL 24.164g加DEPC⽔定容⾄100ml,⾼压灭菌，室温放置备⽤▲0.5M EDTA PH=8.0EDTA 18.61g⽤NaOH调PH值⾄8.0，定容到100ml，⾼压灭菌，室温放置备⽤▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):MOPS 41.86gNaAC·3H2O 4.10g0.5MEDTA（PH 8.0）20ml⽤NaOH调PH值 6.5 , DEPC⽔定容到1L，室温避光放置备⽤。

cdna基因文库构建的基本路线以cdna基因文库构建的基本路线为标题的文章概述CDNA基因文库是基因组学研究中的一个重要工具，可以用于克隆和表达特定基因。

本文将介绍构建cdna基因文库的基本路线，包括RNA提取、逆转录、cDNA合成、文库构建和筛选等步骤。

第一步：RNA提取构建cdna基因文库的第一步是从所研究的生物样品中提取总RNA。

这可以通过使用商业化的RNA提取试剂盒或经典的酚-氯仿法等方法来实现。

在提取RNA的过程中，需要注意样品的保存和处理，以确保所提取的RNA完整无损。

第二步：逆转录逆转录是将RNA转化为相应的cDNA的过程。

逆转录反应通常使用逆转录酶（Reverse Transcriptase）进行，该酶能够将RNA模板上的信息转录成DNA。

在逆转录反应中，需要加入随机引物、dNTPs和逆转录酶，以及适当的缓冲液。

逆转录反应的温度和时间也需要根据具体的逆转录酶和反应体系进行优化。

第三步：cDNA合成在逆转录反应完成后，需要对产生的cDNA进行纯化。

一种常用的方法是通过酶切和连接反应，将cDNA连接到载体上，形成重组DNA，再通过转化等方法将其导入到大肠杆菌等宿主中。

在cDNA 合成的过程中，需要注意对cDNA的纯化和测序质量的控制，以确保所获得的cDNA具有高质量和完整性。

第四步：文库构建文库构建是指将cDNA插入到合适的载体中，形成cdna基因文库。

常用的载体包括质粒和噬菌体等。

在文库构建的过程中，需要对cDNA和载体进行受限酶切，然后使用DNA连接酶将其连接起来。

连接后的DNA需要进行转化，将其导入到适当的宿主细胞中，形成文库。

不同的文库构建方法有所差异，可以根据实验需求选择合适的方法。

第五步：筛选构建cdna基因文库后，需要对文库进行筛选，以寻找感兴趣的基因。

常用的筛选方法包括杂交筛选、PCR筛选和基于功能的筛选等。

根据所研究的基因或表达产物的特性，可以选择合适的筛选方法。

筛选后的阳性克隆可以进一步进行测序和鉴定，以确认所克隆的基因的准确性和完整性。

cDNA文库组标准流程一. Total RNA的提取 (2)二. mRNA的分离 (7)三．cDNA双链合成 (10)四．载体制备 (15)五. cDNA双链和载体的连接 (18)六．电转化流程 (19)七．快速鉴定、菌落PCR (22)八．pBlueScript cDNA库扩增 (25)一.Total RNA的提取1.试剂配制准备工作:1、研钵、 5ml/10ml/ 25ml移液管、 100ml/250ml量筒、 250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部, 置于烤箱内,180℃, 烤6小时。

2、 50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后, 121℃20mins 高压灭菌。

3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。

4、常见试剂及其配方:▲DEPC水: 在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。

▲0.78M柠檬酸纳: PH=4~5三水合柠檬酸纳 22.94g加DEPC水定容至100ml, 室温放置备用。

▲10%肌氨酸钠:肌氨酸钠 10g加DEPC水定容至100ml, 室温放置备用。

▲变性裂解液:0.78M柠檬酸钠 8.25ml10%肌氨酸钠 12.375ml异硫氰酸胍 118.05g加DEPC水定容至 250ml, 室温放置备用临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%( v/v)▲ 2M 醋酸钠 PH=4.5O 13.6gNaAc·3H2加DEPC水定容至50ml,高压灭菌, 室温放置备用▲3M醋酸钠 PH=5O 20.4gNaAc·3H2加DEPC水定容至50ml,高压灭菌, 室温放置备用▲ 4M LiCL:LiCL 24.164g加DEPC水定容至100ml,高压灭菌, 室温放置备用▲0.5M EDTA PH=8.0EDTA 18.61g用NaOH调PH值至8.0, 定容到100ml, 高压灭菌, 室温放置备用▲10X MOPS (3-( N-吗啉代) 丙磺酸):MOPS 41.86gNaAC·3HO 4.10g20.5MEDTA( PH 8.0) 20ml用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L, 室温避光放置备用。

cdna基因文库构建的基本路线CDNA基因文库构建是一种常用的分子生物学技术，用于研究基因表达和功能的调查。

本文将介绍CDNA基因文库构建的基本路线，包括材料准备、RNA提取、反转录、合成cDNA、构建文库和筛选等步骤。

一、材料准备进行CDNA基因文库构建之前，需要准备一些实验材料和试剂。

主要包括：1. 细胞或组织样品：可以是人类、动物或植物的细胞或组织样品。

2. 细胞破碎液：用于细胞破碎和RNA保护，常用的有三种类型：TRIzol、RNeasy Mini Kit和RNAiso Plus。

3. 反转录试剂盒：包括反转录酶、随机引物、dNTPs等。

4. 克隆载体：用于构建基因文库的载体，常用的有质粒载体和噬菌体载体。

5. 细菌培养基和抗生素：用于细菌的培养和筛选。

二、RNA提取RNA提取是构建CDNA基因文库的第一步，目的是从细胞或组织样品中提取总RNA。

常用的提取方法有酚/氯仿法、硅胶膜法和磁珠法等。

提取的RNA应具有较高的纯度和完整性，以保证后续的反转录和文库构建质量。

三、反转录反转录是将提取的RNA转录成cDNA的过程。

在这一步中，需要将RNA模板与反转录酶、随机引物、dNTPs等反转录试剂一起反应，合成cDNA。

反转录的条件包括温度、时间和反应体系等，需要根据试剂盒的说明进行操作。

四、合成cDNA合成cDNA是将反转录得到的第一链cDNA转录成双链cDNA的过程。

一般采用PCR扩增的方法，在反应中加入适量的引物和dNTPs，进行多轮扩增，最终得到足够量的双链cDNA。

合成cDNA的条件包括PCR扩增的循环数、温度和时间等。

五、构建文库构建基因文库是将合成的cDNA插入到克隆载体中的过程。

常用的构建方法有限制性内切酶法、T/A克隆法和引物扩增法等。

在构建文库的过程中，需要将双链cDNA与克隆载体进行连接，形成重组DNA。

连接后的重组DNA可以通过转化到适当的宿主细胞中，得到大量的重组质粒。

六、筛选构建完基因文库后，需要进行筛选以获得感兴趣的基因。

cDNA文库组标准流程一. Total RNA的提取 (2)二. mRNA的分离 (5)三．cDNA双链合成 (8)四．载体制备 (11)五. cDNA双链和载体的连接 (13)六．电转化流程 (14)七．快速鉴定、菌落PCR (16)八．pBlueScript cDNA库扩增 (18)一.Total RNA的提取1.试剂配制准备工作：1、研钵、5ml/10ml/ 25ml移液管、100ml/250ml量筒、250ml/100ml容量瓶、药匙、试剂瓶等玻璃制品均用锡纸包裹口部，置于烤箱内,180℃，烤6小时。

2、50ml/1.5ml离心管、枪头等塑料制品用0.1‰DEPC水浸泡过夜后，121℃20mins 高压灭菌。

3、电泳槽及电泳托、梳子用3%双氧水处理。

4、常用试剂及其配方：▲DEPC水：在1000ml去离子水中加入100ul DEPC, 静置过夜后高压灭菌。

▲0.78M柠檬酸纳：PH=4~5三水合柠檬酸纳22.94g加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。

▲10%肌氨酸钠：肌氨酸钠10g加DEPC水定容至100ml，室温放置备用。

▲变性裂解液：0.78M柠檬酸钠8.25ml10%肌氨酸钠12.375ml异硫氰酸胍118.05g加DEPC水定容至250ml，室温放置备用临用前加β-巯基乙醇使其终浓度为1%（v/v）▲2M 醋酸钠PH=4.5NaAc·3H2O 13.6g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用▲3M醋酸钠PH=5NaAc·3H2O 20.4g加DEPC水定容至50ml,高压灭菌，室温放置备用▲4M LiCL:LiCL 24.164g加DEPC水定容至100ml,高压灭菌，室温放置备用▲0.5M EDTA PH=8.0EDTA 18.61g用NaOH调PH值至8.0，定容到100ml，高压灭菌，室温放置备用▲10X MOPS (3-（N-吗啉代）丙磺酸):MOPS 41.86gNaAC·3H2O 4.10g0.5MEDTA（PH 8.0）20ml用NaOH调PH值 6.5 , DEPC水定容到1L，室温避光放置备用。