发酵工程实验五 一级种子的制备

第五章发酵工业的种子制备内容提要•种子制备原理和技术•影响种子质量的因素•种子质量的控制措施•工业微生物培养的类型一、种子扩大培养1、种子扩大培养的任务工业生产规模的增大需要种子就增多种子的扩大培养种子扩大培养的任务，不但要得到纯而壮的培养物，还要获得活力旺盛的、性能稳定、接种数量足够的、纯的培养物。

2、菌种扩大培养的目的为发酵罐的投料提供足够数量的代谢旺盛的种子。

因为发酵时间的长短和接种量的大小有关，接种量大，发酵时间则短。

将较多数量的成熟菌体接入发酵罐中，就有利于缩短发酵时间，提高发酵罐的利用率，并且也有利于减少染菌的机会。

对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢及生产的规模决定种子扩大培养的级数。

对于不同产品的发酵过程来说，必须根据菌种生长繁殖速度快慢来决定种子扩大培养级数。

抗生素生产中，放线菌的细胞生长繁殖速度较慢，常常用三级种子扩大培养，即将种子罐中之菌丝移植到较大的种子罐中扩大培养后，再移入发酵罐中，这种流程称为三级种子四级发酵一般50t发酵罐多采用三级发酵，有的甚至采用四级发酵，如链霉素生产。

有些酶制剂发酵生产也采用三级发酵。

而谷氨酸及其他氨基酸发酵所用的菌种是细菌，生长繁殖速方式很快，所以采用二级发酵。

一级种子二级发酵的流程如下：斜面菌种→一级种子摇床培养→二级种子罐培养→发酵罐二、种子制备原理与技术种子培养：指冷冻干燥管、沙土管中处于休眠状态的工业菌种，接入试管斜面活化后，再经过摇瓶及种子罐逐级扩大培养，而获得一定数量和质量的纯种的过程。

其中的纯培养物就称为种子。

不同的发酵产品和菌种，种子制备的方法与条件不同。

要根据目的菌种的生理特性，选择合适的培养条件来获得优良的种子。

1、优良种子应具备的条件①、菌种细胞的生长活力强，转移至发酵罐后能迅速生长，延迟期短；②、菌种生理状态稳定（如菌丝生长速率、种子培养液的特性等）；③、菌体浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求；④、无杂菌污染，保证纯种发酵；⑤、菌种适应性强，能保持稳定的生产能力。

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1. 基质配制。

根据发酵菌株的生长需求，选择合适的基质，如酵母提取物、肉汤等。

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1. 种子筛选。

挑选饱满、无病害、无杂质的种子。

发酵工业种子制备教案标题：发酵工业种子制备教案一、教学目标：1. 了解发酵工业中种子的重要性和作用。

2. 掌握发酵工业种子制备的基本步骤和技术要求。

3. 发展学生科学实验设计和实验操作能力。

二、教学准备：1. 实验室环境和设备：灭菌器、培养基和培养基配制器具、培养皿、移液管、恒温培养箱等。

2. 实验材料：发酵菌株、发酵种子、培养基成分等。

三、教学过程：1. 导入（5分钟）：向学生介绍发酵工业中种子制备的重要性，引发学生的兴趣和探究欲望。

2. 知识讲解（15分钟）：a. 介绍发酵工业种子的定义和作用，让学生了解其在发酵过程中的重要性。

b. 说明种子制备的基本步骤：准备培养基、接种发酵菌株、培养过程中适当控制温度、观察培养结果等。

c. 解释发酵种子的培养基要求，如pH值、碳源、氮源、无机盐等。

3. 实验操作（40分钟）：a. 学生分组，每组分配所需实验材料。

b. 学生按照教师指导，准备培养基，确认培养基是否符合要求。

c. 学生进行发酵菌株的接种操作，注意操作规范和无菌技术要求。

d. 将接种后的培养物放入恒温培养箱，控制适当的温度进行培养。

e. 监测培养物的生长情况，记录观察结果。

f. 学生进行结果分析，讨论实验中可能存在的误差以及改进方法。

4. 实验总结（10分钟）：a. 学生归纳总结种子制备的基本步骤和技术要求。

b. 学生讨论发酵工业中种子制备的应用意义和局限性。

c. 教师给予学生反馈和指导，鼓励他们提出问题和展示实验成果。

五、延伸拓展：根据学生实验结果，可以开展如下拓展活动：1. 探究不同培养基对发酵种子生长的影响。

2. 研究温度变化对发酵种子生长速率的影响。

3. 分析种子制备中可能出现的常见问题，并提出解决方案。

六、教学评估：1. 实验操作过程中学生的操作规范和无菌技术掌握情况。

2. 实验结果的准确性和可靠性。

3. 学生对于种子制备步骤和技术要求的理解程度。

七、教学反思：针对学生在实验过程中可能遇到的难点和疑惑进行及时引导和解答，同时加强对于实验操作规范和安全意识的培养。

本章内容：⏹种子制备原理与技术⏹影响种子质量的因素⏹种子质量的控制措施⏹种子制备的放大原理与技术概念：种子的制备，即菌种的扩大培养就是把保藏的菌种，即砂土管，冷冻干燥管中处于休眠状态的生产菌种接入试管斜面活化，再经过扁瓶或摇瓶和种子罐，逐级扩大培养后达到一定的数量和质量的纯种培养过程。

这些纯种的培养物称为种子。

种子扩培的目的❑接种量的需要❑菌种的驯化❑缩短发酵时间、保证生产水平优良种子应具备的条件/种子的要求：生长活力强，延迟期短；(接种后在发酵罐中能迅速生长)生理状态稳定；浓度及总量能满足大容量发酵罐接种量的要求； 无杂菌污染，保证纯种发酵；适应性强，生产能力稳定种子制备原理与技术：一.发酵级数的确定种子扩大的级数：制备种子需逐级扩大培养的次数级数愈少，愈利于简化工艺及控制，并可减少种子罐污染杂菌的机会，减少消毒及值班工作量，减少因种子罐生长异常而造成的发酵波动。

一般由菌丝体培养开始计算发酵级数，但有时，工厂从第一级种子罐开始计算发酵级数谷氨酸：三级发酵（谷氨酸棒杆菌）一级种子（摇瓶）→二级种子（小罐）→发酵青霉素：三级发酵一级种子（小罐）→二级种子（中罐）→发酵发酵级数确定的依据❑级数受发酵规模、菌体生长特性、接种量的影响❑级数大，难控制、易染菌、易变异，管理困难，一般2-4级。

❑在发酵产品的放大中，反应级数的确定是非常重要的一个方面发酵级数确定方法菌种的性质(如菌种传代后的稳定性)瓶中的孢子数，孢子发芽及菌丝繁殖速度发酵罐中种子培养液的最低接种量种子罐与发酵罐的容积比生产规模随工艺条件的改变作适当的调整二.种子质量的判断方法通常检测的培养液中参数pH是否在种子要求的范围之内糖、氨基氮、磷酸盐的含量菌丝形态、菌丝浓度和培养液外观有无杂菌污染其他参数，如接种前酶活、种子罐的溶氧和尾气等种子制备步骤：斜面培养基中活化；扁瓶固体培养基或摇瓶培养基中扩大培养，完成实验室种子制备一级种子罐，制备生产用种子；视情况确定扩大级数，完成生产车间种子制备；种子转种至发酵罐三.种子制备过程实验室种子制备阶段：琼脂斜面至固体培养基扩大培养（如茄子瓶斜面培养等或液体摇瓶培养生产车间种子制备阶段：种子罐扩大培养种子制备过程概览实验室阶段：不用种子罐，所用的设备为培养箱、摇床等实验室常见设备，在工厂这些培养过程一般都在菌种室完成，因此现象地将这些培养过程称为实验室阶段的种子培养。

发酵工程实验五一级种子的制备《发酵工程实验》实验五、一级种子的制备一、实验目的1、了解发酵工业菌种的制备过程及质量控制。

2、熟悉发酵实验的一级菌种制备。

二、实验原理菌种制备的主要手段是扩培，其出发点是尽可能培养出高活性的、能满足大规模发酵需要的纯种。

由于现代生产菌种的生产性能已非常高，因此，菌种在培养过程中自发突变往往以负向突变为主，加上平时操作中可能有污染，导致发酵菌种容易退化。

因此，菌种的管理主要有两点：分离纯化和扩大培养。

前者目的为分离出单细胞菌落，保证菌种的性能稳定。

后者目的是为发酵生产提供充足的高活性菌种，分斜面菌种、一级菌种和二级菌种。

在进行各级菌种的扩培时，菌种的质量要达到发酵要求。

比较简单的做法是用显微镜观察细胞的形态是否正常、测定种子培养基的pH 值是否正常及细胞生长繁殖活力等。

三、实验器材与试剂1、菌种实验二中筛选到的-淀粉酶产生菌(酵母)。

2、培养基（W/V）（1）斜面培养基（已制备）（2）摇瓶种子培养基：蔗糖20g/L，蛋白胨5.0g/L，磷酸氢二钠4.0g/L，硫酸镁0.5g/L，磷酸二氢钾1.0g/L，pH为5.0-5.5。

250ml 三角瓶中装培养基50ml，8层纱布封口，0.1MPa 灭菌20min（现用现配）。

四、实验步骤1、斜面接种挑取保藏菌种接种到斜面培养基上，28℃培养24h。

仔细观察斜面菌苔生长情况（菌苔的颜色、边缘等特征是否正常），有无感染杂菌。

2、镜检在无菌条件下，挑取斜面菌苔少许，在载玻片上制成涂片，在显微镜下检查菌苔形态特征，大小、均匀情况。

3、摇瓶培养挑取经镜检确定后的活化斜面菌苔3-5环，接入上述液体培养基中，28℃恒温摇床培养(180rpm)，培养12h。

观察摇瓶菌液外观稠度、静置沉降情况。

镜检菌液中菌体细胞的形态是否正常（大小均匀程度等）及测定培养液中pH。

五、注意事项1、出现污染征象的斜面培养活化菌苔坚决不能使用。

2、菌种的污染，势必导致发酵的失败，轻者产量降低，严重的不积累产物。